基于16S rDNA 分析湖北半夏內(nèi)生菌群結(jié)構(gòu)及代謝功能

王帆帆，唐 濤，郭 杰，段媛媛，郭曉亮，游景茂

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000）

半夏（Pinellia ternata）為天南星科多年生草本植物，以水玉、地文之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是中國著名的中藥材，具有鎮(zhèn)咳化痰、消腫排膿、燥濕降逆等多種功效，被廣泛應(yīng)用于定咳喘膠囊、通絡(luò)軟堅青和復(fù)方半夏片各類藥劑產(chǎn)品中［1，2］。目前半夏主產(chǎn)于湖北、重慶、甘肅、安徽、四川等地，湖北優(yōu)質(zhì)半夏種植面積約2 000 hm2，每667 m2收入超過2 萬元，已成為湖北省江漢平原重點(diǎn)脫貧項(xiàng)目和鄉(xiāng)村建設(shè)主打產(chǎn)業(yè)，其荊半夏因粉性足、顆粒均勻等優(yōu)勢，近年來已逐漸成為半夏種源核心產(chǎn)區(qū)，可占國內(nèi)種子來源的26%以上。2019 年7 月，潛半夏入圍湖北省“一縣一品”優(yōu)勢品種，成為省地標(biāo)產(chǎn)品。但人工種植的半夏病蟲害突發(fā)率較高，部分系統(tǒng)性病害由于缺乏研究，呈加重態(tài)勢，且人工種植半夏品種活性成分不足，因此需要采取科學(xué)途徑提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，以維持半夏產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［3］。

研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于植物中且種類繁多，在與寄主的長期進(jìn)化過程中，不僅對健康植株不造成實(shí)質(zhì)性危害，同時可以促進(jìn)其生長，提高植物抗逆性，防治病蟲害［4］。學(xué)者已經(jīng)從白術(shù)、中華補(bǔ)血草、椰棗樹等藥用植物中分離到Bacillus endophyticusAMR83、Staphylococcus和Streptomyces多 種有益內(nèi)生細(xì)菌［5-7］。有利于植物健康和生長的內(nèi)生細(xì)菌為植物促生細(xì)菌，可通過產(chǎn)生生長素、酶物質(zhì)及固氮途徑、解磷作用等途徑直接或間接促進(jìn)植物生長［8］。植物促生細(xì)菌是具有改善植物品質(zhì)、提高抗逆性和防治病蟲害等優(yōu)勢的天然資源菌。關(guān)于貴州、江蘇等地半夏內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析已有報道，但湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌多樣性的詳細(xì)研究尚未報道。

本研究通過高通量測序技術(shù)，研究了湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其代謝通路，進(jìn)一步揭示了藥用植物半夏內(nèi)生細(xì)菌的分布情況。不僅為湖北半夏與其內(nèi)生細(xì)菌之間相互關(guān)系的探索奠定基礎(chǔ)，還為提高藥用植物半夏的產(chǎn)量和質(zhì)量提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗(yàn)所選用的植物樣品采自湖北省天門市汪場鎮(zhèn)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所半夏基地，采集健康的、長勢良好的半夏植株，取其塊莖，無菌水沖洗干凈后，快速風(fēng)干，無菌條件下去除塊莖表皮，置于液氮中保存待用。

1.2 DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

對獲得的半夏塊莖樣品用Omega E.Z.N.A.?Soil DNA Kit 提取試劑盒提取其微生物組總DNA。使用上游引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA），下游引物為806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT），對16S rDNA V3～V4 保守區(qū)基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行熒光定量分析。

1.3 高通量測序分析

采用Illumina公司的TruSeqNano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫，MiSeq 測序儀進(jìn)行高通量測序，測序委托派森諾生物科技有限公司完成。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用QIIME 軟件，分別獲取樣品在門、綱、目、科、屬5 個分類水平上的組成和豐度分布表。使用GraPhlAn 工具［9］對樣品總體在各分類水平的組成構(gòu)建等級樹。使用PICRUSt 工具［10］進(jìn)行菌群代謝功能預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果質(zhì)量分析

湖北半夏樣品中提取的微生物組總DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后進(jìn)行產(chǎn)物回收純化，回收產(chǎn)物熒光定量后高通量測序，對原始雙端序列進(jìn)行質(zhì)量篩選，獲得樣品的有效序列共39 537 條，去除宿主序列64 條。內(nèi)生細(xì)菌序列長度分布在403～466 bp，長度為407 bp的序列最多，有33 868 條，其序列長度分布如圖1 所示。從序列長度的分布來看，與16S rDNA V3～V4 區(qū)序列長度吻合。

圖1 序列長度分布

2.2 細(xì)菌多樣性分析

使用R 軟件將OTU 豐度矩陣文件結(jié)果繪制成圖2。由圖2 可以直觀地看到，以97%的序列相似度作為OUT 劃分閾值，得到681 個OTUs，其中門、綱、目分類水平的OTU 數(shù)均為130，科的OTU 數(shù)為129，屬的OTU 數(shù)為121，種的OTU 數(shù)僅為41。稀疏曲線可以評判樣品的當(dāng)前測序深度是否足以反映該群落樣本所包含的微生物多樣性，如圖3 所示。圖3 樣品曲線趨于平緩，表明該測序結(jié)果已足夠反映半夏樣品所包含的絕大部分微生物，繼續(xù)增加測序深度已無法檢測到大量的尚未發(fā)現(xiàn)的新OTU。樣品的多樣性指數(shù)分析表明，chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)與操作分類單元數(shù)相同，均為130，說明測序結(jié)果足夠反映湖北半夏樣品菌群豐度，香濃指數(shù)為3.02，辛普森指數(shù)僅為0.715，說明該樣品菌群多樣性較高。

圖2 OTU 劃分和分類地位鑒定結(jié)果統(tǒng)計

圖3 OUT 數(shù)的稀疏曲線

2.3 細(xì)菌群落組成分析

使用R 軟件將所得數(shù)據(jù)繪制成柱狀圖，以直觀地看到樣品在同一水平的分類單元數(shù)，以顏色區(qū)分各分類單元，柱子越長，該分類單元在樣品中的相對豐度越高，如圖4 所示。半夏內(nèi)生細(xì)菌主要包括6 門10 綱23 目29 科45 屬，26 種。半夏的內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類于Proteobacteria 門，占分析總數(shù)的97.76%，其次是Actinobacteria門，僅占1.03%。從綱水平來看，該半夏植物的內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢菌綱主要是Alphaproteobacteria 和Gammaproteobacteria，所占比例分別是51.65%和46.11%。從目水平來看，該半夏內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類于Rickettsiales 和Pseudomonadales，所占比例分別為49.37%和30.70%。從科水平來看，該半夏內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類于Mitochondria，所占比例為49.37%；其次Pseudomonadaceae 和Burkholderiaceae，所占比例為21.49%和14.74%。與MEGAN 相比，GraPhlAn繪制的分類等級樹提供了一種從復(fù)雜的群落數(shù)據(jù)中，快速發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢微生物類群的方法（圖5）。分類等級樹展示了樣本總體中，從門到屬（從內(nèi)圈到外圈依次排列）所有分類單元（以節(jié)點(diǎn)表示）的等級關(guān)系，節(jié)點(diǎn)大小對應(yīng)于該分類單元的平均相對豐度，相對豐度前20 位的分類單元還將在圖中以字母標(biāo)識（從門到屬按照從外層到內(nèi)層依次排列），字母上的陰影顏色同對應(yīng)節(jié)點(diǎn)顏色一致。

圖4 各水平的群落分類學(xué)組成和分布

圖5 基于GraPhlAn的樣品總體分類等級樹

2.4 菌群代謝功能預(yù)測

PICRUSt 能將16S rRNA 基因序列在3 種功能譜數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行預(yù)測，即KEGG、COG 和Rfam。其中，KEGG 數(shù)據(jù)庫的核心為生物代謝通路分析數(shù)據(jù)庫（KEGG PATHWAY Database，http：//www.genome.jp/kegg/pathway.html），將代謝通路歸為6 大類，包括代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、細(xì)胞進(jìn)程（Cellular Processes）、生物體系統(tǒng)（Organismal Systems）和人類疾?。℉uman Diseases），每一類代謝通路又被進(jìn)一步劃分為多個等級。如圖6 所示，代謝功能類群中，能量代謝功能類群在半夏樣品中的相對豐度最高，其次是碳水化合物代謝功能和氨基酸代謝功能類群；遺傳信息處理功能類群中，復(fù)制和修復(fù)功能類群的豐度最高；環(huán)境信息處理功能類群中，膜運(yùn)輸功能類群的豐度最高；細(xì)胞進(jìn)程功能類群中，細(xì)胞運(yùn)動功能類群的豐度最高；生物系統(tǒng)功能類群中，內(nèi)分泌系統(tǒng)功能類群的豐度最高；人類疾病功能類群中，傳染性疾病功能類群的豐度最高。

圖6 PICRUSt預(yù)測的KEGG 第二等級分布

3 小結(jié)與討論

2018 年公布的《古代經(jīng)典名方目錄》中，半夏的藥方占首批經(jīng)典名方總數(shù)的17%，是重要的傳統(tǒng)大宗藥材，廣泛分布于中國長江流域以及東北、華北等地區(qū)［11］。張潔等［12］通過對貴州半夏內(nèi)生細(xì)菌的研究，表明其內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w屬于微桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、類芽孢桿菌屬、芽孢桿菌屬。張盼盼［13］通過對江蘇邳半夏內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析，表明其內(nèi)生細(xì)菌主要分布于Actinobacteria、Proteobacteria、Tenericutes、Firmicutes、Bacteroidetes、Cyanobacteria 6個門。劉建玲等［14］對陜西楊凌半夏內(nèi)生菌的分離鑒定結(jié)果表明，其優(yōu)勢種群為棒孢霉屬、青霉屬和鐮孢霉屬。本研究通過對湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌多樣性分析表明，該半夏樣品的優(yōu)勢菌群主要?dú)w于6 門、10綱、23 目、29 科、45 屬、26 種。在門水平上豐度最高的是Proteobacteria，在科水平上豐度較高的是Mitochondria、Pseudomonadaceae、Burkholderiaceae。由此可知，不同地區(qū)的半夏內(nèi)生細(xì)菌多樣性各有差異，這可能與地方性土壤、氣候、溫度等環(huán)境條件和栽培方式有關(guān)。通過本研究可初步明確湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。

目前關(guān)于藥用植物內(nèi)生細(xì)菌代謝功能與寄主健康生長等相關(guān)的研究較為熱門。內(nèi)生細(xì)菌可通過產(chǎn)生植物生長素、酶等功能直接促進(jìn)植物生長，同時可通過產(chǎn)生細(xì)胞壁裂解酶等物質(zhì)減少病菌的侵入，間接促進(jìn)植物生長。周佳宇等［15］從茅蒼術(shù)中分離到可產(chǎn)生IAA的內(nèi)生細(xì)菌，Qin 等［16］從中華補(bǔ)血草中分離到產(chǎn)ACC 脫氨酶的內(nèi)生細(xì)菌，均可促進(jìn)植物的生長。本研究對湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌的基因功能和代謝途徑進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明代謝功能類群中的能量代謝功能類群在半夏樣品中的相對豐度最高，其次是碳水化合物代謝功能和氨基酸代謝功能類群，為今后研究半夏內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物多樣性和生防菌的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

半夏有效成分之一是生物堿類物質(zhì)，目前已從半夏中分離出麻黃堿、葫蘆巴堿、肌苷等多種生物堿類物質(zhì)。部分內(nèi)生細(xì)菌在與寄主長期的進(jìn)化過程中彼此相互影響，具有相似的次生代謝產(chǎn)物，提高寄主活性成分。蘇昊［17］從半夏體內(nèi)得到多株產(chǎn)生物堿類的內(nèi)生菌。劉建玲等［18］研究表明半夏內(nèi)生細(xì)菌不僅誘導(dǎo)其生物堿的合成，同時可產(chǎn)生某些相同的生物堿。故本研究的下一步工作將對湖北半夏內(nèi)生細(xì)菌代謝產(chǎn)物多樣性及功能進(jìn)行研究，明確其作用機(jī)制，為提高半夏質(zhì)量及產(chǎn)量提供有力支持。