一株產(chǎn)吲哚乙酸巴基斯坦賴氨酸芽胞桿菌的快速篩選與鑒定

閔 勇，劉曉艷，陳 凌，朱 鐳，邱一敏，周榮華

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢 430064）

自1978 美國奧本大學(xué)的J.W.Kloepper 首次提出植物根際促生細菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）的概念以來，PGPR 研究始終是農(nóng)業(yè)微生物學(xué)和植物病理學(xué)領(lǐng)域的熱點。PGPR 可以通過多種機制來促進作物的生長，具體的作用機制主要有以下幾個方面：一、直接分泌植物生長激素來促進植物生長；二、分泌有機酸和水解酶類增加植物對營養(yǎng)成分的吸收；三、抑制植物的病害；四、誘導(dǎo)作物系統(tǒng)抗性［1］。在大多數(shù)研究中，一種PGPR 通常是通過多種方式協(xié)同作用來促進植物的生長。

芽胞桿菌由于其產(chǎn)生芽胞，能夠在不同的生境中生存，是研究廣泛、深入的PGPR 類群?？莶菅堪麠U菌（Bacillus subtilis）普遍存在于多種植物的根際土壤中，通過產(chǎn)生伊枯草菌素A（Iturin A）、豐原素（Fengycin）和表面活性素（Surfactin）等脂肽類抗生素來抑制土傳真菌性病害，同時還能產(chǎn)生IAA，具有生物固氮能力［2］；某些多粘類芽胞桿菌（Paenibacillus polymyxa）具有生物固氮能力，還產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）、細胞分裂素等植物激素；同時，多粘類芽胞桿菌還產(chǎn)生殺鐮孢菌素（Fusaricidin）、多粘菌素（Polymyxin）等抗生素類物質(zhì)來抑制植物細菌和真菌性病害［3］。部分巨大芽胞桿菌（Bacillus megateri-um）具有溶磷、解磷能力，能促進作物對磷元素的吸收；部分地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis）具有解鉀的能力，促進作物對鉀元素的吸收利用。PGPR類芽胞桿菌通過協(xié)同作用共同促進植物的生長。

長期以來，化肥農(nóng)藥的使用對中國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起到了至關(guān)重要的作用，但長期不合理的使用對生態(tài)環(huán)境、糧食安全和人類健康都構(gòu)成了嚴重威脅，迫切需要轉(zhuǎn)變生產(chǎn)方式，利用環(huán)境友好的生物有機肥產(chǎn)品來部分替代化肥，使用生物農(nóng)藥部分替代化學(xué)農(nóng)藥。吲哚乙酸（IAA）作為一種重要的植物激素，能夠促進植物的生長，利用IAA 產(chǎn)生菌生產(chǎn)生物有機肥具有重要的生產(chǎn)意義［4］。

本研究對實驗室保藏的芽胞桿菌進行產(chǎn)IAA 能力篩選，以期篩選獲得產(chǎn)IAA 能力較強的芽胞桿菌菌株，為下一步制備功能生物有機肥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗菌株：湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心從土壤中分離并保藏的1 920 株芽孢桿菌。

化學(xué)試劑：色氨酸（L-tryptohane，純度＞99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)），吲哚乙酸標準品（Indole-3-aceticacid，純度＞99.9%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產(chǎn)）。

Salkowski 顯色劑：配置濃度為0.5 mol/L FeCl3溶液，取1 mL FeCl3溶液到50 mL 35% HClO4中搖勻，現(xiàn)配現(xiàn)用，操作時避光。

種子LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 5 g，溶于1 000 mL去離子水中（pH=7.0）；篩選培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入終濃度為3 mmol/L的色氨酸。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌活化 在96孔板中每孔各加入0.5 mL LB 培養(yǎng)基，滅菌后接種芽孢桿菌菌株，將96 孔板放置在粘板上于30 ℃，250 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 產(chǎn)IAA 芽孢桿菌的初篩 在滅菌的96 孔板中每孔加入0.5 mL 初篩培養(yǎng)基，吸取10 μL 活化好的芽孢桿菌菌液轉(zhuǎn)移其中，于30 ℃、250 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)48 h。吸取200 μL 菌懸液于96 孔無菌細胞培養(yǎng)板孔中，于4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，吸取100 μL 上清液于96 孔細胞培養(yǎng)板中，加入等體積Salkowski 顯色劑。以初篩培養(yǎng)基作為陰性對照，以20 mg/L IAA 標準液作為陽性對照。將96 孔板置于室溫、避光環(huán)境下反應(yīng)30 min，細胞培養(yǎng)板上孔的顏色變紅則表示該菌株具有產(chǎn)生IAA的能力。

1.2.3 產(chǎn)IAA 菌株的定量復(fù)篩 將初篩中顏色反應(yīng)明顯的菌株進一步定量IAA的產(chǎn)量。標準曲線采用IAA 標準品制作，配置的IAA 標準曲線濃度依次為10，20，30，40，50，60，80，100 mg/L，分別吸取IAA 標準溶液100 μL，等體積加入Salkowski 顯色劑，置于室溫、避光環(huán)境下反應(yīng)30 min，取出后立即用酶標儀測定A535nm，以加入了顯色劑的培養(yǎng)基調(diào)零，重復(fù)3次，獲得數(shù)據(jù)制作標準曲線。取1 mL 芽孢桿菌的菌懸液以4 000 r/min 離心10 min，取上清100 μL，等體積加入Salkowski 顯色劑，置于室溫、避光環(huán)境下反應(yīng)30 min，測定其A535nm，根據(jù)標準曲線，計算單位體積發(fā)酵液中IAA的含量。

1.2.4 菌株的鑒定

1）形態(tài)觀察。菌株接種于LB 固體培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)、色澤，顯微鏡觀察細胞形狀等。

2）細菌16S rDNA 序列測定。提取細菌基因組DNA；16S rDNA 基因序列的PCR 擴增，引物為27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、1492R 5′AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′；PCR 產(chǎn)物送測序；測序結(jié)果在EzBioCloud 網(wǎng)站上進行比對，從網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中獲取與菌株16S rDNA 同源的基因序列數(shù)據(jù)，利用MEGAX 軟件做系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)IAA 芽孢桿菌的初篩

通過96 孔板微培養(yǎng)，對保藏的1 920 株芽孢桿菌進行了活化，通過Salkowski 比色法對1 920 株芽孢桿菌進行了初篩，再通過測量吸光度初步選取12株具有明顯產(chǎn)IAA 能力的芽胞桿菌菌株進入后續(xù)的定量復(fù)篩。

表1 產(chǎn)IAA 芽孢桿菌初篩結(jié)果

2.2 IAA 標準曲線的制作

將系列IAA 標準溶液（10，20，30，40，50，60，80，100 mg/L）與Salkowski 顯色劑反應(yīng)，測得不同IAA 濃度下對應(yīng)的吸光度A535，如表2。

表2 不同IAA 濃度下樣品的吸光度

以IAA 標準溶液濃度為橫坐標，縱坐標為對應(yīng)濃度在535 nm的吸光值，繪制散點圖并添加線性趨勢線，得到IAA 標準曲線見圖1。由圖1 可知，線性回歸方程y=0.020 1x+0.117 7，R2=0.995 9，擬合優(yōu)度較好。故可根據(jù)此方程計算發(fā)酵液中IAA的含量。

圖1 IAA 標準曲線

2.3 產(chǎn)IAA 芽孢桿菌的定量復(fù)篩

根據(jù)標準曲線，對初篩的12 株芽孢桿菌進行了產(chǎn)IAA 能力的復(fù)篩，結(jié)果見表3。由表3 可知，2750號菌株的產(chǎn)IAA 能力達到（118.23±5.55）mg/L，明顯優(yōu)于其他11 株芽胞桿菌。

表3 產(chǎn)IAA 芽孢桿菌復(fù)篩結(jié)果

2.4 菌株分子鑒定

將2750 號芽胞桿菌菌株的16S rDNA 基因測序結(jié)果在EzBioCloud 網(wǎng)站上進行序列比對，從網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中選取與菌株16S rDNA 同源的基因序列數(shù)據(jù)，然后用MEGAX 軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，2750 號芽胞桿菌與巴基斯坦賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus pakistanensis）位于同一分支，同源性100%。

圖2 2750 號芽胞桿菌系統(tǒng)進化樹

3 小結(jié)與討論

隨著人們生活水平的提高，對農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和生態(tài)環(huán)境保護的關(guān)注度也在持續(xù)提高，化肥已不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的需要。為實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，開發(fā)新型高效環(huán)保肥料勢在必行。同時，農(nóng)業(yè)污染已經(jīng)超過了工業(yè)和城市生活污染，成為中國最大的面源污染源。積極探索農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用的方式，已成為了中國農(nóng)業(yè)研究的熱點。在此背景下，生物有機肥以其獨特的優(yōu)勢為農(nóng)業(yè)廢棄物和作物生長搭建起一座橋梁，開辟出一條“農(nóng)業(yè)廢棄物—生物有機肥—作物”循環(huán)模式的可持續(xù)發(fā)展道路［5］。與化肥相比，生物有機肥具有提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)、增強作物抗逆性、提高化肥利用率和改善土壤微生態(tài)環(huán)境的作用。生物有機肥要發(fā)揮的這些功能，就要添加具有特定功能的微生物菌種。PGPR類芽胞桿菌具有促進作物生長的功效，是生物有機肥產(chǎn)品開發(fā)中重點關(guān)注的一類功能菌株。

由于IAA的類似物與Salkowski 顯色劑也能產(chǎn)生顏色反應(yīng)，采用高效液相色譜法測量實際的IAA的產(chǎn)量應(yīng)該比比色法要低。在產(chǎn)品開發(fā)過程中將采用更為準確的高效液相色譜法對該菌株進行深入評價。

本研究未對巴基斯坦賴氨酸芽孢桿菌產(chǎn)IAA 能力進行培養(yǎng)基優(yōu)化，培養(yǎng)基優(yōu)化后的菌株產(chǎn)IAA 能力尚未知。在后續(xù)的研究中將通過培養(yǎng)基優(yōu)化進一步提高該菌株的產(chǎn)IAA 能力，同時進行盆栽和田間試驗評價其作用。