• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    廣西北部灣局部海域海洋沉積物細菌多樣性及生物活性評估*

    2022-01-07 09:16:08楊少娟陳雪梅安德鳳蔡漢欽姜明國
    廣西科學 2021年5期
    關鍵詞:放線菌測序桿菌

    楊少娟,陳雪梅,沈 銳,安德鳳,蔡漢欽,姜明國,姜 怡**

    (1.云南大學生命科學學院,云南昆明 650091;2.廣西民族大學海洋與生物技術學院,廣西南寧 530008)

    0 引言

    新發(fā)傳染病(Emerging Infectious Diseases,EIDs)和多重耐藥性病原菌(Multidrug-resistant pathogens)對人類健康造成嚴重威脅[1,2]。然而,近年來由于陸生微生物的新型抗生素逐漸減少,且分離重復性逐漸升高[3],從新的、未開發(fā)的、極端的環(huán)境中分離新菌株成為開發(fā)新型天然產(chǎn)物的有效來源[4-6]。在海平面以下,壓力隨深度的增加而增加,溫度、氧氣、光照強度隨深度的增加而減少。因高壓、低溫、缺乏光照、鹽度和氧氣濃度可變,海洋成為一個獨特的極端環(huán)境[7]。為適應極端環(huán)境,海洋生物已進化出獨特的生理、生化功能[8,9]。獨特的海洋環(huán)境,使海洋微生物具備與陸生微生物不同的特征,可能產(chǎn)生新的生物活性成分和新型抗生素[10]。目前有關海洋微生物的研究表明:海洋微生物,特別是海洋放線菌能產(chǎn)生新型代謝產(chǎn)物,且部分代謝產(chǎn)物具有新的生物活性,可用于新藥的開發(fā)[11,12]。

    地處熱帶和亞熱帶的廣西北部灣海域,蘊含著豐富的海洋細菌資源[13]。但目前對廣西北部灣海域海洋微生物的研究主要集中于北部灣灘涂的紅樹林保護區(qū),關于該海域海洋沉積物細菌多樣性及生物活性潛力的研究鮮見報道。因此,本研究利用高通量測序技術結合純培養(yǎng)分離技術,對廣西北部灣局部海域海洋沉積物的細菌多樣性進行研究,同時對純培養(yǎng)菌株的生物活性潛力進行評估,為該海域海洋細菌資源的開發(fā)和利用提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器

    溶菌酶、蛋白酶 K、Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、Marker購自昆明云科生物技術有限公司,其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。由昆明擎科生物科技有限公司合成PCR所用引物。PCR 擴增儀,Biometra公司;電泳儀,Bio-Rad公司;凝膠成像分析系統(tǒng),Gene Company Limited公司。

    1.2 樣品采集

    2020年11月,用抓斗取樣器從廣西北部灣海域采集海洋沉積物。采樣的間隔距離為50 m,停船后在船頭用抓斗取樣5-10次,5-10個點混為一個樣品(共4份),并將樣品全部裝入無菌密封袋中,立即用冰盒運輸至實驗室,4.0℃冰箱保存。樣品信息如表1所示。

    表1 廣西北部灣海洋沉積物樣品采集信息

    1.3 高通量測序與分析

    1.3.1 高通量測序樣品處理

    所采集的4份樣品為混合樣品,為確保結果的準確性,每份樣品做3個重復。

    1.3.2 PCR擴增與高通量測序

    利用試劑盒提取海洋沉積物樣品總DNA。根據(jù)編碼細菌核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)設計引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),對樣品總DNA進行PCR擴增。30.0 μL PCR擴增體系:Buffer 15.0 μL、 dNTPs 6.0 μL、338F 0.9 μL、806F 0.9 μL、KOD FX Neo酶 0.6 μL、基因組DNA 50.0 ng,加ddH2O補至 30.0 μL。PCR擴增程序:98℃ 2 min;98℃ 0.5 min,50℃ 0.5 min,72℃ 1.0 min,30個循環(huán);72℃ 5.0 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化、定量和均一化后形成測序文庫,質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeq 2500進行測序。

    1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

    高通量測序獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)過預處理后,用Usearch軟件[14]對在97.0%相似度水平上的序列進行聚類,獲得操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTUs)。對OTUs進行物種注釋,在界、門、綱、目、科、屬、種水平上分析各樣品的細菌群落組成及組間差異。采用α多樣性分析單個樣品的物種豐度及物種多樣性,其中用Chao1和Ace指數(shù)衡量物種豐度,其值與物種豐度成正比;用Shannon和Simpson指數(shù)衡量物種多樣性,其值與物種多樣性成正比。采用β多樣性分析不同樣品間細菌群落組成的相似性及差異。

    1.4 純培養(yǎng)細菌的分離與鑒定

    1.4.1 培養(yǎng)基

    采用6種分離培養(yǎng)基:腐殖酸(HV)[15]、YIM 91[16]、YIM 171[17]、M3[18]、海藻糖-天冬酰胺[19]、幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)培養(yǎng)基配方如下:幾丁質(zhì) 2.0 g/L,K2HPO40.7 g/L,KH2PO40.3 g/L,微量鹽溶液(FeSO4·7H2O 0.1 g,MnCl2·4H2O 0.1 g,ZnSO4·7H2O 0.1 g,溶于100.0 mL水) 1.0 mL,海鹽 25.0 g/L,瓊脂 10.0 g/L,pH值為7.2。

    上述6個培養(yǎng)基中添加組合抑制劑(25.0 mg/L萘啶酸+50.0 mg/L重鉻酸鉀+100.0 mg/L制霉菌素)抑制生長較快的細菌和真菌。

    純化培養(yǎng)基YIM 38 (g/L):酵母提取物 4.0,無水葡萄糖 4.0,麥芽提取物 2.5,復合維生素 10.0 mg,瓊脂 12.0,pH值為7.2。

    發(fā)酵培養(yǎng)基YIM 61(g/L):大豆粉20.0,蛋白胨 2.0,葡萄糖 20.0,可溶性淀粉 5.0,酵母膏2.0,NaCl 4.0,K2HPO40.5,MgSO4·7 H2O 0.5,CaCO32.0,pH值為7.2。

    LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨 10.0,酵母提取物 5.0,NaCl 10.0,pH值為7.2。

    PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯 200.0,葡萄糖 20.0,pH值為7.2。

    1.4.2 樣品預處理與菌株分離

    4份灰色砂質(zhì)沉積物樣品分別混合均勻后置于無菌培養(yǎng)皿中,28℃自然干燥7 d。研磨后稱取2.0 g樣品,置于80℃烘箱中干熱處理1.0 h;然后加到18.0 mL無菌0.1% Na4P2O7溶液中,用搖床180.0 r/min震蕩1.0 h;最后用超聲波清洗器處理40.0 s得到樣品懸浮液,并用0.1% Na4P2O7溶液按10-2,10-3比例稀釋。

    純培養(yǎng)采用稀釋涂布法,取200.0 μL充分混勻后的10-2,10-3樣品稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基上,28℃倒置培養(yǎng)30 d。培養(yǎng)期間挑取菌落形態(tài)不一樣的單菌落接種至YIM 38斜面,28℃培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結束后根據(jù)菌株形態(tài)特征去除重復菌株及污染菌株,對剩余菌株進行編號,然后用YIM 38培養(yǎng)基對編號菌株進行擴大培養(yǎng)及純化,用20%甘油管于-20℃冰箱內(nèi)保存。

    1.4.3 菌株鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

    純化后的菌株用酶法提取DNA[20]。采用細菌通用引物PA (5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和PB (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進行16S rRNA基因擴增。50 μL PCR擴增體系: Buffer 5.0 μL、 dNTPs 4.0 μL、PA 1.0 μL、PB 1.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.3 μL、ddH2O 37.7 μL、模板 DNA 1 μL。PCR擴增程序:94℃ 4 min;94℃ 1.0 min,56℃ 1 min,72℃ 2.0 min,30個循環(huán);72℃ 10.0 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,將驗證結果為陽性的PCR產(chǎn)物送至昆明擎科生物科技有限公司進行測序。使用EZ Biocloud數(shù)據(jù)庫(https://www.ezbiocloud.net/)將測序得到的16S rRNA基因序列進行比對,確定菌株與已發(fā)表菌株的相似性。采用MAGE 7.0[21]軟件以鄰接法(Neighbour-Joining)[22]構建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株系統(tǒng)發(fā)育地位。

    1.5 抗菌活性篩選

    1.5.1 指示菌

    本研究選用9種臨床和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常見的病原菌作為指示菌進行抗菌活性實驗。革蘭氏陽性菌:金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusCGMCC 1.2386)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCGMCC 1.1849)。革蘭氏陰性菌:大腸桿菌(EscherichiacoliCGMCC 1.2385)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。真菌:黑曲霉(Aspergillusniger)、白色念珠菌(CandidaalbicansCGMCC 2.2086)、小麥赤霉病菌(Gibberellasaubinetii)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、馬鈴薯干腐病菌(Fusariumcoeruleum)。其中有保藏號的指示菌由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供,無保藏號的指示菌由云南省微生物研究所提供。

    1.5.2 抗菌活性檢測

    待測菌株和指示菌用YIM 38固體培養(yǎng)基進行活化。活化后的待測菌株接種到YIM 61液體培養(yǎng)基,28℃少量(6.0 mL)發(fā)酵 7 d,取發(fā)酵液進行活性測試,以空白YIM 61培養(yǎng)基作為陰性對照?;罨蟮母锾m氏陽性、革蘭氏陰性指示菌接種到LB培養(yǎng)基,活化后的真菌指示菌接種到PDA培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)3 d。

    抗菌活性檢測采用雙瓊脂擴散法。培養(yǎng)基下層為水瓊脂,瓊脂凝固后加入含有指示菌的YIM 38培養(yǎng)基,并將自制的打孔器置于培養(yǎng)基中。待培養(yǎng)基凝固后取出打孔器,每個孔中加入100.0 μL待測菌株發(fā)酵液,28℃培養(yǎng)24 h,觀察是否產(chǎn)生抑菌圈并記錄抑菌圈的大小。

    1.6 功能基因篩選

    1.6.1 功能基因引物

    結合相關文獻和本實驗室前期研究,設計并合成7種功能基因的簡并引物,引物信息見表2。

    1.6.2 功能基因檢測

    根據(jù)設計的引物,用PCR擴增技術篩選功能基因。50 μL PCR擴增體系: Buffer 5.0 μL, dNTPs 4.0 μL,正向、反向引物各 1.0 μL,Taq DNA 聚合酶 0.3 μL,ddH2O 37.7 μL,模板 DNA 1 μL。PCR擴增程序如下:94℃ 4.0 min;94℃ 1.0 min,退火(溫度見表2)1 min,72℃ 2.0 min,30個循環(huán);72℃ 10.0 min。

    表2 篩選功能基因的引物信息

    用1.0%瓊脂糖凝膠對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測,并將驗證后結果為陽性的PCR產(chǎn)物送至昆明擎科生物科技有限公司進行測序。

    2 結果與分析

    2.1 高通量測序細菌多樣性分析

    2.1.1 細菌群落組成

    海洋沉積物測序樣品在97.0%相似度水平上進行聚類,共獲得1 407個OTUs。就單份樣品而言,OTUs在組內(nèi)存在較大差異(圖1),表明組內(nèi)樣品間細菌群落組成不同,可能是由于測序樣品是混合樣,未混合均勻造成的。

    圖1 高通量測序樣品OTUs數(shù)目

    對獲得的OTUs進行物種注釋,門分類水平上部分物種的分布及豐度見圖2。結果顯示,在門水平上,所有樣品中微生物的優(yōu)勢類別相同,均包括變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和綠屈擾菌門(Chloroflexi),其中變形菌門的豐度最高。另外,梭桿菌門(Fusobacteria)只在B樣品(B1、B2、B3)中檢測出且有較高的豐度,在其他3個樣品中均沒有檢測出,表明樣品的特異性對梭桿菌門的菌株具有選擇性。在種分類水平上,注釋的OTUs大部分為免培養(yǎng)菌株,表明樣品還具有巨大的可培養(yǎng)細菌的潛力。

    圖2 門分類水平上高通量測序樣品的物種注釋相對豐度

    2.1.2α多樣性分析

    海洋沉積物樣品α多樣性指數(shù)如表3所示。樣品Ace指數(shù)為1 263.782 7-1 375.893 8,Chao1指數(shù)為1 278.069 0-1 381.254 2,Simpson指數(shù)為0.880 7-0.988 0,Shannon指數(shù)為5.828 7-8.221 0。A3樣品4個指數(shù)均較高,表明該樣品α多樣性最高;B1樣品4個指數(shù)均最低,表明該樣品α多樣性最低。

    表3 高通量測序樣品Alpha多樣性指數(shù)

    2.1.3β多樣性分析

    β多樣性分析樣品間物種組成相似性的結果如圖3所示。B樣品與其余3種樣品聚類關系最遠,樣品間細菌的組成差異最大;B樣品和D樣品的3個重復均聚類在一起,體現(xiàn)出較近的親緣關系,說明同一樣品內(nèi)微生物群落的組成及分布較均勻。但是A樣品和C樣品的3個重復沒有完全聚類到一起,存在一定的交叉性,即A2和C2樣品表現(xiàn)出較強的聚類關系,表明這兩個樣品中微生物的組成更為相似。A樣品和C樣品3個重復樣品沒有完全聚類的原因可能是:(1)A樣品和C樣品的3個重復組沒有充分混合均勻;(2)兩個采樣地之間物質(zhì)和能量的流動性較強,所形成的環(huán)境相似,所以樣品間的微生物組成也比較相似。

    圖3 基于bray curtis算法構建的UPGMA聚類樹

    2.2 純培養(yǎng)多樣性分析

    2.2.1 細菌多樣性

    采用6種分離培養(yǎng)基對廣西北部灣局部海域采集的4份海洋沉積物樣品進行分離,共分離出680株菌。根據(jù)菌株形態(tài)特征去重復后,對278株菌進行16S rRNA基因測序。經(jīng)EZ Biocloud數(shù)據(jù)庫比對,278株菌分布于3個門:放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、變性菌門(Proteobacteria),5個綱:放線菌綱(Actinomycetia)、桿菌綱(Bacilli)、α-變性桿菌綱(Alpha-proteobacteria)、β-變性桿菌綱(Beta-proteobacteria)、γ-變性桿菌綱 (Gamma-proteobacteria),16個目: 鏈霉菌目 (Streptomycetale-s)、微球菌目(Micrococcales)、分枝桿菌目(Mycobacteriales)、假諾卡氏菌目(Pseudonocardiales)、丙酸桿菌目(Propionibacteriales)、動孢囊菌目(Kineosporiales)、鏈孢菌目(Streptosporangiales)、微桿菌目(Microbacteriales)、短桿菌目(Brevibacteriales)、嗜皮菌目(Dermatophilales)、纖維單孢菌目(Cellulomonadales)、芽孢桿菌目(Bacillales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、丙桿菌目(Caulobacterales)、伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)、假單胞菌目(Pseudomonadales),24個科:鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、類諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、丙酸桿菌科(Propionibacteriaceae)、類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)、動孢囊菌科(Kineosporiaceae)、擬諾卡氏菌科(Nocardiopsaceae)、微桿菌科(Microbacteriaceae)、短桿菌科(Brevibacteriaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、原小單孢菌科(Promicromonosporaceae)、微小桿菌科(Exiguobacteriumf)、游動球菌科(Planococcaceae)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)、Aurantimonadaceae、丙桿菌科(Caulobacteraceae)、草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae),31個屬:鏈霉菌屬(Streptomyces)、微球菌屬(Micrococcus)、考克氏菌屬(Kocuria)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、戈登氏菌屬(Gordonia)、紅球菌屬(Rhodococcus)、迪茨氏菌屬(Dietzia)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、Brevilactibacter、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、Thalassiella、擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、微桿菌屬(Microbacterium)、農(nóng)球菌屬(Agrococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、巴里恩托斯單孢菌屬(Barrientosiimonas)、原小單孢菌屬(Promicromonospora)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、游動球菌屬(Planococcus)、金黃色微菌屬(Chryseomicrobium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、橙色單孢菌屬(Aurantimonas)、Aureimonas、短波單孢菌屬(Brevundimonas)、馬賽菌屬(Massilia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)。不同屬水平上的菌選取一株菌為代表菌與該屬的典型菌種用鄰接法(Neighbour-Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖4所示。依據(jù)16S rRNA序列相似性小于98.65%用于界定物種界限[31],序列比對結果顯示,YIM 150853與NocardioidesglacieisoliHLT3-15T (JQ673418)的相似性最高,但也只有98.23%,表明YIM 150853為1個潛在新分類單元,但具體的分類地位需通過多相分類法[32]確定。

    圖4 基于16S rRNA 基因序列構建廣西北部灣海域海洋沉積物部分細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

    2.2.2 培養(yǎng)基分離效果

    通過6種培養(yǎng)基從4份海洋沉積物樣品中分離鑒定出278株菌(31個屬65個種),每種培養(yǎng)基均分離出一定數(shù)量的細菌。從種水平上來說,HV培養(yǎng)基分離出19種菌,YIM 91培養(yǎng)基和海藻糖-天冬酰胺培養(yǎng)基各分離出15種菌,YIM 171培養(yǎng)基和幾丁質(zhì)培養(yǎng)基各分離出7種菌,而M3培養(yǎng)基僅分離出3種菌。從屬水平上來說,HV培養(yǎng)基分離出14個屬,YIM 91培養(yǎng)基和海藻糖-天冬酰胺培養(yǎng)基各分離出11個屬,YIM 171培養(yǎng)基分離出6個屬,幾丁質(zhì)培養(yǎng)基和M3培養(yǎng)基各分離出3個屬(圖5)。上述結果表明,HV作為分離培養(yǎng)基獲得的菌株數(shù)量最多,種屬多樣性最豐富;其次是YIM 91培養(yǎng)基和海藻糖-天冬酰胺培養(yǎng)基,但YIM 91培養(yǎng)基容易生長真菌,不利于細菌的分離。另外,幾丁質(zhì)培養(yǎng)基雖然分離出4個屬的7種菌,但這些菌株僅從B號樣品中分離得到,表明幾丁質(zhì)培養(yǎng)基有較強的分離特異性,大部分菌株不能利用幾丁質(zhì)作為碳源,作為分離培養(yǎng)基時普適性較差。

    圖5 不同培養(yǎng)基分離得到的細菌屬

    2.3 抗菌活性及功能基因篩選

    2.3.1 抗菌活性

    采用雙層瓊脂擴散法篩選278株細菌的抗菌活性,結果表明,有212株(76.25%)細菌具有抗1種及1種以上指示菌的活性,另外有168株(60.43%)、159株(57.19%)、158株(56.83%)、151株(54.31%)、139株(50.00%)、131株(47.12%)、131株(47.12%)、22株(7.91%)、5株(1.80%)分別對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、馬鈴薯干腐病菌、白色念珠菌、黑曲霉、小麥赤霉病菌、銅綠假單胞菌、番茄灰霉病菌有抑制作用。以上說明,廣西北部灣局部海域海洋沉積物純培養(yǎng)細菌具有開發(fā)抗生素藥物的巨大潛力。

    本實驗中,鏈霉菌屬的菌株表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性,且抑菌活性更強。鏈霉菌YIM 150601對除銅綠假單胞菌、番茄灰霉病菌以外的7種指示菌均有抑菌活性,其中對白色念珠菌的抑菌活性最強,抑菌圈直徑達16 mm;鏈霉菌YIM 150634對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、馬鈴薯干腐病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌7種病原菌均有抗菌活性,其中對黑曲霉、馬鈴薯干腐病菌、小麥赤霉病菌、番茄灰霉病菌的抑菌活性最強,抑菌圈直徑均達15 mm以上(表4)。

    表4 純培養(yǎng)菌株的抗菌活性

    2.3.2 功能基因

    用PCR擴增的方法對可培養(yǎng)菌株的基因組進行功能基因篩選,去重復后的實驗結果如表5所示。功能基因篩選結果表明:36株菌(12.90%)至少含有1類功能基因,11株菌(3.94%)含有2類功能基因。二萜類功能基因的陽性率最高,達7.89%,其次依次為雷納霉素(4.30%)、鹽霉素(3.94%)、環(huán)縮肽類(1.79%)、PKS-Ⅱ(1.08%)、路鄧素(0.36%),但未能檢測到含戊二酰亞胺類功能基因的菌株。所篩選到的20株陽性菌株中,15株為放線菌,表明與非放線菌相比,放線菌含有更為豐富的生物合成基因簇,其合成新型天然產(chǎn)物的潛力更大,開發(fā)應用價值更大。

    表5 基因組中含有功能基因的陽性菌株

    3 討論

    本研究通過高通量測序技術對廣西北部灣局部海域海洋沉積物4份混合樣進行測序,結果顯示3個平行樣品的測序結果均存在一定差異,可能是樣品混合不均勻所導致。高通量測序旨在客觀、全面地揭示環(huán)境樣品中細菌多樣性和群落組成,由于高通量測序所需樣品量少,若樣品混合不均勻,則實驗結果不能真實反映樣品中微生物群落組成。因此,為確保測序結果的準確性,較為全面地揭示環(huán)境樣品中微生物群落的組成及多樣性,采集的樣品應充分混合后再進行測序,盡可能減少取樣測序時的人為誤差。

    純培養(yǎng)結果揭示,廣西北部灣局部海域海洋沉積物蘊藏著豐富的細菌資源。本研究從4份海洋沉積物樣品中分離出278株細菌,就放線菌而言,鏈霉菌是優(yōu)勢菌,但稀有放線菌(非鏈霉菌)有17個屬,表明海洋生境蘊含著豐富的稀有放線菌資源,與Subramani等[12]報道結果一致。在屬分類水平上,除放線菌有18個屬外,芽孢桿菌有6個屬,該結果可能與樣品預處理有關:放線菌抗逆性強,80.0℃熱處理1.0 h有利于放線菌孢子萌發(fā)[33];而芽孢有很強的熱抵抗力,所以分離到的芽孢桿菌也較多[34]。此外,除幾丁質(zhì)培養(yǎng)基外,本實驗所用的5種培養(yǎng)基均是由石松標等[16]、王聰?shù)萚18]、彭云霞等[19]、姜怡等[35]、曹艷茹等[36]研究證實的分離細菌效果較好的培養(yǎng)基,尤其是放線菌。但就本實驗而言,HV培養(yǎng)基分離效果最好,其次是海藻糖-天冬酰胺培養(yǎng)基,而M3培養(yǎng)基的分離效果最差。結果表明,培養(yǎng)基的分離效果可能受樣品類型、采樣位置等因素的影響。

    北部灣海洋微生物次級代謝產(chǎn)物多樣性豐富。截至2020年,多位研究者已從北部灣海洋微生物中分離出110個化合物,其中53個為新型天然產(chǎn)物[37]。本研究通過抗菌活性和功能基因篩選實驗評估廣西北部灣局部海域海洋沉積物純培養(yǎng)菌株的生物活性潛力。抗菌活性結果表明,76.34%的菌株至少對1種指示菌有抑菌活性,其中鏈霉菌YIM 150601、YIM 150634的抑菌譜最廣、抑菌活性最強,YIM 150853為類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的1個潛在新分類單元。基于“新產(chǎn)地、新菌種、新基因、新產(chǎn)物”的觀點[38], YIM 150853應該有較好的生物活性,但抗菌活性和功能基因篩選結果卻表明,YIM 150853對9種指示菌均無抑菌活性,僅篩選到基因組中含有二萜類化合物的基因簇,該菌株具體的生物活性還有待進一步研究。此外,功能基因篩選和抗菌活性結果顯示,與非放線菌相比,放線菌產(chǎn)生生物活性代謝物的潛力更大,更具有開發(fā)利用的價值。

    近年來,來源于海洋放線菌的新型天然產(chǎn)物逐年增加。1997-2017年,研究者從28個屬的海洋放線菌中分離出108種新型天然產(chǎn)物,其中從Salinispora分離的2種天然產(chǎn)物和從鏈霉菌屬分離的1種天然產(chǎn)物處于臨床試驗階段[12,39,40]。2017-2020年,研究者從5個屬的海洋放線菌中分離出50種環(huán)肽類化合物,這些化合物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌活性,且對鰻弧菌有強烈抑菌活性的環(huán)二肽化合物及其衍生物占68%[41-46]。因此,加強廣西北部灣海域海洋沉積物細菌資源的研究,特別是放線菌的生物活性研究,有望提高發(fā)現(xiàn)新先導化合物的概率,可為新型藥物的開發(fā)提供候選菌株。

    4 結論

    本研究使用高通量測序和純培養(yǎng)技術對廣西北部灣局部海域海洋沉積物細菌多樣性進行研究,結果表明,該海域海洋沉積物中蘊藏著豐富的細菌資源,但由于現(xiàn)階段純培養(yǎng)技術的缺陷,僅分離純化出極少部分菌株。對分離出的可培養(yǎng)菌株進行生物活性評估,結果表明,大量純培養(yǎng)菌株具有抗菌活性,且部分菌株具有產(chǎn)生活性代謝物的基因簇。綜上可知,廣西北部灣海域海洋沉積物除了蘊含豐富的細菌資源外,還含有豐富多樣的生物合成基因簇及生物活性代謝物。挖掘更多的海洋細菌資源對于今后開發(fā)具有新的生物活性化合物具有重大意義。

    猜你喜歡
    放線菌測序桿菌
    杰 Sir 帶你認識宏基因二代測序(mNGS)
    新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
    二代測序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
    乳桿菌屬分類學地位變遷后菌種名稱英解漢譯檢索表(二)
    肺曲霉菌合并肺放線菌感染一例
    解淀粉芽孢桿菌Lx-11
    解淀粉芽孢桿菌的作用及其產(chǎn)品開發(fā)
    側(cè)孢短芽孢桿菌A60
    基因捕獲測序診斷血癌
    單細胞測序技術研究進展
    南大西洋深海沉積物中可培養(yǎng)放線菌的多樣性
    一个人看视频在线观看www免费 | 久久精品国产综合久久久| 操出白浆在线播放| 十八禁网站免费在线| 久久久久久九九精品二区国产| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲成人久久爱视频| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美日本亚洲视频在线播放| 露出奶头的视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 午夜精品一区二区三区免费看| 日韩有码中文字幕| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 午夜日韩欧美国产| 免费在线观看成人毛片| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲成a人片在线一区二区| 国产伦人伦偷精品视频| 日本 av在线| 国产午夜福利久久久久久| 天堂网av新在线| 免费在线观看成人毛片| 欧美在线一区亚洲| 99热只有精品国产| 此物有八面人人有两片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产久久久一区二区三区| 久久性视频一级片| 露出奶头的视频| 一区福利在线观看| 精品国产亚洲在线| 中文资源天堂在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 一本久久中文字幕| 丰满乱子伦码专区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 九九在线视频观看精品| 波多野结衣巨乳人妻| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| avwww免费| 亚洲成人久久性| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美大码av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美黑人巨大hd| 亚洲内射少妇av| 五月伊人婷婷丁香| 悠悠久久av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产成人a区在线观看| 两人在一起打扑克的视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久香蕉国产精品| 国产不卡一卡二| 国产免费一级a男人的天堂| 成人国产综合亚洲| 九色国产91popny在线| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产一区二区激情短视频| 五月伊人婷婷丁香| 一进一出抽搐gif免费好疼| 伊人久久精品亚洲午夜| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品久久久久久久久免 | avwww免费| 亚洲 国产 在线| 婷婷精品国产亚洲av| 少妇的逼水好多| 99久久成人亚洲精品观看| 免费在线观看成人毛片| 中国美女看黄片| 欧美性感艳星| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 在线视频色国产色| av在线蜜桃| 白带黄色成豆腐渣| 看片在线看免费视频| 国产精品久久电影中文字幕| 国产麻豆成人av免费视频| 最近最新免费中文字幕在线| 最近视频中文字幕2019在线8| www.色视频.com| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产精品久久久久久久电影 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产老妇女一区| 搞女人的毛片| 亚洲av不卡在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩欧美精品免费久久 | 99在线人妻在线中文字幕| 热99在线观看视频| 日本五十路高清| 我的老师免费观看完整版| 手机成人av网站| 在线国产一区二区在线| 国产色爽女视频免费观看| 一级黄片播放器| 久久久色成人| 亚洲五月天丁香| 观看美女的网站| 欧美一区二区国产精品久久精品| 色吧在线观看| 欧美在线黄色| 国产精品影院久久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜视频国产福利| 日本一本二区三区精品| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| x7x7x7水蜜桃| 1024手机看黄色片| 最后的刺客免费高清国语| 69av精品久久久久久| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久精品国产清高在天天线| 五月伊人婷婷丁香| 午夜影院日韩av| 亚洲 国产 在线| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99视频精品全部免费 在线| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久久精品大字幕| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 日本黄色片子视频| bbb黄色大片| 亚洲国产色片| 禁无遮挡网站| 99riav亚洲国产免费| 一个人观看的视频www高清免费观看| 免费大片18禁| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲国产欧美人成| 国产av不卡久久| www.999成人在线观看| 久久久成人免费电影| 久久亚洲精品不卡| 18禁黄网站禁片免费观看直播| av中文乱码字幕在线| 中文字幕av成人在线电影| 国产高潮美女av| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲专区国产一区二区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲一区二区三区不卡视频| 中文字幕av在线有码专区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99精品在免费线老司机午夜| 中文字幕久久专区| 国产色婷婷99| 日韩大尺度精品在线看网址| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本三级黄在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 精品无人区乱码1区二区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜福利视频1000在线观看| 美女cb高潮喷水在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 日本一二三区视频观看| 桃红色精品国产亚洲av| 午夜免费激情av| 亚洲成av人片免费观看| 久久久色成人| 亚洲人成电影免费在线| 国产真实乱freesex| 在线观看免费午夜福利视频| bbb黄色大片| 免费在线观看成人毛片| 国产亚洲欧美98| 狂野欧美激情性xxxx| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲男人的天堂狠狠| svipshipincom国产片| 国产在视频线在精品| 国产 一区 欧美 日韩| 黑人欧美特级aaaaaa片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 校园春色视频在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 成人国产一区最新在线观看| 国产精品影院久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 露出奶头的视频| 国产精品女同一区二区软件 | 18+在线观看网站| 日本熟妇午夜| 亚洲最大成人中文| 国语自产精品视频在线第100页| 黄色成人免费大全| 欧美三级亚洲精品| 国产高潮美女av| 婷婷精品国产亚洲av在线| 免费看a级黄色片| 国产一区二区在线观看日韩 | 搡老妇女老女人老熟妇| 岛国在线免费视频观看| 亚洲精华国产精华精| 亚洲成av人片免费观看| 熟女人妻精品中文字幕| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲无线观看免费| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 手机成人av网站| 国产一区二区三区视频了| 日韩免费av在线播放| 亚洲美女黄片视频| 一区福利在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久久久国产a免费观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美成人性av电影在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 日韩亚洲欧美综合| 国内精品久久久久久久电影| 婷婷丁香在线五月| av黄色大香蕉| 国产激情偷乱视频一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 免费av不卡在线播放| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久久久久九九精品二区国产| 午夜影院日韩av| 黄色女人牲交| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产亚洲av嫩草精品影院| 99热6这里只有精品| 精品久久久久久成人av| 国产在线精品亚洲第一网站| 少妇的逼水好多| 欧美不卡视频在线免费观看| 999久久久精品免费观看国产| 神马国产精品三级电影在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产成年人精品一区二区| 综合色av麻豆| 69av精品久久久久久| 毛片女人毛片| 国产亚洲欧美98| av黄色大香蕉| 日韩欧美在线乱码| 黄色成人免费大全| 日韩人妻高清精品专区| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产高清视频在线观看网站| 国产精品女同一区二区软件 | 又黄又爽又免费观看的视频| 欧美三级亚洲精品| 午夜福利18| 免费av毛片视频| 舔av片在线| 国产成人影院久久av| aaaaa片日本免费| 高清在线国产一区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美不卡视频在线免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 18禁黄网站禁片免费观看直播| www.999成人在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 最近在线观看免费完整版| www国产在线视频色| 久久久精品大字幕| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产高潮美女av| 日本 av在线| a级毛片a级免费在线| 中国美女看黄片| 成年免费大片在线观看| 九色国产91popny在线| 欧美+日韩+精品| 1000部很黄的大片| 午夜福利欧美成人| 麻豆国产97在线/欧美| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 天天添夜夜摸| 国产精华一区二区三区| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲电影在线观看av| 亚洲激情在线av| 久久久久久国产a免费观看| 最近最新免费中文字幕在线| 国产日本99.免费观看| xxx96com| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 在线观看av片永久免费下载| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 日本一二三区视频观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av五月六月丁香网| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久久久久久久久黄片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 精品熟女少妇八av免费久了| svipshipincom国产片| 香蕉久久夜色| 久久久久久人人人人人| 18禁国产床啪视频网站| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产成人av教育| 国产成人av激情在线播放| 亚洲色图av天堂| 男女午夜视频在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 一本久久中文字幕| 校园春色视频在线观看| 91在线观看av| ponron亚洲| 日韩欧美三级三区| 亚洲精品影视一区二区三区av| e午夜精品久久久久久久| 成人一区二区视频在线观看| 在线a可以看的网站| 久久精品国产自在天天线| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲人成电影免费在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲真实伦在线观看| 国产三级黄色录像| 成年人黄色毛片网站| 在线播放国产精品三级| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲美女黄片视频| 露出奶头的视频| 日韩有码中文字幕| 天堂网av新在线| 在线观看66精品国产| 18禁黄网站禁片免费观看直播| av在线天堂中文字幕| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品一区二区三区av网在线观看| 在线观看66精品国产| avwww免费| 亚洲欧美日韩卡通动漫| www国产在线视频色| 国产伦一二天堂av在线观看| 男人舔奶头视频| 成年女人永久免费观看视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 日韩欧美国产在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲成人中文字幕在线播放| 18禁在线播放成人免费| x7x7x7水蜜桃| 日韩欧美在线乱码| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产三级黄色录像| 在线观看日韩欧美| 免费观看精品视频网站| 不卡一级毛片| 男女床上黄色一级片免费看| 桃红色精品国产亚洲av| 制服人妻中文乱码| 精品不卡国产一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲无线观看免费| 亚洲精品一区av在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 美女 人体艺术 gogo| 少妇的逼水好多| 欧美又色又爽又黄视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 热99re8久久精品国产| 午夜日韩欧美国产| 婷婷精品国产亚洲av在线| 舔av片在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 内射极品少妇av片p| 五月伊人婷婷丁香| 日韩av在线大香蕉| 亚洲国产精品久久男人天堂| 免费无遮挡裸体视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久精品91无色码中文字幕| 天堂影院成人在线观看| 一区二区三区激情视频| www.999成人在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 中文字幕久久专区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 天天添夜夜摸| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产不卡一卡二| 欧美成人a在线观看| 午夜久久久久精精品| 成年女人看的毛片在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲成人久久爱视频| netflix在线观看网站| 无遮挡黄片免费观看| 岛国在线免费视频观看| 国产精品 欧美亚洲| 在线天堂最新版资源| 久久精品影院6| 美女 人体艺术 gogo| 成人永久免费在线观看视频| 美女大奶头视频| 久久亚洲真实| 国产精品 欧美亚洲| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品三级大全| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲最大成人中文| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 男插女下体视频免费在线播放| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲真实伦在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美黄色片欧美黄色片| 女警被强在线播放| 老司机深夜福利视频在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 国产精品久久视频播放| 午夜精品一区二区三区免费看| 嫩草影视91久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 免费在线观看影片大全网站| 听说在线观看完整版免费高清| 人妻久久中文字幕网| 午夜两性在线视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美3d第一页| 国产精品99久久99久久久不卡| 88av欧美| 国产视频内射| 婷婷精品国产亚洲av| 波多野结衣高清作品| xxxwww97欧美| 久久国产精品影院| 成年女人永久免费观看视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 淫秽高清视频在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 99精品欧美一区二区三区四区| 无人区码免费观看不卡| www日本在线高清视频| 精品乱码久久久久久99久播| 一进一出抽搐动态| 国产精品国产高清国产av| 国产精品一区二区三区四区久久| 午夜激情欧美在线| 白带黄色成豆腐渣| 床上黄色一级片| 精品日产1卡2卡| av在线蜜桃| 性色av乱码一区二区三区2| 最近最新中文字幕大全电影3| 神马国产精品三级电影在线观看| 色播亚洲综合网| 99久久精品一区二区三区| 午夜福利欧美成人| 精品一区二区三区视频在线 | 久久久久久大精品| 精品久久久久久成人av| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久久久久精品吃奶| 99精品在免费线老司机午夜| eeuss影院久久| 99精品久久久久人妻精品| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲av免费在线观看| 国产成人欧美在线观看| 国产午夜福利久久久久久| www.www免费av| 午夜精品一区二区三区免费看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产成人aa在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 精品国产三级普通话版| bbb黄色大片| 在线a可以看的网站| 99国产综合亚洲精品| 制服人妻中文乱码| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲内射少妇av| 欧美国产日韩亚洲一区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 午夜日韩欧美国产| 日韩欧美三级三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久亚洲真实| 91九色精品人成在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 精品久久久久久成人av| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 黄片大片在线免费观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲无线在线观看| 99热这里只有是精品50| 少妇丰满av| 两人在一起打扑克的视频| 国产免费一级a男人的天堂| 天天躁日日操中文字幕| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 长腿黑丝高跟| 国产高清videossex| 美女免费视频网站| 国产成人av教育| 不卡一级毛片| 最近最新免费中文字幕在线| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 99在线人妻在线中文字幕| 国产高清videossex| www日本黄色视频网| 日韩有码中文字幕| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品国内亚洲2022精品成人| 他把我摸到了高潮在线观看| 99久国产av精品| 国产精品影院久久| 久久久国产成人免费| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 最近最新中文字幕大全免费视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 一二三四社区在线视频社区8| 高清在线国产一区| 午夜福利欧美成人| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲 国产 在线| 1024手机看黄色片| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲国产欧美网| 国产黄a三级三级三级人| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲片人在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲真实伦在线观看| 51国产日韩欧美| 国产高潮美女av| 久久久色成人| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲精华国产精华精| 国产精品国产高清国产av| 欧美日韩乱码在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 综合色av麻豆| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 老汉色av国产亚洲站长工具| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久精品国产清高在天天线| svipshipincom国产片| 一a级毛片在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 精品国产三级普通话版| 99热这里只有精品一区| 欧美bdsm另类| 久久久久性生活片| 神马国产精品三级电影在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲成人久久性| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 国产伦精品一区二区三区四那| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产成人av激情在线播放| 99精品欧美一区二区三区四区| 男女那种视频在线观看| 久久中文看片网| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产91精品成人一区二区三区| 午夜久久久久精精品| 免费电影在线观看免费观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 免费一级毛片在线播放高清视频| 九色成人免费人妻av| 99热精品在线国产| 国产一区二区激情短视频| 午夜视频国产福利| 露出奶头的视频| 国产熟女xx| 偷拍熟女少妇极品色| 搞女人的毛片| 岛国在线免费视频观看| 99久久九九国产精品国产免费| 母亲3免费完整高清在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品久久视频播放| 日韩中文字幕欧美一区二区|