陳玉青，熊彩云，蔣金霞，蘭公劍

（南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046）

N-2-[ (二乙基氨基)乙基]-5-甲?；?2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺（以下簡稱起始物料1）為常見化工原料，可用于替尼類藥物的合成，在其合成過程中可能引入雜質(zhì)1-羥基苯并三唑，進一步傳導至原料及其制劑中，對患者造成傷害，其含量需要進行控制以保證藥品的安全性。

近年來，基因毒性雜質(zhì)引起越來越多的關注，雜質(zhì)在化合物合成過程中是難以避免的，且種類多、分類困難。為了區(qū)分普通雜質(zhì)和基因毒性雜質(zhì)，相關法規(guī)和指導原則普遍采用了“警示結構”的方法，具有警示結構的化合物通常被認為具有潛在基因毒性[1]。雜質(zhì)1-羥基苯并三唑具有警示結構[2]，需要按照基因毒性雜質(zhì)控制策略進行研究，根據(jù)指導原則，通常認為成人每日攝入雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的量低于1.5 μg 時，誘發(fā)癌變的風險是可以接受的，該制劑最大日服用量為117 mg，計算并制定雜質(zhì)1-羥基苯并三唑在起始物料1 中的限度為0.00125%。目前關于雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的檢測方法無相關文獻報道，根據(jù)雜質(zhì)結構特點新建了HPLC 方法檢測該雜質(zhì)，起始物料1 及雜質(zhì)1-羥基苯并三唑結構式見圖1。

圖1 起始物料1 及雜質(zhì)結構式

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜儀，型號：Agilent 1260，安捷倫；電子天平，型號：XP-205DR，梅特勒托利多。

1.2 試劑

磷酸（美國ROE Scientific 公司）、乙腈（美國TEDIA 公司），均為HPLC 級。

雜質(zhì)1-羥基苯并三唑?qū)φ掌?，批號?0140806，蘇州昊帆生物股份有限公司；起始物料1 供試品，批號：YY18051001，蘇州海宇生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：YMC Pack ODS-A，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：0.1%磷酸-乙腈（85:15）；檢測波長：210 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：20 ℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 空白溶劑

0.1%磷酸-乙腈（85:15）。

2.2.2 供試品溶液

取供試品適量，加溶劑溶解并稀釋成濃度為10 mg/mL 的溶液，搖勻。

2.2.3 對照品貯備液

精密量取雜質(zhì)1-羥基苯并三唑?qū)φ掌愤m量，加溶劑溶解并稀釋制成濃度為0.5 mg/mL的溶液，搖勻。

2.2.4 對照品溶液

精密量取對照品貯備液適量，用溶劑稀釋制成濃度約為0.1 μg/mL的溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液

取供試品和對照品貯備液適量，加溶劑溶解并稀釋制成每毫升約含起始物料1 10 mg、雜質(zhì)1-羥基苯并三唑0.5 mg 的混合溶液，搖勻。

2.3 專屬性

分別精密量取空白溶劑、系統(tǒng)適用性溶液、對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明：空白溶劑和供試品溶液中其他雜質(zhì)不干擾雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的測定，供試品溶液中雜質(zhì)1-羥基苯并三唑未檢出，方法專屬性良好，結果見圖2。

圖2 專屬性試驗圖譜

2.4 檢測下限與定量下限

取對照品溶液逐級稀釋，信噪比不小于10的溶液作為定量下限溶液。雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的定量下限為0.05 μg·mL-1（相當于限度濃度50%），連續(xù)進樣6 次，其峰面積RSD 為3.6%，表明定量下限精密度良好。

取對照品溶液逐級稀釋，信噪比不小于3 的溶液作為檢測下限溶液，雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的檢測下限為0.015 μg·mL-1（相當于限度濃度15%），表明本方法靈敏度良好，滿足檢測需求。

2.5 線性范圍

精密移取2.2 項下對照品貯備液適量，制成系列濃度對照品溶液。精密量取上述溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸。雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的線性方程為：y=80818x-5.7233（r=0.9999），結果表明雜質(zhì)1-羥基苯并三唑濃度在一定范圍內(nèi)，與其峰面積線性關系良好。

2.6 進樣精密度

精密量取限度濃度對照溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6 針，記錄色譜圖，雜質(zhì)1-羥基苯并三唑峰面積的RSD 為4.9%，表明儀器進樣精密度良好。

2.7 準確度與重復性

準確度是以雜質(zhì)的回收率來表示，通過向供試品溶液中加入限度濃度為50%、100%、150%三個不同濃度水平的雜質(zhì)溶液計算雜質(zhì)的回收率；同時采用9 份樣品的測定結果進行重復性評價。不同濃度水平的加標供試品溶液中雜質(zhì)1-羥基苯并三唑回收率在80%～120%之間，平均回收率分別為90.7%（RSD 為7.0%），表明本方法的準確度和重復性良好。

2.8 中間精密度

由不同人員于不同日期在不同儀器上按重復性試驗測定方法，重新配制6 份溶液進行試驗。結果顯示：合并重復性共12 份加標供試品溶液中雜質(zhì)1-羥基苯并三唑平均回收率為93.6%（RSD 為7.3%），方法中間精密度良好。

2.9 溶液穩(wěn)定性

取供試品溶液，分別于室溫條件下放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h 后進樣，考察供試品溶液穩(wěn)定性。結果顯示:供試品溶液中雜質(zhì)1-羥基苯并三唑均未檢出，且無其他降解雜質(zhì)干擾檢測，說明供試品溶液放置在室溫下14 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 耐用性

適當調(diào)整乙腈初始比例（15%±1%）、柱溫（20 ℃、25 ℃）、流速（1.0±0.1）mL·min-1及不同色譜柱，考察100%加標供試品溶液中雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的含量變化。結果表明：色譜條件在一定范圍變動時對雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的檢測無影響，分離度均大于1.5，方法耐用性良好。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

雜質(zhì)1-羥基苯并三唑有較強的末端吸收，為提高雜質(zhì)檢測的靈敏度，選擇紫外吸收較強的末端波長210 nm 作為檢測波長。

3.2 流動相體系的選擇

甲醇的截止波長為205 nm，接近檢測波長，選擇甲醇為有機相可能會對檢測有干擾，因此選擇乙腈為有機相；水相中添加磷酸可增強雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的保留，同時改善峰型，在等度條件雜質(zhì)與主峰達到基線分離，因此選擇等度洗脫，節(jié)約時間。

3.3 柱溫的選擇

通過不同柱溫的篩選，發(fā)現(xiàn)柱溫越低越利于雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的分離。為了兼顧分離度與儀器柱溫箱可實現(xiàn)性，控制柱溫為20 ℃。

4 小結

采用HPLC 法梯度檢測起始物料N-2-[ (二乙基氨基) 乙基]-5-甲?；?2,4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酰胺中基因毒性雜質(zhì)1-羥基苯并三唑的含量，方法專屬性強、靈敏度滿足要求，可以有效地控制起始物料中基因毒性雜質(zhì)的含量，進而保證原料藥及其制劑的質(zhì)量。