大盤雞炒燉加工過程中蛋白質(zhì)降解和微觀結(jié)構(gòu)變化

趙電波 栗俊廣 柳紅莉 白艷紅

(1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2. 河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001；3. 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034)

雞肉蛋白富含人體必需氨基酸，且種類齊全、比例均衡，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。肉與肉制品中的蛋白質(zhì)不僅是主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的來源，也是形成產(chǎn)品品質(zhì)(質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味和色澤)的物質(zhì)基礎(chǔ)。經(jīng)加熱處理后，肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解，產(chǎn)生一系列多肽、短肽、游離氨基酸、核苷酸、核苷等風(fēng)味物質(zhì)[1]。目前中國(guó)對(duì)于傳統(tǒng)雞肉制品的研究主要集中于加工方式的改進(jìn)[2-3]、產(chǎn)品品質(zhì)的改善[4-5]、貯藏與保鮮[6]、加工過程中有害物質(zhì)的控制[7]、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的成分分析及風(fēng)味、滋味的呈現(xiàn)與保持[8]。有研究[9]表明，肌肉中蛋白質(zhì)的降解、非蛋白氮(non-protein nitrogen，NPN)和游離氨基酸含量的變化對(duì)風(fēng)味的形成具有重要作用。

大盤雞是具代表性的中華傳統(tǒng)炒制類雞肉菜肴，以其獨(dú)特的風(fēng)味和良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值享譽(yù)海內(nèi)外，深受消費(fèi)者喜愛[5]。傳統(tǒng)的大盤雞制作方法是先炒制再燉炒，具有色澤鮮艷、爽滑麻辣、味道鮮美的特點(diǎn)。然而，以手工制作為主的大盤雞，機(jī)械化程度低，沒有形成標(biāo)準(zhǔn)化、工業(yè)化產(chǎn)品，市場(chǎng)流通量較小，產(chǎn)品附加值低。目前，智能烹飪已進(jìn)入快速發(fā)展階段，研究[5]表明，采用智能炒制方式制作的大盤雞與傳統(tǒng)手工制作在感官品質(zhì)和質(zhì)構(gòu)方面無顯著差異，但智能炒制方式能更好地保持大盤雞的風(fēng)味。研究擬采用智能炒制機(jī)模擬傳統(tǒng)大盤雞炒燉工藝，以制作大盤雞的原料肉、炒制后的半成品和燉炒后的成品為研究對(duì)象，測(cè)定不同加工工序樣品中游離氨基酸、不同氮含量并分析蛋白降解和微觀結(jié)構(gòu)的變化，以期為大盤雞的工藝改進(jìn)及工業(yè)化標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)或技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃羽肉雞冷鮮雞脯肉：屠宰后24～48 h，市售；

大豆油、精制鹽、白砂糖、花椒、八角、干紅椒、大蔥、生姜：鄭州市某大型超市；

化學(xué)試劑均為常用分析純；

智能炒制機(jī)：鄭州輕工業(yè)大學(xué)試制；

氨基酸自動(dòng)分析儀：835-50型，日本日立公司；

半自動(dòng)凱氏定氮儀：K9840型，中國(guó)海能公司；

高速分散器：XHF-D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：TGL-20KR型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH.S4型，金壇市醫(yī)療器械廠；

真空冷凍干燥機(jī)：Lab-1-50型，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡：JSM-7001F型，日本JEOL公司。

1.2 方法

1.2.1 原料肉的處理及樣品制備 將黃羽肉雞冷鮮雞脯肉經(jīng)凈水清洗后，分割成長(zhǎng)×寬×厚約為3.5 cm×3.5 cm×3.5 cm的雞塊，待用。結(jié)合前期感官評(píng)價(jià)結(jié)果，原料及調(diào)味料配比：原料肉100 g、大豆油6 g、白砂糖3 g、生姜1.5 g、花椒0.4 g、八角0.2 g、干辣椒1.2 g、鹽1.4 g、水21 g、大蔥段8 g。

智能炒制：智能炒制機(jī)預(yù)熱后，依次按上述配比加入大豆油、白砂糖、雞肉，炒制6 min；再加入生姜、花椒、八角、干辣椒、食鹽、大蔥段和水，燉炒10 min后，成品出鍋。

1.2.2 樣品采集 在原料肉、炒制后、燉炒后(成品)3個(gè)關(guān)鍵工序處取樣，撈出雞脯肉塊，除去表面雜物，吸水紙吸掉表面湯汁，冷卻至室溫，待測(cè)。

1.2.3 氨基酸的測(cè)定 采用氨基酸分析儀[10]，試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.4 蛋白質(zhì)水解指數(shù)(PI)的測(cè)定

(1)總氮(TN)含量測(cè)定：采用凱氏定氮法[11]。

(2)非蛋白氮(NPN)含量測(cè)定：參照鄒良亮等[12]的方法并作適當(dāng)修改，取3 g左右(精確到0.001 g)樣品，加入25 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液，冰水浴高速勻漿(10 000 r/min)，每次18 s，勻漿3次，4 ℃條件下靜置12 h；于10 000 r/min條件下冷凍離心15 min，取上清液過濾并定容至25 mL，取2 mL進(jìn)行消化用凱氏定氮法測(cè)定NPN含量。

(3)蛋白質(zhì)水解指數(shù)(PI)計(jì)算：參照鄒良亮等[12]的方法，按式(1)計(jì)算蛋白水解指數(shù)。

I=ωNPN/ωTN×100%，

(1)

式中：

I——蛋白水解指數(shù)，%；

ωNPN——非蛋白氮含量，g/100 g；

ωTN——總氮含量，g/100 g。

1.2.5 肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳分析

(1)肌原纖維蛋白提?。簠⒖糧hao等[13]的方法，并稍作修改。雞胸肉剔除可見結(jié)締組織和多余脂肪，切成l～2 cm小塊并絞碎；在0～4 ℃下將均勻絞碎的雞胸肉(150～180 g)與分離緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，pH 7.0，4 ℃)按m雞胸肉∶V緩沖液=1∶4 (g/mL)混合，高速分散器(10 000 r/min)中勻漿3次，每次30 s；所得肉漿用20目過濾網(wǎng)(孔徑0.9 mm)過濾得濾液，4 127 r/min離心15 min，收集沉淀得到粗肌原纖維蛋白沉淀。將此肌原纖維蛋白沉淀分散在提取液(0.1 mol/L NaCl)中[m沉淀∶V提取液=1∶4 (g/mL)]，低速勻漿30 s(2 000 r/min)，4 127 r/min 離心15 min，重復(fù)相同步驟兩次，得到純化的肌原纖維蛋白放入碎冰屑中并置于4 ℃貯藏備用。

(2)電泳條件：參照Wang等[14]的方法，并稍作修改。將純化的肌原纖維蛋白溶于濃度為0.6 mol/L的NaCl溶液中，采用雙縮脲法測(cè)定并調(diào)整蛋白質(zhì)濃度為10 mg/mL，分離膠為12.0%，濃縮膠為5.0%，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓調(diào)整為110 V；電泳完成后，取出膠片在R-250染色液中染色30 min后，雙蒸水沖洗，脫色液(甲醇—冰醋酸—雙蒸水混合液，其中V甲醇∶V冰醋酸∶V雙蒸水=100∶35∶365)中過夜脫色備用。

1.2.6 微觀結(jié)構(gòu)分析 參照Z(yǔ)hao等[13]和李可等[15]的方法，并稍作修改。將樣品順著肌原纖維方向切成長(zhǎng)×寬×厚約為2 cm × 1 cm × 1 cm的肉塊后，置于-85 ℃ 超低溫冰箱中冷凍2 h后，再置于冷凍干燥機(jī)中干燥5 h，制成厚約0.1 cm的肉片并粘臺(tái)，最后置于離子濺射裝置中噴鉑金，采用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，氨基酸含量取3次平均值；TN和NPN含量采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)判定不同處理組之間存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸變化

由表1可知，雞肉經(jīng)炒制和燉炒加工后，所能檢測(cè)到的氨基酸含量均呈上升趨勢(shì)。炒制后的半成品和燉炒后的成品中的游離氨基酸含量分別為27.60，30.38 g/100 g，分別比原料肉增加了35.03%，48.63%。戚巍威等[16]研究認(rèn)為，游離氨基酸的增加和減少取決于其形成量和降解量的比值，大盤雞中游離氨基酸含量在炒制和燉炒階段均高于原料肉。這可能是由于加熱處理，使肌肉蛋白在氨肽酶的作用下發(fā)生降解生成游離氨基酸，導(dǎo)致其含量增加[17]4。

原料肉游離氨基酸中含量最高的是谷氨酸，為3.32 g/100 g，占所能檢測(cè)到總氨基酸含量的16.24%，其次是賴氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、精氨酸和丙氨酸；大盤雞燉炒后的成品中含量最高的也是谷氨酸，高達(dá)5.02 g/100 g，占所能檢測(cè)到總氨基酸含量的16.52%，其次是天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸和丙氨酸。

谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸6種氨基酸是重要的呈味氨基酸[18]。試驗(yàn)原料肉中這6種呈味氨基酸含量為8.82 g/100 g，占所能檢測(cè)到總氨基酸含量的43.15%；炒制后的半成品和燉炒后的成品中這6種呈味氨基酸含量分別為12.39，13.74 g/100 g，與原料肉相比，分別增加了40.48%，55.78%。這是由于加工烹飪過程中，雞肉蛋白受熱降解生成呈味游離氨基酸。

表1 大盤雞加工過程中的氨基酸含量、滋味閾值及滋味特征?Table 1 The contents of amino acids,taste thresholds and characteristics of Dapanji during processing

炒制后的半成品和燉炒后的成品與原料肉相比，必需氨基酸含量分別增加了40.24%，53.78%；燉炒后的成品中必需氨基酸含量占所能檢測(cè)到總氨基酸含量的45.23%，高于聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織(FAO/WHO)推薦的成人理想氨基酸模式(36%)[18]。說明炒制和燉炒有利于大盤雞營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的提升。燉炒后的成品中疏水性氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)比原料肉和炒制后的半成品分別增加了56.17%，9.85%，表明疏水性氨基酸在炒制階段被優(yōu)先釋放出來，含量增加較多。

作為滋味物質(zhì)，游離氨基酸不僅具有甜、咸、酸、鮮等多種味道，還可與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)形成己醛、壬醛、庚醛等醛類物質(zhì)，或通過Strecker降解形成一些脂類、醇類和酮類物質(zhì)，而這些物質(zhì)會(huì)進(jìn)一步與脂類氧化產(chǎn)物進(jìn)行反應(yīng)，形成大盤雞的特有滋味。由表1可知，大盤雞成品中的各種游離氨基酸含量均高于其滋味閾值，尤其是鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的含量分別是其閾值的167倍和98倍，這可能是提升大盤雞風(fēng)味的一個(gè)原因。

2.2 含氮物質(zhì)及蛋白水解指數(shù)變化

TN含量、NPN含量及PI的變化可以客觀地反映大盤雞在加工過程中蛋白質(zhì)的降解。由表2可知，原料肉經(jīng)炒制后，TN含量有所增加，但不顯著(P>0.05)，可能是由于炒制過程中的高溫使雞肉中的水分部分損失，導(dǎo)致TN含量相對(duì)增加；在燉炒階段，水和食鹽的加入促使部分鹽溶性成分和水溶性含氮物質(zhì)溶出到大盤雞湯汁中，再者，炒制階段產(chǎn)生的游離氨基酸、肽類等與脂肪水解所產(chǎn)生的各種脂肪酸發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生了部分揮發(fā)性的含氮物質(zhì)，造成燉炒后的成品中TN含量比原料肉顯著降低(P<0.05)。

NPN是蛋白質(zhì)發(fā)生降解的重要產(chǎn)物之一，主要包括除蛋白質(zhì)以外的多肽、短肽、游離氨基酸、核苷酸、核苷等，也是表征蛋白降解的重要指標(biāo)，其含量的變化會(huì)影響肉制品的品質(zhì)。有研究[9]表明，蛋白質(zhì)中降解程度最大的兩種組織蛋白為肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，這兩種組織蛋白降解產(chǎn)生的NPN等成分對(duì)肉制品的品質(zhì)有重要影響。由表2可知，炒制后的半成品NPN含量比原料肉有所增加(P>0.05)，主要是因?yàn)槌粗茣r(shí)的高溫使雞肉蛋白發(fā)生降解，產(chǎn)生多肽、短肽、游離氨基酸、核苷酸、核苷等。炒制后的半成品繼續(xù)加入食鹽和水進(jìn)行燉炒，而燉炒后的成品中NPN含量比原料肉和炒制后的半成品均顯著降低(P<0.05)，可能是由于食鹽抑制了肌肉蛋白質(zhì)的降解，以及一些水溶性氨基酸和肽類分子轉(zhuǎn)移到大盤雞湯汁中。有研究[19-21]表明，食鹽的添加會(huì)影響肌肉蛋白降解，且隨著食鹽添加量的增加，蛋白降解逐漸減弱，當(dāng)食鹽添加過多時(shí)，會(huì)完全抑制蛋白降解。這與試驗(yàn)結(jié)果一致。

表2大盤雞炒燉加工過程中TN、NPN含量及PI的變化?
Table 2 Changes of total nitrogen,non-protein nitrogen contents and proteolysis index of Dapanji during the processing of stir-fried and stewed

樣品TN含量/(10-2g·g-1)NPN含量/(10-2g·g-1)PI原料肉 3.522±0.185a0.203±0.007a5.8炒制后的半成品3.552±0.140a0.210±0.009a5.9燉炒后的成品 3.158±0.162b0.189±0.007b6.0

在大盤雞整個(gè)加工過程中，PI呈上升趨勢(shì)，說明在炒制和燉炒加工階段，雞肉蛋白發(fā)生了降解。PI的變化與游離氨基酸的變化相一致，表明燉炒后的成品中，游離氨基酸含量要高于炒制后的半成品。

2.3 肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳分析

由圖1可以看出，原料肉中分子量>97 kDa的肌原纖維蛋白片段經(jīng)炒制和燉炒后發(fā)生了部分降解；而由炒制后的半成品到燉炒后的成品，該蛋白降解不明顯。原料肉中分子量為97 kDa的肌原纖維碎片和15～25 kDa的蛋白譜帶(肌球蛋白輕鏈)顏色變淡、條帶變窄甚至消失，表明大盤雞炒燉加工過程中肌球蛋白發(fā)生了降解，其中炒制階段發(fā)生了部分降解，燉炒階段降解程度進(jìn)一步加深，部分降解產(chǎn)生的小分子蛋白碎片未在電泳譜帶呈現(xiàn)，可能是由于小分子蛋白碎片的分子量比較小，在電泳結(jié)束時(shí)已經(jīng)跑出電泳譜帶。雞肉經(jīng)炒燉加工后，分子量在29～37 kDa的蛋白譜帶增多，可能是因?yàn)榧∏虻鞍资軣嶙冃裕瑢?dǎo)致肌鈣蛋白T脫落。有研究[22]認(rèn)為，30 kDa左右的片段是肌鈣蛋白T降解的特征產(chǎn)物。34，37 kDa肌聯(lián)蛋白經(jīng)炒制和燉炒后仍然存在于樣品中且基本未發(fā)生降解，且在炒制和燉炒階段無顯著變化，由此可知，34，37 kDa肌聯(lián)蛋白屬于熱穩(wěn)定蛋白，與常亞楠[17]5，32的研究結(jié)論一致。原料肉中的G-肌動(dòng)蛋白(43 kDa)，經(jīng)炒制后電泳譜帶顏色變淡、條帶變窄，表明G-肌動(dòng)蛋白經(jīng)高溫炒制后發(fā)生部分降解；炒制后的半成品繼續(xù)燉炒至成品，G-肌動(dòng)蛋白降解未發(fā)生顯著變化，表明G-肌動(dòng)蛋白具有較好的熱穩(wěn)定性，僅次于肌聯(lián)蛋白。

由圖1還可以看出，與原料肉電泳譜帶相比，在炒制后的半成品和燉炒后的成品中，出現(xiàn)了47，55，60 kDa的肌原纖維蛋白譜帶，可能是因?yàn)樵先饨?jīng)高溫炒制后肌球蛋白重鏈發(fā)生了降解。王振宇等[23]研究表明，當(dāng)豬肉中心溫度超過60 ℃時(shí)，190～200 kDa肌球蛋白重鏈開始降解并出現(xiàn)大量47 kDa和部分60 kDa的蛋白降解產(chǎn)物。Huang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，豬肉肌原纖維蛋白中分子量約為220 kDa的肌球蛋白重鏈在溫度升至100 ℃時(shí)降解顯著并出現(xiàn)分子量約為47～60 kDa的蛋白降解產(chǎn)物。

2.4 微觀結(jié)構(gòu)變化

由圖2可以看出，在大盤雞炒燉加工過程中，雞肉的肌纖維結(jié)構(gòu)和肌膜發(fā)生了顯著變化。與原料肉相比，炒制過程中原料由于受熱而收縮，肌膜與肌纖維相分離，肌纖維間縫隙變大，導(dǎo)致肌纖維組織結(jié)構(gòu)開始變得緊實(shí)，形狀呈不規(guī)則多邊形，大小不均一；在燉炒階段，水的加入使雞肉表面溫度降低，隨著燉炒時(shí)間的延長(zhǎng)，雞肉的中心溫度逐漸升高，肌肉內(nèi)部肌原纖維蛋白受熱聚集、收縮[25]；張立彥等[26]研究表明，當(dāng)中心溫度達(dá)95 ℃時(shí)三黃雞雞肉中肌內(nèi)膜和肌束膜發(fā)生崩解、膠原蛋白凝膠化而導(dǎo)致相鄰肌纖維彼此排列變得緊實(shí)、致密。因此，燉炒后的大盤雞成品肌膜溶解，肌纖維組織結(jié)構(gòu)緊實(shí)，形狀呈規(guī)則多邊形，大小基本一致，肌纖維間緊密排列。

M.標(biāo)準(zhǔn)蛋白 A.原料肉 B.炒制后的半成品 C.燉炒后的成品圖1 大盤雞炒燉加工過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖

圖2 大盤雞炒燉加工過程中掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu)圖Figure 2 SEM of Dapanji during the processing of stir-fried and stewed

3 結(jié)論

采用智能炒制機(jī)炒制后的大盤雞半成品中游離氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸的含量比原料肉中的相應(yīng)值分別增加了35.03%，40.24%，40.48%；經(jīng)燉炒加工后的大盤雞成品中游離氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸的含量分別比原料肉中的相應(yīng)值分別增加了48.63%，53.78%，55.78%；經(jīng)過燉炒工藝可以增加蛋白降解程度。因此，大盤雞制作過程中燉炒工藝有助于增加大盤雞的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和提升其滋味并改善產(chǎn)品口感。由于試驗(yàn)要測(cè)定氨基酸含量的變化，未添加老抽和味精等含有氨基酸的調(diào)味料。為了保持大盤雞的原有滋味和風(fēng)味，后續(xù)將進(jìn)一步研究調(diào)味料對(duì)產(chǎn)品中氨基酸的貢獻(xiàn)。