基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討黃精－枸杞藥對(duì)治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制

邱玲艷，王旭*

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

糖尿病合并認(rèn)知功能障礙（diabetic cognitive impairment，DCI）是糖尿病常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，超過(guò)40%的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的癥狀［1］。近期研究表明［2］，糖尿病患者出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)是正常人的1.2~1.5倍，嚴(yán)重者可導(dǎo)致阿爾茨海默病（Alzheimer's Disease，AD），極大地影響了糖尿病患者的生存質(zhì)量。流行病學(xué)研究表明［3］，未來(lái)糖尿病合并認(rèn)知功能障礙將會(huì)是人們面臨的主要臨床問(wèn)題之一，已引起了人們廣泛的關(guān)注。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，在對(duì)于糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的患者治療中具有明顯的優(yōu)勢(shì)［4］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的基本病機(jī)在于腎精虧虛，氣血虧虛，髓減腦消，治以滋養(yǎng)肝腎、補(bǔ)益氣血為主，佐以化痰、行氣、活血［5］。中藥黃精是補(bǔ)腎益氣的要藥，其性甘、平，亦可以調(diào)理心肺［6］，首見(jiàn)于《雷公炮炙論》；枸杞性甘、平，多用于滋補(bǔ)肝腎，首見(jiàn)于《本草綱目》。兩者作為治療糖尿病的常用藥［7］，也可組成藥方，源自《奇效良方卷之二十一·諸虛門》，稱為二精方，可以有效緩解神經(jīng)退行性病變［8］，因此黃精－枸杞藥對(duì)可以作為糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的重要治療方藥。同時(shí)藥理學(xué)研究表明，黃精提取物具有保護(hù)肝腎功能、調(diào)節(jié)血糖、預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的作用［6］，枸杞提取物具有降血糖、調(diào)血脂肪、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡［9-10］等多種藥理作用，兩者配伍可以更好地防治糖尿病合并認(rèn)知功能障礙，但其具體的作用機(jī)制尚不明確。

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究對(duì)黃精－枸杞藥對(duì)防治糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的潛在活性成分和作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，并通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)將黃精－枸杞藥對(duì)內(nèi)化合物與受體虛擬分子結(jié)合發(fā)現(xiàn)其作用靶點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)，為其治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙提供更多可信度和實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 黃精－枸杞藥對(duì)活性成分篩選及藥物靶點(diǎn)收集

通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），獲取黃精－枸杞的活性成分，并將口服生物利用度（oral bioavailability，OB）設(shè)置為≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18進(jìn)一步篩選出黃精－枸杞藥對(duì)的有效活性成分和作用靶點(diǎn)。再利用數(shù)據(jù)庫(kù)Uniprot將篩選出的靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為人類基因名。

1.2 DCI相關(guān)靶點(diǎn)的收集

以“Cognitive impairment of diabetes mellitu”為關(guān)鍵字在GeneCards、OMIM、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相關(guān)基因的匯總并篩選、刪除重復(fù)基因。從GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的相關(guān)基因中進(jìn)一步篩選出相關(guān)分?jǐn)?shù)（Relevance scored）≥1分的靶點(diǎn)基因。

1.3 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建

運(yùn)用R語(yǔ)言匯總分析中藥靶基因與疾病相關(guān)基因的交集，并繪制Venny 圖。通過(guò)軟件Cytoscapes 將黃精－枸杞的中藥成分與其靶基因的關(guān)系進(jìn)行可視化，形成中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中基因節(jié)點(diǎn)越大代表與基因相關(guān)的藥物成分的數(shù)目越多。在STRING 平臺(tái)導(dǎo)入中藥靶基因與疾病相關(guān)基因的交集，在“Homo sapiens”屬性下，將minimun required interaction score 設(shè)置為≤0.9并刪除游離的基因，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。再利用CytoNCA 軟件計(jì)算中藥靶基因與疾病相關(guān)的交集基因的BC、CC、EC、DC、LAC、NC 分?jǐn)?shù)，構(gòu)建子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)的核心基因。

1.4 GO和KEGG分析

通過(guò)metascape 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行GO 和KEGG 數(shù)據(jù)分析，顏色越紅說(shuō)明網(wǎng)絡(luò)中基因在GO 富集中越顯著。GO 富集分析的目的在于分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因行使的功能。KEGG 富集分析的目的在于觀察調(diào)控網(wǎng)絡(luò)基因參與的通路。

1.5 分子對(duì)接

將核心基因與臨床陽(yáng)性藥物利拉魯肽（Liraglutide）和核心活性成分的小分子配體進(jìn)行分子對(duì)接，在pubchem 網(wǎng)站獲取小分子配體的2D 結(jié)構(gòu)，利用Chem 3D 軟件生成3D 結(jié)構(gòu)并優(yōu)化。然后利用Uniprot 搜索基因的蛋白并在PDB 網(wǎng)站獲取目標(biāo)基因蛋白的三維結(jié)構(gòu)，保存為PDB 格式。利用PYMOL 軟件去除蛋白受體三維結(jié)構(gòu)的水分子和小分子配體。接著，通過(guò)Autodock Tools 給蛋白受體加氫并確定活性口袋，最后，利用活性口袋中心區(qū)域的數(shù)值，在vina 下進(jìn)行分子對(duì)接并通過(guò)Pymol進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 黃精－枸杞子藥對(duì)的活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及相關(guān)條件的篩選后得到黃精的活性成分12個(gè)，其相關(guān)作用靶點(diǎn)為148個(gè)，枸杞的活性成分45個(gè)，其作用靶點(diǎn)為364個(gè)。見(jiàn)表1。

表1 黃精－枸杞藥對(duì)活性成分

2.2 黃精－枸杞子藥對(duì)治療DCI作用靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards、OMIM、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索出疾病相關(guān)基因，通過(guò)https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/網(wǎng)站篩選出黃精－枸杞子藥對(duì)的潛在靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的交集并生成韋恩圖，見(jiàn)圖1，其中紫色為藥對(duì)相關(guān)基因，有196 個(gè)靶點(diǎn)基因，紅色為DCI相關(guān)基因?yàn)? 554個(gè)，兩者有167個(gè)共同的靶點(diǎn)基因。

圖1 疾病與藥物相關(guān)靶點(diǎn)的Venny圖

2.3 黃精－枸杞子藥對(duì)活性成分治療DCI 的中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

將中藥靶基因與疾病相關(guān)基因的交集導(dǎo)入Cytoscapes 軟件構(gòu)建中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2），圓圈為中藥的成分其中綠色為枸杞子的活性成分，黃色為黃精的活性成分，矩形的藍(lán)色部分代表中藥的靶基因，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)越大代表與基因相連的成分越多。槲皮素（quercetin）所間接的基因最多（122），有效活性成分較高，其次是黃芩素（baicalein）（25）、β－谷甾醇（betasitosterol）（24），β－谷甾醇是黃精、枸杞子公共的有效活性成分。

圖2 黃精－枸杞藥對(duì)靶基因與DCI相關(guān)基因的中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)）

在STRING 平臺(tái)導(dǎo)入數(shù)據(jù)，將最低相互評(píng)分設(shè)置為≤0.9，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3，其PPI 網(wǎng)絡(luò)包涵618 條邊，167 個(gè)節(jié)點(diǎn)，淺藍(lán)色和紫紅色連線為已知的相互作用，綠色、深藍(lán)色和紅色連線為預(yù)測(cè)的相互作用。通過(guò)CytoNCA 軟件進(jìn)一步計(jì)算篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的13 個(gè)核心基因，見(jiàn)圖4，共有13 個(gè)節(jié)點(diǎn)，56 條邊。 基于degree分?jǐn)?shù)，取前三為JUN（degree23）、MAPK1（degree23）、TP53（degree25），為分子對(duì)接做準(zhǔn)備。

圖3 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 核心基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.5 KEGG和GO富集分析

進(jìn)行KEGG 富集分析（P< 0.05）可得到條目163條，可涉及的信號(hào)通路有AGE－RAGE 信號(hào)通路（AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications）、癌癥信號(hào)通路（Pathways in cancer）、前列腺癌信號(hào)通路（Prostate cancer）等，見(jiàn)圖5。基于metascape 進(jìn)行GO 富集分析（P<0.05），X 軸為涉及的基因數(shù)，Y 軸為按P值大小排列的BP、CC、MF 名稱。其中生物學(xué)過(guò)程（BP）包括對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng)（response to toxic substance）、氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）、對(duì)傷害的反應(yīng)（response to wounding）等，細(xì)胞成分（CC）涉及膜筏（membrane raft）、胞質(zhì)核周區(qū)（perinuclear region of cytoplasm）、突觸后（postsynapse）等，分子功能（MF）包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、蛋白激酶結(jié)合（protein kinase binding）、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）等，見(jiàn)圖6。其中AGE－RAGE信號(hào)通路為rich factor 最高的通路即富集程度較高的通路，癌癥通路為富集程度最顯著的通路（見(jiàn)圖7），其中紅色為上調(diào)差異基因，綠色為下調(diào)差異基因。

圖5 KEGG富集分析通路圖

圖6 GO富集分析圖

圖7 ACE-RACE信號(hào)通路

2.6 分子對(duì)接

基于Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)與PPI網(wǎng)絡(luò)可獲得黃精－枸杞藥對(duì)的核心活性成分為黃芩素、槲皮素、β－谷甾醇，基于核心靶點(diǎn)為JUN、MAPK1、TP53。分別將兩者進(jìn)行分子對(duì)接，研究結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)合能<－5 kcal/mol表示分子對(duì)接結(jié)果良好［11］。黃芩素、槲皮素、β－谷甾醇與靶點(diǎn)JUN、MAPK1、TP53分子對(duì)接的結(jié)合能都低于－20.5 kJ/mol，其中JUN與槲皮素結(jié)合能最低，為－30.96 kJ/mol（見(jiàn)圖8），MAPK1與β－谷甾醇結(jié)合最穩(wěn)定，結(jié)合能－36 kJ/mol（見(jiàn)圖9），TP53 與槲皮素結(jié)合最穩(wěn)定，結(jié)合能為－37.24 kJ/mol（見(jiàn)圖10），表明黃精－枸杞藥對(duì)的核心活性成分與糖尿病合并認(rèn)知功能障礙核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果良好。

圖8 JUN與quercetin

圖9 TP53與quercetin

圖10 MAPK1與beta－sitosterol

表2 黃精－枸杞藥對(duì)的核心活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果（kJ/mol）

3 討論

中醫(yī)古籍中并沒(méi)有糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的病名記載，但是根據(jù)其臨床表現(xiàn)可以將其歸屬于“癡呆”合并“消渴”的范疇，正如《圣濟(jì)總錄》提到“消渴日久，怔忡健忘”［12］。其病因在于腎精不足，腎陽(yáng)虛衰，不能溫化水液，水液潴留，化濕為痰或腎氣不足，血行不暢，留滯為瘀，痰瘀日久，阻滯腦絡(luò)，腦為百神之會(huì)，腦絡(luò)受損則出現(xiàn)意識(shí)活動(dòng)障礙［13］。徐虎軍［14］將糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的患者辨為陰虛陽(yáng)亢證、氣血不足證、腑滯濁留證、熱毒內(nèi)盛證和腎精虧虛證，研究表明糖尿病合并認(rèn)知功能障礙為腎精虧虛證占80%，兩證相兼者占80.8%，三證及以上占57.3%，故治療多以補(bǔ)腎為主，加以行氣、化痰、活血，標(biāo)本兼顧［5］。黃精－枸杞藥對(duì)作為補(bǔ)益腎精的常用藥對(duì)［15-16］還可以達(dá)到改善血糖［17］、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用［8］。王旭教授在通過(guò)多年的臨床研究觀察中總結(jié)出“糖脂清”方對(duì)于糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的患者療效顯著，黃精、枸杞作為其君藥起著主要的治療疾病的作用。但目前對(duì)于黃精－枸杞藥對(duì)治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的藥理學(xué)研究較少，因此本研究對(duì)黃精－枸杞藥對(duì)治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的作用機(jī)制、作用靶點(diǎn)進(jìn)行了深入的分析。

基于《全球糖尿病概覽》（第八版）［18］，我國(guó)糖尿病人數(shù)為全球第一。隨著對(duì)于糖尿病合并認(rèn)知功能障礙疾病的深入研究，已有研究表明［19］，糖尿病患者由于體內(nèi)葡萄糖濃度的升高導(dǎo)致ROS 生成增加、TLR4 通路激活、炎癥介質(zhì)釋放；在持續(xù)的炎癥反應(yīng)下，出現(xiàn)巨噬細(xì)胞等免疫因子浸潤(rùn)，進(jìn)而導(dǎo)致胰島功能障礙，形成惡性循環(huán)。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織巨噬細(xì)胞，參與神經(jīng)炎癥［20］，是大腦的先天免疫細(xì)胞，與神經(jīng)退行性改變密切相關(guān)［21］。Teemu Natunen 等進(jìn)一步研究證實(shí)［22］，糖尿病會(huì)誘導(dǎo)小鼠海馬體中與神經(jīng)退行性改變相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞特異基因的異常表達(dá)。同時(shí)，免疫細(xì)胞分泌的IFN－細(xì)胞因子等免疫活性分子過(guò)表達(dá)CPR 等也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元受損，認(rèn)知功能出現(xiàn)退行性改變［23］。此外，研究表明［24］糖尿病合并認(rèn)知功能障礙可能與Ca2+失調(diào)、血腦屏障受損、糖尿病腦損傷、免疫炎癥機(jī)制、胰島素功能受損有關(guān)。這對(duì)于研究中藥治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙具有較大的意義。

本研究通過(guò)TCMSP平臺(tái)篩選出黃精－枸杞的有效成分12個(gè)，通過(guò)PPI網(wǎng)絡(luò)獲得與糖尿病合并認(rèn)知功能障礙相關(guān)靶基因關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的藥物活性成分主要有黃芩素（baicalein）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、槲皮素（quercetin）等。槲皮素、黃芩素作為黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、降糖等作用，對(duì)神經(jīng)退行性疾?。?5］及2型糖尿?。?6］等多種疾病療效顯著。黃酮類化合物與MAPK1激酶相互作用還可以保護(hù)神經(jīng)，增強(qiáng)記憶功能［27］。研究表明［28］，黃芩素可以通過(guò)改善高糖誘所導(dǎo)致的血腦屏障受損達(dá)到保護(hù)糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。槲皮素最顯著的作用在于抑制炎癥因子，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)［29］。β－谷甾醇和豆甾醇都屬于類固醇，又可以稱為“腎上腺皮質(zhì)素”，可以有效抗高膽固醇、神經(jīng)細(xì)胞炎癥，提高抗氧化和調(diào)節(jié)血糖［30-31］。

黃精－枸杞藥對(duì)與糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的交集基因共有164 個(gè)，主要作用靶點(diǎn)有JUN（AP－1）、FOS、MAPK1、MYC、TP53 等。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子JUN（AP－1）、FOS 是轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白－1（AP－1）家族的成員，參與調(diào)控T 淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖、活化［32］。研究表明［33］，JUN（AP－1）可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞和促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥活化。AP－1上游的調(diào)控因子JNK 磷酸化C－Jun 蛋白參與MAPK 級(jí)聯(lián)反應(yīng)是產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的重要途徑［34］。DENG Y 等［35］通過(guò)抑制MAPK1可以有效減少海馬細(xì)胞的凋亡，改善認(rèn)知功能障礙。癌基因MYC、腫瘤蛋白TP53 同屬于控制凋亡調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，主要作用于調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡［36］，C－myc 有助于抑制神經(jīng)毒性［37］，N－myc下游調(diào)控系統(tǒng)通過(guò)增加MMP－3的表達(dá)和分泌，調(diào)節(jié)血腦屏障和免疫細(xì)胞的滲透性［38］，可涉及多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制［39］。LACROIX M 等［40］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TP53 既可以參與胰島β 細(xì)胞凋亡，胰島素抵抗，氧化應(yīng)激等與糖尿病相關(guān)的生物過(guò)程，也參與調(diào)控FXN，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，與糖尿病合并認(rèn)知功能障礙關(guān)系密切。

基于GO和KEGG富集分析，將黃精－枸杞藥對(duì)治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙相關(guān)的通路分?jǐn)?shù)排在前20 位的通路分為疾病通路、有機(jī)系統(tǒng)通路和環(huán)境信息處理通路。疾病通路包括糖尿病并發(fā)癥AGE－RAGE信號(hào)通路、乙型肝炎信號(hào)通路、癌癥相關(guān)通路等。有機(jī)系統(tǒng)主要可分為免疫系統(tǒng)（IL－17 信號(hào)通路）、神經(jīng)系統(tǒng)（Dopaminergic synapse）與內(nèi)分泌系統(tǒng)（脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路等）。環(huán)境信息處理主要為信號(hào)傳導(dǎo)包括NF－kappa B 信號(hào)通路與MAPK 信號(hào)通路。其主要的分子過(guò)程為與轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶的結(jié)合，可知黃精－枸杞藥對(duì)治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙主要涉及神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)，是多通路、多靶點(diǎn)的。神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)起源于1977年由Basedovsky 提出，與中醫(yī)整體觀，臟腑氣血功能不足導(dǎo)致臟腑疾病發(fā)生的論點(diǎn)相一致［41］。黃精－枸杞藥對(duì)治療糖尿病合并認(rèn)知功能障主要以補(bǔ)腎為主，腎為先天之本，主藏精，精化氣，氣生血；精生髓，髓化血，氣血不足，臟腑功能衰退，腦絡(luò)不榮，認(rèn)知功能衰退。藥對(duì)通過(guò)治療神經(jīng)炎癥、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)等，立足于神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)，可以有效治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)黃精－枸杞藥對(duì)治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙有效成分主要為黃芩素、β－谷甾醇、豆甾醇和槲皮素，主要作用于靶點(diǎn)JUN、MAPK1、TP53、FOS，參與免疫、信號(hào)傳導(dǎo)、病毒相關(guān)的多種通路，立足于神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)，具有良好的抗炎、調(diào)節(jié)免疫、修復(fù)血腦屏障的作用。但本研究尚存在一些不足之處，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中也需要進(jìn)一步驗(yàn)證黃精－枸杞藥對(duì)治療糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的有效靶點(diǎn)和通路，以便更好地進(jìn)行對(duì)疾病的防治工作。