不同炮制品組方的補陽還五湯抗大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的比較研究

李衛(wèi)先，李達

（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南 株洲 412012)

腦缺血再灌注損傷是指腦缺血恢復(fù)血液灌流之后，缺血區(qū)出現(xiàn)由血流再通所致的一系列病理損傷過程，其致死率和致殘率高，是危害人類健康的重要疾病之一。補陽還五湯是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)立的益氣活血名方，是目前治療腦缺血病應(yīng)用最多的方劑［1］，全方由黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等7味中藥組成。該方具有良好的抗腦缺血損傷作用。方中黃芪有生黃芪、蜜黃芪，當歸、赤芍、川芎、地龍等藥除有生品外，還有酒制品等炮制品，但原方并未闡明方中各藥所用的具體炮制品。各飲片在方中炮制品的選擇是本方療效發(fā)揮的關(guān)鍵問題，因此找出特定藥效條件下的補陽還五湯中黃芪、當歸、赤芍、川芎、地龍所應(yīng)運用的具體炮制品，并對其抗腦缺血損傷作用進行比較研究，為臨床上該方防治缺血性腦血管疾病提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物成年健康清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量250～320 g，均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心代購。

1.2 藥物與試劑實驗所用藥材黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等均由湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬一醫(yī)院提供，按《中國藥典》 （2020一部)鑒定為合格藥材。硫酸氫氯吡格雷片（75 mg/片)，由賽諾菲制藥有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 樣品的分組及提取

2.1.1 樣品的分組 補陽還五湯按《方劑學(xué)》教材規(guī)定的劑量稱取。各藥用量為：黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍4.5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g，水煎液。方劑1組：各組成成分均為生品組方的補陽還五湯；方劑2組：黃芪蜜炙，當歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙，其他藥物均為生品組方的補陽還五湯；方劑3組：黃芪蜜炙，其他藥物均為生品組方的補陽還五湯；方劑4組：當歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙，其他藥物均為生品組方的補陽還五湯。

2.1.2 樣品的提取 以上各組按量稱取各藥后常溫（25℃)加蒸餾水2 000 mL浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min過濾藥液，藥渣加1 000 mL蒸餾水再煎煮25 min，合并兩次濾液，濃縮至補陽還五湯約2.0 g/mL，放入4℃冰箱備用。

2.2 腦缺血再灌注模型制備腦缺血再灌注模型制備［2］按以下方法：給藥2周后大鼠不禁水禁食12 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠（0.3 mL/100 g)，頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總動脈（CCA)、左頸內(nèi)動脈（ICA)和左頸外動脈（ECA)，用微血管夾將頸總動脈在近分叉處夾閉，將直徑0.2 mm涂有硅酮的尼龍線從頸外動脈插入至頸內(nèi)動脈遠端，阻斷大腦中動脈血流，然后將微血管夾取掉，將頸外動脈結(jié)扎，使大鼠腦缺血（判斷遠端結(jié)扎無血流的方法：大鼠臉呈蒼白色，瞳孔放大，翻正反射消失，說明產(chǎn)生前腦缺血)，留約1 cm的線頭在外側(cè)，于缺血2 h時輕提尼龍線，使其球端回至頸外動脈內(nèi)，即可恢復(fù)大腦中動脈（MCA)血供。假手術(shù)組ICA不插線栓，僅分離血管。以上過程均在室溫恒定（24℃～25℃)情況下進行，以利于評價腦缺血情況。

2.3 分組與給藥將大鼠隨機分為7組，每組25只。即假手術(shù)組、模型組、氫氯吡格雷組以及不同炮制品組方的補陽還五湯方劑1、2、3、4組。適應(yīng)性飼養(yǎng)各組大鼠1周后，參照動物與人體等效換算標準換算［3］，給予相應(yīng)的藥物。方劑組按13 g·kg-1·d-1量灌胃，氫氯吡格雷組給予0.68 mg/mL氫氯吡格雷水溶液灌胃，模型組與假手術(shù)組均給予等量生理鹽水灌胃，每天2次，連續(xù)2周。

2.4 大鼠實驗性腦缺血行為評分法造模24 h后，參考Zea Longa的5級4分評分法評估大鼠腦神經(jīng)功能損傷，觀察大鼠四肢的活動能力及反應(yīng)能力并進行評分（評分標準：無神經(jīng)病學(xué)征象記為0分，提尾時病灶對側(cè)前肢不能完全伸直為1分，向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分，向病灶對側(cè)跌倒為3分，無自發(fā)活動及意識障礙為4分)，正常評分為0分，最高評分為4分。積分越高說明動物行為障礙越嚴重。

2.5 血清各指標的測定

2.5.1 ELISA法檢測血清PAF、CD62p、CD63含量 大鼠麻醉后用普通真空管腹主動脈取血約10 mL，3 000 r/min，離心30 min，吸取上層血清，置于-80℃冰箱備測。采用酶聯(lián)免疫定量檢測技術(shù)檢測大鼠血清PAF、CD62p、CD63含量。操作過程嚴格按照說明書進行。

2.5.2 檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平和LDH活性 按上述方法取血清，ELISA法檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平；按試劑盒方法測定血清MDA水平及LDH活性［4］，具體步驟嚴格參照試劑盒說明書操作。

2.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包中One-Way ANOVA進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。方法以均數(shù)±標準差（±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組對大鼠神經(jīng)功能缺失癥狀評分及對急性腦缺血再灌注大鼠血清PAF、CD62p、CD63含量的影響表1結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組的所有試驗動物均出現(xiàn)了不同程度的行為障礙，模型組血清PAF、CD62p、CD63表達顯著升高（P＜0.05)；與模型組比較，氫氯吡格雷組與不同炮制品組方的補陽還五湯方劑1、2、3、4組均能顯著抑制血清PAF、CD62p、CD63表達（P＜0.05)，表明補陽還五湯能顯著抑制血小板活化，且各組的效果均強于方劑1組（P＜0.05)，其中方劑2組的效果強于方劑3組、方劑4組、氫氯吡格雷組（P＜0.05)，方劑3組、方劑4組、氫氯吡格雷組間無顯著差異（P＞0.05)。

表1 各組腦缺血再灌注大鼠PAF、CD62p、CD63含量及術(shù)后評分的影響（±s）

表1 各組腦缺血再灌注大鼠PAF、CD62p、CD63含量及術(shù)后評分的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與方劑1組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

組別 n CD63（ng/mL) PAF CD62p 術(shù)后評分（分)假手術(shù)組 25 0.738±0.146 0.012±0.002 0.106±0.015 0模型組 25 1.586±0.253△ 0.215±0.012△ 0.196±0.008△ 3.26±0.48△氫氯吡格雷組 25 0.813±0.167** 0.145±0.014** 0.132±0.021** 2.74±0.51**方劑1組 25 1.316±0.154* 0.171±0.006* 0.162±0.013* 2.68±0.37*方劑2組 25 0.741±0.162**## 0.131±0.011**## 0.116±0.018**## 1.83±0.21**##方劑3組 25 0.923±0.158*# 0.155±0.006*# 0.141±0.006*# 2.43±0.43*#方劑4組 25 0.835±0.138*# 0.142±0.008*# 0.134±0.005*# 2.24±0.28*#

3.2 各組對腦缺血再灌注損傷大鼠血清LDH活性和MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響表2結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組的大鼠血清LDH活性和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著升高（P＜0.01)。與模型組比較，氫氯吡格雷組和不同炮制品組方的補陽還五湯方劑1、2、3、4組均可顯著抑制大鼠血清中LDH活性和MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的升高（P＜0.05，P＜0.01)，且各組的效果均強于方劑1組（P＜0.05)，其中方劑2組的效果強于方劑3組、方劑4組、氫氯吡格雷組（P＜0.05)，方劑3組、方劑4組、氫氯吡格雷組間無顯著差異（P＜0.05)。

表2 各組對腦缺血再灌注大鼠血清LDH、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響（±s）

表2 各組對腦缺血再灌注大鼠血清LDH、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與方劑1組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

組別 n LDH（U/L) MDA（nmol/mL) TNF-α（ng/L) IL-1β（ng/L) IL-6（ng/L)假手術(shù)組 25 2783±274 3.61±1.14 43.4±3.8 22.6±1.3 24.5±1.3模型組 25 4672±512△ 8.76±1.32△ 49.5±4.1△ 31.5±2.2△ 29.7±1.6△氫氯吡格雷組 25 3547±604** 6.54±0.76** 45.7±3.2** 25.8±1.7** 26.3±1.2**方劑1組 25 3563±536* 7.25±1.02* 47.4±2.9* 29.3±1.5* 27.5±2.4*方劑2組 25 2935±328**## 5.37±0.87**## 43.6±2.1**## 23.1±0.8**## 25.1±1.8**##方劑3組 25 3272±457*# 6.83±0.53*# 46.1±3.4*# 27.4±2.3*# 26.8±2.1*#方劑4組 25 3161±388*# 6.57±0.91*# 45.6±2.5*# 26.1±1.6*# 26.6±1.9*#

4 討論

腦缺血后的再灌注是神經(jīng)功能恢復(fù)的基本條件，但也會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞和微血管損傷，由于腦組織急性缺血缺氧產(chǎn)生大量的自由基，與腦組織細胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，釋放大量的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA、LDH及炎性因子和細胞凋亡因子［5-6］，從而使腦組織損傷進一步加重，造成嚴重的遲發(fā)性神經(jīng)功能損害［7］。TNF-α具有增加血管內(nèi)皮細胞的通透性，誘導(dǎo)細胞黏附因子表達等作用，在腦缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是腦梗死形成的主要原因。IL-1β是一種內(nèi)源性致熱源，其表達升高可以通過刺激內(nèi)皮細胞表達白細胞粘附分子，使白細胞聚集在缺血腦組織，加重腦缺血再灌注損傷程度。IL-6參與機體免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)，是急性缺血期腦損傷程度的一個標志［8］。本研究中，模型大鼠的血清LDH活性、MDA以及NF-α、IL-1β和IL-6相關(guān)細胞因子水平均升高，表明腦缺血后誘導(dǎo)模型大鼠炎性細胞因子的分泌和表達，引起缺血后炎性反應(yīng)。不同炮制品組方的補陽還五湯均可不同程度改善大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能癥狀，并顯著抑制大鼠血清LDH活性的升高，降低血清MDA和TNF-α、IL-1β、IL-6水平，且各組均優(yōu)于方劑1組（生品組)，其中黃芪蜜炙，當歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙組方的補陽還五湯組抑制作用更顯著。

PAF和CD62p、CD63均可促進血小板的活化和聚集，腦缺血再灌注時PAF和CD62p、CD63大量釋放，促進血小板聚集并觸發(fā)炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)血栓形成，加重腦缺血對神經(jīng)元造成的損傷。本研究結(jié)果顯示，不同炮制品組方的補陽還五湯均可不同程度降低血清PAF和CD62p、CD63表達水平，且各組均優(yōu)于方劑1組（生品組)，其中黃芪蜜炙，當歸、赤芍，川芎、地龍均酒炙組方的補陽還五湯組降低作用更顯著。

綜合文獻報道及本研究，補陽還五湯組方中黃芪用蜜炙品，當歸、赤芍，川芎、地龍均用酒炙品，抗腦缺血再灌注損傷的保護作用最顯著，這與文獻中記載的黃芪蜜炙可增強免疫功能、抗氧化、增加冠脈流量對心功能起到保護作用，當歸、赤芍、川芎、地龍酒炙能增強活血通絡(luò)、溶血栓、抗炎、止痛作用是一致的，其機制與抑制血小板活化、抑制炎性因子分泌和表達及減輕腦組織炎性反應(yīng)有關(guān)。