抗增殖蛋白1對絕經(jīng)后大鼠成骨細胞分化的影響及機制研究

陳灼均，張瑜生，蒙英，肖徳乾，周志昆

（廣東醫(yī)科大學，廣東 東莞 523000)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP)是常見于中老年婦女的一種代謝性骨病，婦女絕經(jīng)后卵巢功能減退，雌激素水平急劇下降后導致骨骼微環(huán)境紊亂，表現(xiàn)為骨量降低、骨微結(jié)構(gòu)破壞，致骨脆性增加，易發(fā)生骨折［1］。成骨細胞（OB)是骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要細胞，OB具有多種功能蛋白，如堿性磷酸酶（ALP)、骨橋蛋白（OPN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2)等以維持骨骼的結(jié)構(gòu)［2］。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)是一種脂類激酶，根據(jù)其亞基結(jié)構(gòu)及底物的特異性，可分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性［3］。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，以PI3K依賴的形式被細胞外因子磷酸化和激活。AKT有3種亞型，分別是AKT1、AKT2、AKT3，AKT1和AKT2在成骨細胞中高度表達［4-5］?？乖鲋车鞍字饕蠵HB1和PHB2兩種亞型，都屬于SPFH（stomatin/prohibitin/flotillin/HflKC)蛋白家族，具有高度保守性，它參與多種細胞功能，包括能量代謝、增殖、凋亡和衰老［6］等。本課題組前期研究［7］表明OB經(jīng)黃芪三仙湯含藥血清干預后，可引起PMOP大鼠成骨細胞的蛋白差異表達，以PHB1最為顯著，本研究探討PHB1對絕經(jīng)后成骨細胞增殖分化的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物實驗所用動物為清潔級3月齡雌性SD大鼠60只，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供［動物許可證號：SCXK（粵)2013-0034］。

1.2 儀器、藥物與試劑Annexin V-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白測定試劑盒購于上海博彩生物科技有限公司；重組腺病毒購于賽業(yè)蘇州生物科技有限公司；低速離心機購于上海托莫斯科學儀器有限公司；多功能酶標儀購于美國Bio-Rad公司；顯微鏡購于重慶奧特光學儀器有限公司；細胞恒溫培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司。

1.3 PMOP模型建立、成骨細胞提取和原代培養(yǎng)將SPF級的SD雌性大鼠進行呼吸麻醉和消毒，進行背部切口切除雙側(cè)卵巢，手術(shù)后大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。用酶消化法從大鼠的顱骨中提取成骨細胞，將細胞培養(yǎng)在含有15%胎牛血清（FBS)和1%青霉素-鏈霉素溶液的α-MEM培養(yǎng)基中，在95%空氣、5%CO2、37℃的條件下進行培養(yǎng)。將第三代成骨細胞種植在相應的孔板中，待細胞密度增殖到60%后進行相應的操作。將PMOP OB（10×104)接種于6孔板中，待細胞貼壁穩(wěn)定后，PMOPOB分組如下：①空白組；②過表達PHB1組；③沉默PHB1組。

1.4 腺病毒載體的建立及感染通過PCR拼裝成PHB1基因，而后進行構(gòu)建腺病毒載體、包裝、滴度測定以及感染成骨細胞。腺病毒感染成骨細胞程序：①腺病毒轉(zhuǎn)染前18～24 h，每個孔細胞的數(shù)量為2×105左右；②第二天更換培養(yǎng)基，并加入適量病毒懸液于37℃孵育；③6 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)基，48 h后可見明顯熒光表達。

1.5 堿性磷酸酶染色分析將2.5×104個第三代正常OB接種培養(yǎng)于24孔板中，在5%CO2，37℃條件下待細胞密度增殖到60%更換培養(yǎng)基，過表達PHB1組、沉默PHB1組分別用過表達PHB1腺病毒、低表達PHB1腺病毒感染PMOPOB，空白對照組不做感染處理。24 h后更換新鮮15%胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后進行ALP染色。用BCIP/NBT法進行堿性磷酸酶染色，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞表面，向每孔內(nèi)加入固定液固定2 min后，加入染色液在室溫下避光孵育30 min，PBS清洗2 min，觀察并拍照，肉眼可見藍紫色顆粒沉淀即為成骨細胞發(fā)生分化。

1.6 成骨細胞礦化實驗將2.5×104個第三代正常OB接種培養(yǎng)于24孔板中，在5%CO2，37℃條件下待細胞密度增殖到60%更換培養(yǎng)基，過表達PHB1組、沉默PHB1組分別用過表達PHB1腺病毒、低表達PHB1腺病毒感染PMOPOB，空白對照組不做感染處理。24 h后，更換新鮮15%胎牛血清培養(yǎng)液，并加入礦化誘導液。培養(yǎng)28天，直至顯微鏡下觀察出有砂質(zhì)狀的礦化結(jié)節(jié)分布，此時用0.1%茜素紅S染色液對細胞進行染色，后用酶標儀測定礦化鈣離子濃度，期間每隔兩天半量換液，最后用顯微鏡拍照記錄。

1.7 蛋白免疫印跡法取生長狀態(tài)良好的第3代PMOPOB接種于6 cm培養(yǎng)皿中，在完全α-MEM中培養(yǎng)至90%融合，過表達PHB1組和沉默PHB1組均加入礦化誘導液，分別誘導1、2、3、4、5 d，空白對照組加入完全α-MEM培養(yǎng)液，每組3個復孔。按PMSF∶RIPA=1∶100比例配置裂解液裂解各組細胞，收集，4℃下12 000轉(zhuǎn)離心取上清液，BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度后進行蛋白變性。采用SDSPAGE完成蛋白質(zhì)電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫下封閉1 h，加一抗4℃下孵育過夜，TBST洗膜，加二抗室溫孵育1 h，再次TBST洗膜，用ECL發(fā)光試劑顯色，轉(zhuǎn)至暗室中壓片，洗片，晾干，用掃描儀掃描圖像，計算機中進行灰度分析，以檢測各組細胞PHB1、RUNX2、OPN、PI3K/AKT蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差（±s)表示，組間比較采用單因素的方差分析（one-way ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PMOP OB堿性磷酸酶染色及茜素紅S染色鑒定PMOP OB經(jīng)堿性磷酸酶染色后，在倒置顯微鏡下觀察，幾乎所有細胞的細胞質(zhì)、細胞膜及周圍均有藍紫色的細微顆?；蚱瑺畛恋?，表明成骨細胞純度很高。PMOPOB培養(yǎng)25天后，由茜素紅S染色鑒定均出現(xiàn)礦化結(jié)節(jié)。見圖1（20×)。

圖1 PMOP OB的堿性磷酸酶染色（A）和茜素紅S染色鑒定（B）

2.2 重組腺病毒的載體構(gòu)建及感染成骨細胞重組腺病毒的載體構(gòu)建基因合成：www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/檢索rPHB1基因序列，將化學合成的DNA Oligo通過PCR的方法拼裝成PHB1基因。腺病毒表達載體由賽業(yè)生物科技有限公司完成?？瞻捉M：pAV[Exp]-CMV＞EGFP；過表達組：pAV[Exp]-CMV＞rPHB1：T2A：mCherr；空白組：AV-U6＞Scramble-shRNAPGK＞EGFP；沉默組：AV-U6＞Rat Phb[shRNA]-PGK＞EGFP。當感染復數(shù)為200時，成骨細胞絕大部分都顯示出了明顯熒光。感染復數(shù)為400時，雖然熒光強度大，但是可以看到飄散的死細胞，推測感染復數(shù)過大對細胞活性產(chǎn)生的影響，因此選用感染復數(shù)為200的腺病毒濃度用于接下來的研究。

2.3 PHB1在PMOP OB內(nèi)的表達PMOPOB按最佳的重組腺病毒感染條件感染，將PMOPOB（10×104)接種于6孔板中，待細胞貼壁穩(wěn)定后將PMOPOB分組：①用AdCMV-EGFP感染的空白組；②用AdCMV-PHB1感染的過表達PHB1組；③用AdPGK-PHB1感染的沉默PHB1組；培養(yǎng)至24 h使細胞匯合率達50%時進行重組腺病毒感染。Western Blot結(jié)果顯示PHB1在過表達PHB1組中高表達，在沉默PHB1組中低表達。見圖2。

圖2 PMOP OB中PHB1的蛋白表達

2.4 PHB1對PMOP OB分化及礦化的影響 用腺病毒感染PMOP OB，觀察PHB1過表達和沉默表達后對PMOP OB分化及礦化的影響。與空白組相比，ALP活性和染色的結(jié)果顯示過表達PHB1組顯著抑制成骨細胞的分化，而沉默PHB1組的染色強度高于空白組，可促進成骨細胞的分化。過表達PHB1組顯著抑制PMOP OB的礦化作用，而沉默PHB1組的染色顏色較深，同時，28天后鈣結(jié)節(jié)溶解，沉默PHB1組鈣離子濃度高于空白組。見圖3。

圖3 PHB1對PMOP OB分化和礦化的影響

2.5 PHB1對成骨礦化相關(guān)蛋白的影響通過蛋白質(zhì)印跡試驗檢測過表達和沉默表達PHB1基因后OPN和RUNX2蛋白的表達量。過表達PHB1基因后，PMOPOB中OPN和RUNX2的蛋白表達量下調(diào)，與空白組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。PHB1沉默表達后，PMOP OB的OPN和RUNX2蛋白表達量上調(diào)，與空白組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。見圖4。

圖4 Western Blot檢測PHB1對OPN、RUNX2表達的影響

2.6 PHB1對PI3K/AKT信號通路的影響過表達PHB1組中p-AKT/AKT的相對表達量降低，而沉默PHB1組中p-AKT/AKT的相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)。見圖5。

圖5 Western Blot檢測p-AKT/AKT的蛋白相對表達

3 討論

成骨細胞的分化受多種調(diào)控因子的調(diào)控，在前期快速表達骨橋蛋白（RUNX2)，同時也誘導Sp7的表達，進一步共同參與了OB的成熟，為OB接下來的礦化做準備。而OB的后期，OB的增殖減慢，堿性磷酸酶（ALP)高度表達，隨著OB的成熟而達到表達高峰，ALP可促進OB的礦化。后期成熟OB高度表達骨橋蛋白（OPN)、骨鈣素（OCN)等，促進OB的礦化能力［8］。因此，OPN、RUNX2均是檢測OB活性的良好蛋白指標。PI3K是一類脂類激酶，能整合生長因子、細胞因子和其他環(huán)境信號，將其轉(zhuǎn)化為能調(diào)節(jié)多種信號通路的細胞內(nèi)信號。藥物在改善PMOP模型的骨密度和股骨干骺端的骨小梁微觀結(jié)構(gòu)同時，PI3K、AKT和RUNX2的蛋白表達量上升［9］。因此，PI3K/AKT信號通路在抗骨質(zhì)疏松的機制中發(fā)揮重要作用。本研究構(gòu)建PMOP大鼠模型并提取PMOPOB，通過構(gòu)建PHB1過表達和低表達模型分析PHB1對PMOP OB分化的影響及可能機制。在分化和礦化實驗中，PHB1過表達導致了PMOPOB分化和礦化程度降低，而PHB1低表達導致了PMOP OB分化和礦化程度升高。在Western Blot試驗中，當PHB1過表達時，OPN、RUNX2和p-AKT/AKT蛋白表達量下降，而PHB1低表達時結(jié)果相反。因此，PHB1對PMOPOB分化和礦化過程具有一定的負調(diào)節(jié)作用，從而導致PMOPOB分化和礦化程度降低，且這種負調(diào)節(jié)作用依賴于PHB1對PI3K/AKT通路的負反饋調(diào)節(jié)。綜上所述，PHB1負調(diào)控大鼠PMOPOB的成骨分化，其通過負反饋調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路從而抑制PMOP OB的成骨分化，PHB1有望成為骨質(zhì)疏松研究的新靶點。