CRISPR/Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)大鼠Inhba 基因的編輯

趙為民，涂楓，王澤平，程金花，付言峰，李碧俠，任守文*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014；2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；4.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院宿遷農(nóng)科所，江蘇，宿遷 223800)

Inhba基因是構(gòu)成轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β 超家族成員激活素和抑制素的亞基單位，可通過自分泌和旁分泌的形式調(diào)控卵泡的生長發(fā)育及促卵泡激素(FSH)與促黃體素(LH)的生成[1-3]。研究[4-5]報(bào)道Inhba基因的表達(dá)量和多態(tài)與羊的產(chǎn)仔數(shù)性狀緊密相關(guān)，可能是控制山羊高繁殖力性狀的主效基因。因而，深入解析Inhba基因的功能可為進(jìn)一步利用Inhba基因在家畜上的育種價(jià)值提供依據(jù)。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌為抵抗外源病毒入侵所進(jìn)化的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)。它通過小段RNA(sgRNA)與宿主DNA 識(shí)別并借助Cas9核酸酶對(duì)基因進(jìn)行高效的靶向編輯[6-7]。相比于傳統(tǒng)的同源打靶、ZFN 和TALEN 等基因編輯方法，以CRISPR/Cas9 系統(tǒng)為代表的編輯系統(tǒng)使用高效簡便，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及動(dòng)物、植物育種等領(lǐng)域。研究[8-15]表明，在高等生物(人、動(dòng)物、植物)中，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)相繼對(duì)人、小鼠、斑馬魚、水稻、煙草、油菜的基因都進(jìn)行了有效的編輯，成為疾病治療、基因功能研究與培育新品種的重要工具。

大鼠作為模式動(dòng)物在基因功能研究方面起著重要作用。本研究中，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)來篩選驗(yàn)證針對(duì)Inhba基因有效的sgRNA，旨在為后續(xù)制作個(gè)體水平的Inhba基因敲除大鼠，深入解析Inhba基因在卵泡發(fā)育的分子機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

Trans5α 感受態(tài)菌株購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；大鼠L6 細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；PX330 載體由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

DNA 提取試劑盒購于北京擎科生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶BbsⅠ、T7E1 酶購于NEB；T4 連接酶、DNA Marker、DNA 聚合酶PrimerSTAR Max Premix 購于 Takara；pEASY-Blunt Simple Cloning kit 購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒購于康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA 純化回收試劑盒購于Zymo Research；DMEM 培養(yǎng)基購于武漢博士德生物工程有限公司；青鏈霉素、胎牛血清、opti-MEM 和Lipofectamine?3000 購于Thermo Fisher。

1.3 Inhba 基因的sgRNA 設(shè)計(jì)

在NCBI登錄號(hào)為NM_017128的序列中提取大鼠Inhba基因mRNA序列的編碼區(qū)，運(yùn)用在線軟件(http://chopchop.cbu.uib.no/)設(shè)計(jì)sgRNA靶標(biāo)位點(diǎn)[16]。首先考慮Off-targets指標(biāo)，選取的sgRNA序列位點(diǎn)盡量沒有Off-targets所述的0、1、2、3錯(cuò)配類型；然后考慮Efficiency(＞50%)的sgRNA，最后綜合Selfcomplementarity(數(shù)值盡量為0)和GC含量(40%～60%)篩選sgRNA-inhba序列。

1.4 PX330-Inhba-sgRNA 質(zhì)粒構(gòu)建

按照sgRNA-Inhba 的序列合成反向互補(bǔ)的單鏈寡核苷酸sgRNA-Inhba-F 和sgRNA-Inhba-R，并在sgRNA-Inhba-F的5′端添加CACC，在sgRNAInhba-R 的5′端添加AAAC。通過95 ℃變性5 min，室溫冷卻，將sgRNA-Inhba-F 和sgRNA-Inhba-R退火互補(bǔ)。采用BbsⅠ酶切px330 載體，瓊脂糖凝膠回收純化后與退火的寡核苷酸連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans5α 的感受態(tài)細(xì)胞中，挑取LB 培養(yǎng)基平板上生長的單克隆菌落送至北京擎科生物科技有限公司測序驗(yàn)證，測序正確的菌液進(jìn)行擴(kuò)增后提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

將大鼠L6 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)，每2 d 換1 次培養(yǎng)液，匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化與傳代。

轉(zhuǎn)染前1 d 將L6 細(xì)胞鋪在12 孔板中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine?3000 說明書的方法進(jìn)行。在EP 管中，用opti-MEM 稀釋PX330-sgRNA-Inhba質(zhì)粒和P3000TM，充分混勻；另一EP 管中，用opti-MEM 稀釋Lipofectamine?3000，將2 管充分混勻，于室溫下放置15 min，滴加入細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.6 基因編輯驗(yàn)證

提取轉(zhuǎn)染 PX330-sgRNA-Inhba(試驗(yàn)組)與PX330 載體(對(duì)照組)的細(xì)胞DNA，通過PCR 擴(kuò)增基因編輯區(qū)域，引物分別為5′-GACTTTTGCTGCCA GGATGC-3′(F)、5′-CGCCACCATCACCACCTAA-3′(R)，擴(kuò)增大小為536 bp。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR 擴(kuò)增體系：Mix 10 μL，F(xiàn)、R 引物各0.5 μL，DNA 1 μL，用ddH2O 補(bǔ)齊至20 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸1 min。

回收純化PCR 產(chǎn)物后，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行梯度變性，程序?yàn)椋?5 ℃變性5 min；95～85 ℃，每秒降低2 ℃；85～25 ℃，每秒降低0.1 ℃。利用T7E1酶切PCR 產(chǎn)物，酶切反應(yīng)體系為10.5 μL 上述PCR產(chǎn)物加0.5 μL T7E1，37 ℃反應(yīng)30 min。酶切產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳顯帶。

將擴(kuò)增轉(zhuǎn)染PX330-sgRNA-Inhba(試驗(yàn)組)和PX330 載體(對(duì)照組)的 PCR 回收純化產(chǎn)物與pEASY-Blunt Simple Cloning kit 載體進(jìn)行連接，體系為1 μL pEASY-Blunt 載體加4 μL PCR 產(chǎn)物，25 ℃反應(yīng)10 min。將此5 μL 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans5α 的感受態(tài)細(xì)胞中，隨機(jī)挑選20 個(gè)克隆送至北京擎科生物科技有限公司測序，并計(jì)算有序列突變的克隆數(shù)占總克隆數(shù)的比例，從而估算 pX330-InhbasgRNA-2 載體對(duì)Inhba基因的切割效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 Inhba 基因的sgRNA 序列

Inhba基因位于17號(hào)染色體的反義鏈，有3個(gè)外顯子，第一外顯子較短，僅為57 bp，并且不編碼蛋白，因此，不考慮此外顯子；考慮到盡量在基因的前中部進(jìn)行基因編輯，以此達(dá)到敲除基因的目的，在Inhba基因的第二外顯子設(shè)計(jì)sgRNA(圖1)。序列為：GGCAAAGGTGATGATCTCCGAGG，PAM為AGG。此sgRNA位于17號(hào)染色體，GC含量為57%，在Off-target 0、1、2、3的參數(shù)上均為0，預(yù)期切割效率為57%，符合預(yù)期要求。

圖1 Inhba基因的sgRNA位置Fig.1 Schematic diagram of the sgRNA location in the Inhba gene

2.2 L6 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

圖2-a 顯示了大鼠L6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的明場狀態(tài)；圖2-b 顯示了L6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后呈現(xiàn)的綠色熒光。對(duì)比明場狀態(tài)，L6 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，可用于PX330- Inhba-sgRNA 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染與后續(xù)分析。

圖2 大鼠L6 細(xì)胞的pEGFP-N1 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證結(jié)果Fig.2 Verification result of pEGFP-N1 transfection efficiency in L6 cells of rat

2.3 PX330-Inhba-sgRNA 的T7E1 切割驗(yàn)證

從圖3 可知，試驗(yàn)組536 bp 的產(chǎn)物被切割為大約386 bp 和150 bp 的條帶，出現(xiàn)了預(yù)期的切割條帶；陰性對(duì)照組沒有切割出條帶。

圖3 PX330-Inhba-sgRNA 切割效率的T7E1 驗(yàn)證結(jié)果Fig.3 Verification result of PX330-Inhba-sgRNA cleavage efficiency by T7E1

2.4 PX330-Inhba-sgRNA 的切割效率

將pX330-Inbha-sgRNA(試驗(yàn)組)的Inhba基因的編輯區(qū)域PCR產(chǎn)物連接T載體后，隨機(jī)選取20個(gè)單克隆測序，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)克隆在預(yù)期切割位點(diǎn)附近出現(xiàn)不同長度的堿基缺失(圖4)，其中1個(gè)克隆缺失了6個(gè)堿基，是3的整數(shù)倍，其余的分別缺失2、5和13 個(gè)堿基。估測pX330-Inbha-sgRNA 載體利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在細(xì)胞水平上對(duì)Inhba基因的切割效率為25%。

圖4 PX330-Inhba-sgRNA 切割效率的克隆測序結(jié)果Fig.4 Cloning sequencing result of PX330-Inhba-sgRNA cleavage efficiency

3 結(jié)論與討論

sgRNA 本身較短，長度僅約20 bp，在基因組上容易匹配到多個(gè)位置，從而造成脫靶效應(yīng)[17]。本研究中，選取的sgRNA 序列位點(diǎn)的Off-targets 所述的0、1、2、3 錯(cuò)配類型都為0，而0、1、2、3分別代表在基因組上的錯(cuò)配0～3 個(gè)堿基數(shù)量的sgRNA 個(gè)數(shù)，說明選取的sgRNA 靶標(biāo)位點(diǎn)在大鼠基因組上高度特異。研究[18]表明，sgRNA 在錯(cuò)配多個(gè)堿基的情況下其切割效率很低，本研究的Inhba-sgRNA 在脫靶性上也非常低。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中的sgRNA 引導(dǎo)Cas9 核酸酶在基因組DNA 的靶標(biāo)位點(diǎn)上對(duì)靶基因進(jìn)行DNA鏈切割后，往往會(huì)優(yōu)先啟動(dòng)非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)DNA 片段，從而在切割位點(diǎn)伴隨著堿基對(duì)的隨機(jī)插入或缺失[19]，造成該基因翻譯的移碼或提前終止，達(dá)到敲除基因的目的。本研究中，針對(duì)Inhba第二外顯子設(shè)計(jì)的sgRNA，首先通過T7E1 驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)T7EI 對(duì)基因編輯區(qū)域的PCR 產(chǎn)物能切割出預(yù)期條帶，說明設(shè)計(jì)的sgRNA 是有效的；另一方面通過T 載體克隆測序發(fā)現(xiàn)有5 個(gè)克隆在預(yù)期切割位點(diǎn)附近出現(xiàn)不同長度的堿基缺失，表明sgRNA 成功編輯了Inhba基因的第二外顯子。在編輯的類型中，除了其中1 個(gè)克隆是缺失了3 的整數(shù)倍堿基，其余的缺失2、5 和13 個(gè)堿基，導(dǎo)致Inhba基因的翻譯出現(xiàn)移碼，從而造成該基因功能異常和缺失。綜上可知，本研究中，篩選的Inhba-sgRNA 能有效的編輯Inhba基因，該sgRNA 能為后續(xù)制作個(gè)體水平的Inhba基因敲除大鼠提供依據(jù)。