熒光染色法在淺部皮膚真菌病診斷中的應(yīng)用

王喜英，孟 健，王 健，穆雅琴，張海燕，白光梅，薛 敏

（山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009）

淺部皮膚真菌病是由真菌侵犯皮膚表皮、毛發(fā)和指（趾）甲引起的傳染性疾病，包括頭癬、體癬、股癬、手足癬、甲癬、花斑癬等。臨床用于真菌檢測(cè)的方法包括直接鏡檢、分離培養(yǎng)和免疫學(xué)檢查等方法[1]。其中直接鏡檢法是淺部皮膚真菌形態(tài)學(xué)檢查的基本方法，常規(guī)采用KOH 濕片法和熒光染色法觀察標(biāo)本中有無(wú)真菌有形成分，這種方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快速，對(duì)臨床有較好的指導(dǎo)意義[2]。

KOH 濕片法，一般采用1.78 mol/L KOH 溶液制片，是臨床上用于真菌感染快速診斷最主要的方法。KOH 溶液能夠溶解人體細(xì)胞，但對(duì)真菌無(wú)染色強(qiáng)化作用，因此需要操作者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判讀結(jié)果。因其敏感性和特異性不高，對(duì)臨床檢驗(yàn)技術(shù)人員要求較高，容易出現(xiàn)漏診或誤診的情況。熒光染色法是利用細(xì)胞熒光素可以與真菌細(xì)胞壁的1,3-β-D 葡聚糖結(jié)合的原理，進(jìn)而通過(guò)熒光標(biāo)記進(jìn)行真菌檢測(cè)[3]。特殊熒光素標(biāo)聯(lián)的重組幾丁質(zhì)酶與真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)以高親和力的方式結(jié)合從而產(chǎn)生熒光標(biāo)記，在熒光顯微鏡下可以清楚地觀察到真菌形態(tài)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用萊芙特敏真菌熒光染色液對(duì)臨床疑似真菌感染的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并與KOH濕片法相比較，探討熒光染色法在淺部真菌感染中的優(yōu)勢(shì)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

標(biāo)本選自于2017 年7 月-2019 年7 月大同市第三人民醫(yī)院皮膚科門(mén)診就診的疑似淺部真菌感染的患者，共553 例。其中手足部位157 例，指（趾）甲部位200例，體股部位146例，頭面部50例。同時(shí)采用2種方法檢測(cè)。

1.2 材料

10% KOH 溶液（實(shí)驗(yàn)室自配），萊芙特敏真菌熒光染色液（江蘇萊芙時(shí)代生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 取材

75%酒精消毒患處，每例取2 份標(biāo)本，分別用于KOH 濕片法和熒光染色法。皮損處取皮損邊緣皮屑；指（趾）甲取靠近病甲甲床的甲屑；頭癬取病發(fā)及其周?chē)ば肌?/p>

1.3.2 KOH濕片法

采集各種標(biāo)本置于載玻片中央，滴加10% KOH溶液一滴；蓋上蓋玻片，在火焰上方輕微加溫，使標(biāo)本溶解后，輕壓蓋玻片吸出多余液體，置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.3 熒光染色法

將適量標(biāo)本置于載玻片上，滴加熒光色液一滴，蓋上蓋玻片，輕壓吸出多余液體，置于熒光生物顯微鏡（Olympns L3201）下觀察，高倍鏡下采集圖像。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS24 軟件進(jìn)行χ2檢測(cè)；P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)553 例患者的標(biāo)本分別用KOH 濕片法和熒光染色法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，2 種方法均可觀察到長(zhǎng)短不等的菌絲，或筆直或纏繞或折疊或呈串珠狀排列。二者比較，KOH 濕片法中背景雜亂，真菌與背景的角質(zhì)細(xì)胞反差比較小，鏡下成像清晰度不高，不易觀察（圖1A）；熒光染色法中真菌被熒光標(biāo)記，與背景相差大，可在顯微鏡下觀察到清晰的藍(lán)色菌絲、橫隔結(jié)構(gòu)以及孢子的出芽狀態(tài)（圖1B）。

圖1 KOH濕片法（A）和熒光染色法（B）的真菌鏡檢結(jié)果

統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表1）表明：553 例臨床可疑標(biāo)本中，KOH 濕片法共檢出362 例（66.5%）陽(yáng)性標(biāo)本，其中手足部114 例（72.6%），體股部106 例（86.3%），頭面部30 例（60.0%），甲部112 例（56.0%）；熒光染色法共檢出472 例（85.4%）陽(yáng)性標(biāo)本，其中手足部140 例（89.2%），體股部140例（95.9%），頭面部38 例（76.0%），甲部154 例（77.0%）；在2 種方法的比較中，熒光染色法的總陽(yáng)性率（85.4%）明顯高于KOH 濕片法（65.5%），χ2=0.0001，P＜0.05。不同部位的陽(yáng)性檢出率，熒光染色法均高于KOH 濕片法。其中手足部、體股部、甲部?jī)烧弑容^，均P＜0.05；頭面部?jī)烧弑容^，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩種方法在不同部位標(biāo)本真菌鏡檢結(jié)果比較

3 討論

KOH 濕片法是最早使用的一種直接鏡檢法，該法操作簡(jiǎn)單，技術(shù)要求低，無(wú)需特殊儀器。但是由于標(biāo)本中雜質(zhì)較多，背景雜亂，導(dǎo)致陽(yáng)性檢出率較低，主要根據(jù)真菌形態(tài)，技術(shù)員的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判定，結(jié)果受個(gè)人主觀因素影響較大。如：易把細(xì)胞壁、纖維誤認(rèn)為菌絲，把氣泡、油滴誤認(rèn)為孢子；易漏檢存在的菌絲或孢子。

熒光染色體法使用特殊的熒光染料與真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和纖維素特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡特定的激光光波段下（340～ 380 nm）菌絲和孢子發(fā)出明亮的藍(lán)綠色熒光，與黑暗背景形成強(qiáng)烈對(duì)比，易于觀察。熒光素與幾丁質(zhì)親和力高，反應(yīng)僅需數(shù)十秒即可完成，而且熒光染色液中含有9.5%的KOH，易于溶解角質(zhì)，使組織透明，提高臨床檢查的靈敏度和效率[5]。

甲癬是實(shí)驗(yàn)室真菌鏡檢的難點(diǎn)，因?yàn)槠錁?biāo)本的背景較厚，并且真菌與背景反差小，結(jié)構(gòu)不易觀察和分辨，容易出現(xiàn)漏診。而熒光染色法，背景及雜質(zhì)為黑色，易于觀察，大大提高了甲癬的檢出率，值得推廣。本實(shí)驗(yàn)中頭面部標(biāo)本的兩種方法比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能是例數(shù)較少，標(biāo)本背景較干凈，菌絲和孢子較多。

通過(guò)KOH 濕片法與熒光染色法的對(duì)比研究表明，對(duì)于真菌直接鏡檢，熒光染色法是一種快速、高效、準(zhǔn)確診斷淺部真菌感染的方法，這一結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是相一致的[2-7]。