深圳市光明區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因型分布特征及其與利福平耐藥基因突變形成的相關(guān)性

李好文，葉國(guó)蒼，陳 川

（中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院<光明>結(jié)核門診 廣東 深圳 518000）

危害人類健康傳染病中結(jié)核病占據(jù)前位，為全球關(guān)注公共衛(wèi)生社會(huì)問(wèn)題，為國(guó)內(nèi)重點(diǎn)控制重大疾病。我國(guó)每年新發(fā)結(jié)核患者人數(shù)為130 萬(wàn)，僅次于印度，位居全球第2 位，為社會(huì)造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界中有1/3 結(jié)核病為北京基因型結(jié)核分枝桿菌引起[3-4]。作為一類具有相似遺傳背景結(jié)核分枝桿菌，可依據(jù)基因特征不同，將其分為許多亞型，并依次區(qū)分不同背景家族株成員[5-6]。我國(guó)作為北京基因型菌株高發(fā)地區(qū)，在北方地區(qū)比例高達(dá)70%～80%。具有高毒力特點(diǎn)，引起抑制和逃逸宿主免疫，耐藥性高，結(jié)核復(fù)發(fā)率高[6-7]。但往往各地研究不一致，為此，文章就深圳市光明區(qū)結(jié)核分枝桿菌的基因型分布特征及其利福平耐藥基因突變情況進(jìn)行研究，為結(jié)核病防控提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取深圳市光明區(qū)中國(guó)科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院2017 年1 月—2019 年12 月結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室基因型毒株532 株，并采取羅氏比例法鑒定耐利福平臨床分離株24株及利福平敏感株474 株。

1.2 方法

羅氏培養(yǎng)基、RFP 藥敏培養(yǎng)基購(gòu)自于珠海貝索生物技術(shù)有限公司?；蛐酒ㄌ崛〗Y(jié)核分枝桿菌耐藥基因，提取結(jié)核分枝桿菌DNA，0.9%氯化鈉溶液從羅氏培養(yǎng)基上洗脫結(jié)核分枝桿菌，80 ℃，30 min 滅火并離心3 000 r/min，10 min，去上清液，加入TE 懸液400 μL，煮沸30 min，12 000 r/min，3 min 取上清液，-20 ℃中保存?zhèn)錂z。分離培養(yǎng)菌株懸液20 μL，加入20 μL 結(jié)核分枝桿菌裂解液，混勻后并沸水浴10 min，1 000 r/min 離心2 min，留取上清液。PCR 反應(yīng)管5 000 r/min 離心2 s，并添加已經(jīng)提取待測(cè)樣本DNA 4 μL。取兩管PCR 反應(yīng)管，加入陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品DNA 4 μL，產(chǎn)品使用期間質(zhì)量控制PCR 按照以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：50 ℃下2 min，95 ℃下10 min，95 ℃下45 s，68 ℃下60 s，30 個(gè)循環(huán)，95 ℃下30 s，54 ℃下30 s，68 ℃下60 s，30 個(gè)循環(huán)，68 ℃下10 min。依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行雜交、洗膜，結(jié)果判讀為陽(yáng)性或陰性菌依據(jù)質(zhì)控品要求，依據(jù)顯色出現(xiàn)陣列，直接判讀是否出現(xiàn)突變。結(jié)核分枝桿菌基因分型檢測(cè)采取間隔區(qū)寡核苷酸分型。判定標(biāo)準(zhǔn)：典型性北京家族基因型：雜交信號(hào)點(diǎn)位1 ～34 為陰性，未出現(xiàn)黑色點(diǎn)，35 ～43 后9 個(gè)點(diǎn)位全為陽(yáng)性者即全有黑色點(diǎn)出現(xiàn)。非典型性北京家族基因型：35 ～43 點(diǎn)位出現(xiàn)間斷或缺失信號(hào)，陽(yáng)性信號(hào)黑點(diǎn)不少于5 個(gè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 424 株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因型分析

利福平耐藥情況中，北京家族基因群為14 例，占比58.33%，非北京家族基因群為10 例，占比41.67%，見(jiàn)表1。

表1 424 株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株基因型分析

2.2 利福平臨床分離株不同基因型的耐藥基因變異狀況

北京家族、非北京家族中單531、單516 中比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 利福平臨床分離株不同基因型的耐藥基因變異狀況[n（%）]

3.討論

目前，國(guó)內(nèi)結(jié)核病流行狀況嚴(yán)峻，耐藥及廣泛耐藥菌株出現(xiàn)為疾病診斷、治療造成挑戰(zhàn)。目前對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因分型、耐藥關(guān)系有相關(guān)研究[8]。對(duì)不同地區(qū)而言，結(jié)核分枝桿菌基因型不同，由于我國(guó)地域廣闊，基因型分布情況相對(duì)復(fù)雜，北方地區(qū)中以北京基因型株為主要感染基因型，南方地區(qū)分布更為復(fù)雜[9-10]。深圳市作為靠海城市，目前對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因分型及其耐藥關(guān)系之間研究較少。因此，分析深圳市結(jié)核分枝桿菌基因型分布情況以及利福平耐藥情況，對(duì)后續(xù)防控措施開(kāi)展上起著重要作用[11]。

通過(guò)對(duì)深圳市光明區(qū)結(jié)核分枝桿菌分布情況得出，其中占比最高為北京家族基因群，北京家族基因群為14 例，占比58.33%，非北京家族基因群為10 例，占比41.67%。中國(guó)地區(qū)中，普遍流行為北京家族基因群，對(duì)江蘇、青海等其他地區(qū)研究證實(shí)，其北京家族基因群占比偏高。由于北京家族基因型病原菌毒力較強(qiáng)，易造成治療失敗以及復(fù)發(fā)。對(duì)其耐藥菌株檢測(cè)顯示，單531、單516 占比偏高，與非北京家族基因群比較，存在差異性（P＜0.05）。本次研究得出，北京基因型利福平耐藥變異絕對(duì)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于非北京型。但由于本次研究開(kāi)展局限性，對(duì)其檢測(cè)變異位點(diǎn)數(shù)據(jù)及樣本含量存在一定局限，無(wú)法準(zhǔn)確判斷出北京家族基因型是否更易出現(xiàn)耐藥基因型及耐藥率偏高。也無(wú)法證實(shí)北京家族所特有變異位點(diǎn)，仍需后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，深圳市光明區(qū)結(jié)核分枝桿菌中，北京家族、非北京家族基因群中基因多態(tài)性高，與利福平耐藥率無(wú)顯著相關(guān)，兩者在單531、單516 存在差異。