miR-155在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展及肺轉(zhuǎn)移進程中的作用及機制

楊華杰，李蘭，李彬，張冬，張強

0 引言

骨肉瘤（osteosarcoma,OS），臨床上又稱為成骨肉瘤，是骨骼相關(guān)腫瘤中最常見的惡性腫瘤之一，常見于20歲以下的青少年及兒童，好發(fā)于血運豐富的長管狀骨干骺端，臨床表現(xiàn)為骨端的局部疼痛和腫脹，偶爾合并骨關(guān)節(jié)的功能障礙。在骨相關(guān)的小兒惡性腫瘤中，骨肉瘤最為常見，約占小兒所有惡性腫瘤的百分之五。骨肉瘤的治療現(xiàn)階段主要以外科治療和化療為主，而疾病的預(yù)后與是否合并肺轉(zhuǎn)移具有密切的關(guān)系。近年來，隨著手術(shù)技術(shù)及化療藥物的不斷發(fā)展，原發(fā)骨肉瘤，即不合并肺轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的患者，經(jīng)規(guī)范及有效地治療后，五年生存率能夠達到百分之七十左右[1]，但是既往臨床相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，合并遠處轉(zhuǎn)移的患者，尤其是合并肺轉(zhuǎn)移的患者，五年生存率顯著降低，只有百分之三十左右，而骨肉瘤早期合并肺轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后更差。綜述相關(guān)文獻后發(fā)現(xiàn)：大約有40%的骨肉瘤患者在初診時就合并遠處轉(zhuǎn)移，其中以肺轉(zhuǎn)移最常見[2]。目前，骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移的機制仍不明確，臨床上也沒有相關(guān)的標志物及指標予以預(yù)測及判斷預(yù)后情況，骨肉瘤的發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移仍是其臨床治療的難點及熱點[3]。因此，明確骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移的機制，對于探索其新的治療靶點、改善疾病預(yù)后具有重要意義。

MicroRNA-155（miR-155）是新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA，可以影響轉(zhuǎn)運RNA的相關(guān)轉(zhuǎn)錄、基因加工等多種生物過程。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-155參與了很多腫瘤發(fā)生發(fā)展的多種生物學(xué)過程。miR-155在胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮著重要的作用[4]，現(xiàn)已知其明確參與調(diào)控腫瘤相關(guān)的細胞增殖、凋亡、自噬等多種病理生理過程。通過相關(guān)文獻查詢發(fā)現(xiàn)，miR-155與骨腫瘤的相關(guān)研究亦有許多報道，有文章指出miR-155對骨腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)和耐藥性等生物學(xué)過程具有重要的影響作用[5]，但是既往研究大多是miR-155與骨髓瘤細胞的相關(guān)研究，miR-155與骨肉瘤的相關(guān)研究較少，尤其未見miR-155與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移的影響及機制相關(guān)研究。

本研究將初步探究miR-155在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移過程中的作用，并通過iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探索其靶蛋白及相關(guān)機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料、細胞與試劑

收集2015年12月—2020年12月北京積水潭醫(yī)院骨肉瘤患者臨床標本，包括合并肺轉(zhuǎn)移患者12例，無骨腫瘤疾病患者4例。骨肉瘤患者收集標本包括：血清、骨肉瘤組織（osteosarcoma-tissue,OS-T）、骨肉瘤瘤旁組織（osteosarcoma-paratumor tissue,OS-PT）、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織（pulmonary metastasis tumor-tissue,PET-T）和骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤旁組織（pulmonary metastasis tumor-paratumor tissue,PET-PT）；健康者收集標本為血清。本試驗項目通過北京積水潭醫(yī)院倫理委員會審查，倫理審查批號為202103.49。所有患者均簽署知情同意書并予以備案。

骨肉瘤患者入組標準：均為原發(fā)性骨肉瘤，無其他合并癥。第一次手術(shù)：骨肉瘤根治手術(shù)，即腫瘤瘤段截除+關(guān)節(jié)重建手術(shù)。術(shù)前行PET/CT檢查明確骨肉瘤病變情況，確定全身無骨肉瘤相關(guān)轉(zhuǎn)移病灶；術(shù)前不進行新輔助化療、放療、靶向等相關(guān)治療；術(shù)后化療12次，化療方案均為：甲氨蝶呤+順鉑+環(huán)磷酰胺，化療藥物劑量按照藥物說明進行配制，化療結(jié)束后每3月規(guī)律復(fù)查。手術(shù)前留取血清樣本，術(shù)中留取骨肉瘤及瘤旁組織樣本。

具體骨肉瘤根治手術(shù)方式及例數(shù)：8例股骨遠端骨肉瘤患者均行“股骨遠端瘤段截除+人工假體關(guān)節(jié)置換手術(shù)”：麻醉滿意后，患者取平臥位，常規(guī)碘酒酒精消毒鋪單，止血帶下手術(shù)。取大腿前內(nèi)側(cè)縱行切口長20～30 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及深筋膜，從股直肌與股內(nèi)側(cè)肌間分離，見軟組織包塊位于股骨下端內(nèi)側(cè)及后側(cè)，切除部分骨內(nèi)側(cè)肌、并充分游離股骨下端腫瘤邊緣，與內(nèi)后側(cè)分離并保護股血管神經(jīng)束，注意保護腓總神經(jīng)，切開關(guān)節(jié)囊，切斷雙側(cè)副韌帶、交叉韌帶和后關(guān)節(jié)囊，距關(guān)節(jié)面15～25 cm截斷股骨，取下股骨腫瘤瘤段，斷端髓腔未見異常。股骨端擴髓，脛骨端擴髓，沖洗髓腔，置入股骨下段組配型人工膝關(guān)節(jié)旋轉(zhuǎn)鏈型假體（力達康公司，重建長度15～25 cm，髓針長8～16 cm，直徑8～16 mm），并以骨水泥固定，待凝固后組裝假體。充分止血、沖洗傷口，留置傷口引流管2根，逐層縫合傷口，清點紗布、器械無誤，術(shù)畢。

3例肱骨近端骨肉瘤患者均行“肱骨近端瘤段截除+肱骨近端人工假體重建術(shù)”：麻醉滿意后,患者平臥位，常規(guī)碘酒酒精消毒鋪單。取上臂上段前側(cè)縱行切口，逐層切開皮膚、皮下組織、深筋膜，切斷胸大肌止點、三角肌于肱骨中上段止點，于內(nèi)側(cè)保護肱血管、保護后側(cè)橈神經(jīng)，充分游離腫瘤瘤段周邊，于距肱骨頭15～18 cm處截斷肱骨；切斷三角肌于鎖骨及肩峰處起點，切斷喙突處肌腱，切斷肩盂周圍肩袖諸肌充分顯露肩盂，于肩胛頸前方、后方用超聲骨刀、骨刀截斷肩胛骨，行關(guān)節(jié)外切除，見肱骨近端連同肩盂完整切除，取下腫瘤瘤段。肱骨遠端髓腔擴髓，沖洗髓腔，用肱骨近端人工假體重建（京航公司，重建長度15～20 cm，髓針長度6～8 cm、直徑6～8 mm）置換，假體髓針用骨水泥固定。充分止血、沖洗傷口，近端用Mesh補片修復(fù)關(guān)節(jié)囊，用縫合錨釘入肩峰骨質(zhì)內(nèi)，尾端縫線縫合于Mesh補片上，將肱骨頭固定于肩峰下，將胸大肌、三角肌止點縫合于Mesh上，沖洗傷口，放置傷口引流管2根，逐層縫合傷口，清點紗布器械無誤，術(shù)畢。

1例肱骨近端骨肉瘤患者行“肱骨近端瘤段截除+人工全肱骨置換術(shù)”：麻醉滿意后，患者取平臥位，常規(guī)碘酒酒精消毒鋪單。取左上臂前側(cè)縱行切口，逐層切開皮膚、皮下組織、深筋膜，切斷部分三角肌，切斷胸大肌止點、肱二頭肌及肩袖諸肌，于內(nèi)側(cè)保護肱血管、保護后側(cè)橈神經(jīng)，充分游離腫瘤瘤段周邊，于肱骨遠端保護橈神經(jīng)、正中神經(jīng)及尺神經(jīng)，將整個肱骨完整切除；以人工全肱骨假體（春立公司，重建肱骨長 28 cm，肱骨頭直徑36 mm，尺骨側(cè)長度7 cm、直徑6 mm）置換，骨水泥固定尺骨側(cè)髓針，術(shù)中尺骨側(cè)有輕微劈裂，予以鈦纜固定。充分止血、沖洗傷口，以止血紗布及凝血酶填充止血，近端用Mesh補片修復(fù)關(guān)節(jié)囊，放置傷口引流管2根，逐層縫合傷口，清點紗布器械無誤，術(shù)畢。

第二次手術(shù)：經(jīng)胸腔鏡肺楔形切除術(shù)。入組患者為：第一次手術(shù)化療結(jié)束后＞12月，新發(fā)肺轉(zhuǎn)移病灶。術(shù)前行PET/CT檢查明確骨肉瘤原發(fā)病變無復(fù)發(fā)，且除肺部轉(zhuǎn)移其余全身均無轉(zhuǎn)移病灶。術(shù)前不進行新輔助化療、放療、靶向等相關(guān)治療。手術(shù)前留取血清樣本，術(shù)中留取骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移及瘤旁組織樣本。

人正常成骨細胞系CP-H111和人骨肉瘤細胞系HOS-143B均購于武漢普諾賽生命科技有限公司，細胞培養(yǎng)基、胎牛血清均購于美國Gibco公司，CEBPB抗體和GAODH抗體及標記二抗均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，蛋白顯影液、脫脂奶粉等均購于上海生工生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄熒光定量等相關(guān)試劑盒以及QPCR相關(guān)試劑購自北京慶凱華豐科技開發(fā)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

高速低溫離心機（美國，ABI公司），紫外分光光度儀（日本，Sanyo公司），真空干燥機（德國，Eppendorf公司）；分析天平（瑞士，Sartorius 公司），電熱恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)儀器儀表公司，中國），高速離心機（德國，Eppendorf公司），Vortex QL-901 微型渦旋混合儀（瑞士，Tecan公司），超聲波清洗器（日本，JEOL公司），純水系統(tǒng)（美國，Millipore公司），圖像掃描儀（日本，Leica公司），高效液相系統(tǒng)（美國,Agillent公司），質(zhì)譜儀（美國，Thermo Finnigan公司）。

1.3 骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中miR-155的差異性檢測

1.3.1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫分析 利用Exiqon miRNome平臺數(shù)據(jù)庫分析系統(tǒng)以及GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中的芯片測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析miR-155在骨肉瘤組織與正常組織、骨肉瘤細胞HOS-143B與正常成骨細胞CP-H111中miR-155的差異性。

1.3.2 qPCR技術(shù)檢測miR-155 利用qPCR技術(shù)檢測骨肉瘤組織與瘤旁組織、人正常成骨細胞系CP-H111和人骨肉瘤細胞系HOS-143B中miR-155的差異性。miR-155相關(guān)檢測，擴增產(chǎn)物472 bp，miR-155引物序列如下：Forward primer:5’-AGCTGAAGTCTACCTTGCCT-3’；Reverse primer:5’-TGTGGGCTTGAAGTTGAGATGT-3’，以U6為內(nèi)參。

1.4 應(yīng)用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中miR-155的靶蛋白

1.4.1 制備樣品 蛋白樣本選擇組織中的全蛋白質(zhì)進行組學(xué)分析。因為骨肉瘤起源于間葉組織細胞，所以骨肉瘤的瘤體組織中摻雜較多的血管、骨組織等不均一組織。基于此原因，骨肉瘤實驗組織的取材常采取腫瘤瘤體組織與瘤旁組織進行差異性對比，其實質(zhì)是多種細胞及組織的蛋白混合物的相關(guān)對比。所以本實驗的組織取材為各組骨肉瘤及其瘤旁組織、肺轉(zhuǎn)移瘤及其瘤旁組織、以及骨肉瘤患者的血清及健康者的血清。實驗組為：骨肉瘤組織、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移組織、骨肉瘤患者的血清；對照組為：骨肉瘤瘤旁組織、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤旁組織、健康者的血清。

1.4.2 樣本蛋白的濃度測定及蛋白分離 本實驗檢測的是不同組織及血清中蛋白含量的差異性，因此樣品蛋白濃度的測定對實驗結(jié)果至關(guān)重要，本實驗采用的是BCA試劑盒來測定蛋白濃度。

蛋白濃度檢測完成后進行蛋白分離實驗：配制7 mm厚度為4%～12%的膠SDS-PAGE。等比例將兩種蛋白混合，然后加入等體積的Loading buffer，進行混勻，隨后煮沸5 min，進而離心（10 000 g,10 min），取上清液，滴加至濃縮膠，蛋白上樣量約為每泳道60 μg。電泳步驟：恒流10 mA,運行30 min后，20 mA持續(xù)至分離膠末端，然后進行考馬斯亮藍染色。

1.4.3 蛋白質(zhì)酶切標準 將SDS-PAGE獲得的分離膠按分子量由大到小的順序，分解成15個部分，再把每部分剪切成1 mm左右的微粒，將微粒浸泡于50%ACN/25 mmol/L碳酸氫銨溶液中，顏色脫洗完全后氮氣烘干，以便微粒脫水完全，體積減小；滴加DTT溶液，37℃水浴鍋4 h，滴加 55 mmol/L IAA溶液，避光室溫存放1 h，滴加少量酶液，4℃冰箱存放1 h后除去上層酶液，37℃保溫箱內(nèi)存放16 h后，滴加2%TFA，再于60%ACN超聲15 min，取上層清液。再次重復(fù)上述步驟后，兩次上層清液合并。

1.4.4 蛋白酶切混合物的液相分離 色譜分離需在Agillent系統(tǒng)上進行：利用自動上樣器進行蛋白上樣，蛋白體積約為20 μl，蛋白流速是10 μl/min；色譜洗脫在二元泵系統(tǒng)上進行：洗脫后成分通過ESI離子源進入質(zhì)譜系統(tǒng)，液相色譜設(shè)置為：流動相A：0.1%的FA-98%水溶液；流動相B：0.1%的FA-80%ACN溶液；洗脫設(shè)置：0～90 min，流動相比例由2%B線性上升到40%B；90～105 min，流動相比例由40%B線性上升到100%B；維持15 min后，以100%流動相A平衡色譜柱30 min，流速為300 μl/min。

1.4.5 質(zhì)譜分析檢測 質(zhì)譜分析檢測：質(zhì)譜儀為線性離子阱-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀（LTQ-FT,Thermo），設(shè)置的磁場強度：7 T。噴霧電壓設(shè)置：1.8 kV；毛細管溫度設(shè)置：180℃；掃描模式：Ⅰ級質(zhì)譜依靠的是Ⅱ級質(zhì)譜檢測；質(zhì)譜Ⅰ級全掃描質(zhì)荷比范圍為400～2 000 m/z（Mass range,m/z）。依次截取Ⅰ級質(zhì)譜篩選的強度排名前十的離子進行Ⅱ級質(zhì)譜串聯(lián)，實驗通過質(zhì)譜串聯(lián)掃描的動態(tài)排除方法，排除時間為30秒；離子自動增益控制設(shè)置為：一級質(zhì)譜掃描為1×106個電荷，二級串聯(lián)質(zhì)譜為1×103個電荷。Ⅰ級質(zhì)譜在400 m/z處的分辨率設(shè)置為100 000；Ⅱ級串聯(lián)質(zhì)譜歸一化碰撞能量設(shè)置為35%。

1.4.6 蛋白檢測、矯正及定量檢測 蛋白檢測、矯正及定量利用MASCOT相關(guān)軟件，通過對質(zhì)譜相關(guān)文件的結(jié)果進行檢測。蛋白質(zhì)檢測設(shè)置為：酶切點為胰酶切點；最長漏切位點為2；Ⅰ級相關(guān)離子誤差為12 ppm；Ⅱ級離子誤差為0.4 Da；存在可變修飾檢測：存在固定修飾檢測；檢測結(jié)束后再對相關(guān)蛋白進行定量：最小定量的肽段數(shù)為3氨基酸時，蛋白及肽段檢測的假陽性率需降低到1%及以下；最小定量的肽段數(shù)為6氨基酸時，蛋白定量需保證至少有一條非冗余肽及銻刀肽。

1.5 篩選miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中靶蛋白

實驗參考miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫[6]（miRanda、TargetScan和PicTar）進行靶蛋白預(yù)測。將骨肉瘤及肺轉(zhuǎn)移組織中表達量降低50%以上的蛋白分別與 miR-155數(shù)據(jù)庫中預(yù)測的靶基因進行對比分析，查看其是否具有miR-155的結(jié)合位點。

1.6 骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中miR-155篩選蛋白的驗證

利用Western blot檢測骨肉瘤組織與瘤旁組織、肺轉(zhuǎn)移瘤與瘤旁組織、人正常成骨細胞系CP-H111和人骨肉瘤細胞系HOS-143B中篩選蛋白的差異性。各組細胞或組織中分別加入RIPA裂解液，冰上裂解20 min，4℃，18 000g，離心20 min（r=10 cm），取上清液并采用BCA試劑盒測定蛋白含量。取35 μg蛋白液進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，用封閉液（質(zhì)量分數(shù)2%，BSA）封閉，分別加入一抗4℃過夜（以GAPDH抗體為參照），洗滌后，再加入二抗室溫孵育1 h。ECL曝光成像，最后采用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6軟件處理。采用（±s）表示正態(tài)分布且方差齊的計量資料，行t檢驗；采用百分數(shù)表示計數(shù)資料，行χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤及肺轉(zhuǎn)移進程中miR-155的差異性檢測結(jié)果

2.1.1 臨床樣本miR-155的差異性檢測結(jié)果 分析骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者的血清樣本數(shù)據(jù)（GSE65071），利用Exiqon miRNome平臺（human panelsⅠ+Ⅱ,V3）對比來自10例骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者和15例正常對照的血清中miR-155的表達水平。結(jié)果提示，正常對照組血清中miR-155的含量僅為肺轉(zhuǎn)移患者血清中的0.292倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0032），見圖1A。

共收集骨肉瘤患者12例：肱骨近端骨肉瘤4例，股骨遠端骨肉瘤8例，男:女=7:5，年齡分布15～43歲，平均年齡28.33±2.87歲。收集入組骨肉瘤患者兩次手術(shù)術(shù)前的血清，以評估患者在出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移前后血清中miR-155含量的差異性，結(jié)果顯示：miR-155在出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移前為1.87±0.09；肺轉(zhuǎn)移后為2.05±0.11，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.78）。為進一步證實miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中的差異性，qRT-PCR檢測骨肉瘤組織與其瘤旁組織、骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移瘤組織與其瘤旁組織中的miR-155含量。病理切片HE染色，確診為骨肉瘤或骨肉瘤轉(zhuǎn)移組織。

結(jié)果顯示，miR-155表達量在骨肉瘤組織：1.45±0.06；骨肉瘤瘤旁組織：0.78±0.05；肺轉(zhuǎn)移瘤組織：1.71±0.07；肺轉(zhuǎn)移瘤旁組織：0.60±0.05。miR-155含量在骨肉瘤組織和肺轉(zhuǎn)移瘤組織中，較對照組瘤旁組織均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0001,P=0.0001）；肺轉(zhuǎn)移瘤組織中較骨肉瘤組織中miR-155含量亦出現(xiàn)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003），見圖1B～C。

圖1 骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程臨床樣本miR-155的差異性檢測分析結(jié)果Figure 1 Expression of miR-155 in clinical samples of osteosarcoma and its pulmonary metastasis process

2.1.2 骨肉瘤細胞與正常成骨細胞中miR-155的差異性檢測結(jié)果 分析GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中的芯片測序數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細胞系中miR-155的表達量顯著上調(diào)。對比三個常見的骨肉瘤細胞系與正常骨組織的microRNAs表達（Agilent-019118 Human miRNA Microarray 2.0 G4470B,GSE28425），分析發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細胞系HOS-143B、HOS-MNNG和MG-63中miR-155的表達水平是正常骨組織中的15.57倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0043,FDR=0.036），見圖2A。

為進一步證實miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中的差異性，qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，miR-155表達量在人骨肉瘤細胞系HOS-143B中為1.61±0.07，在人正常成骨細胞系CP-H111中為0.46±0.06，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0003），見圖2B。

圖2 人骨肉瘤細胞系與人正常成骨細胞系miR-155的差異性Figure 2 Comparison of miR-155 expression between human osteosarcoma cell lines and human normal osteoblast cell lines

2.2 骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中miR-155靶蛋白的篩選結(jié)果

2.2.1 質(zhì)譜鑒定檢測結(jié)果 利用蛋白質(zhì)組學(xué)對骨肉瘤組織和正常骨組織進行蛋白鑒定，結(jié)果顯示：共檢測收集到194 867張質(zhì)譜圖，從中鑒定到46 895條肽段，其中10 985條為非冗余肽，肽段的平均質(zhì)量誤差為0.89 ppm。實驗結(jié)果最終鑒定到 3 714個蛋白組。

2.2.2 差異表達蛋白鑒定結(jié)果 在骨肉瘤組織中，根據(jù)FDR＜0.05，倍數(shù)變化大于2倍為標準，骨肉瘤組織中共篩選出差異表達蛋白253個，其中上調(diào)144個，下調(diào)109個，見圖3A～B。

圖3 miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程組織中靶蛋白的篩選Figure 3 Screening of target proteins of miR-155 in osteosarcoma and its pulmonary metastasis process

2.2.3 差異表達蛋白質(zhì)的功能注釋 基因GO注釋分析顯示，差異表達蛋白主要富集于細胞骨架、細胞黏附、細胞增殖和凋亡、細胞遷移等注釋，見圖3C～E。差異表達蛋白中還存在一些參與腫瘤行為調(diào)控的蛋白，如：煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（nicotinamide N-methyltransferase,NNMT）參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程，在癌細胞的胞質(zhì)中出現(xiàn)高表達；同源框蛋白CDX-10（Homeobox protein CDX-10）能夠調(diào)控腫瘤相關(guān)的特異性基因表達和上皮細胞分化；B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,bcl-2），與細胞凋亡密切相關(guān)；基因沉默調(diào)節(jié)蛋白（Sirtuin 1,SIRT1）活化后可以從細胞質(zhì)進入細胞核內(nèi)，進而調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子活性，參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化的相關(guān)生物學(xué)過程；eIF4E（eukaryotic translation initiation factor 4E）可在蛋白質(zhì)翻譯過程中，通過與轉(zhuǎn)運RNA結(jié)合影響和調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯進程；細胞周期檢測點激酶1和2（checkpoint kinase 1 and 2,Chk 1 and 2）為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族相關(guān)成員，廣泛參與細胞代謝相關(guān)生物學(xué)過程，尤其是在多種信號通路中影響及調(diào)節(jié)下游蛋白的表達，進而使細胞代謝出現(xiàn)相關(guān)障礙；EHD2（C-terminal EH domaincontaining protein 2）是一種細胞膜轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白，在細胞膜水平參與蛋白轉(zhuǎn)運，進入細胞核內(nèi)后，仍影響核內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)錄及翻譯過程；組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（SET and MYND domain containing 3,SMYD3）能夠使組蛋白甲基化，進而調(diào)控細胞凋亡相關(guān)代謝周期，在蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有重要作用。

2.2.4 miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中靶蛋白的篩選 miRanda的預(yù)測結(jié)果顯示，有3個靶基因具有miR-155的靶位點：CCAAT增強子結(jié)合蛋白β（C/EBPβ，基因CEBPB），發(fā)現(xiàn)C/EBPβ是細胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，廣泛參與細胞黏附、細胞增殖等相關(guān)通路；B淋巴細胞瘤-10（B-cell lymphoma-10,bcl-10）參與腫瘤細胞的凋亡調(diào)控等生物學(xué)過程；異戊二烯基二磷酸合酶亞基2（prenyl/decaprenyl diphosphate synthase 2,PDSS 2）在多種腫瘤細胞中呈現(xiàn)差異性表達。TargetScan的預(yù)測結(jié)果顯示，有2個基因具有miR-155的靶位點：C/EBPβ（與 miRanda 相同）；細胞因子信號傳導(dǎo)抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling 1,SOCS 1）能夠阻斷部分腫瘤細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，進而降低腫瘤相關(guān)代謝進程。PicTar的預(yù)測結(jié)果顯示，有2個基因具有miR-155的靶位點：C/EBPβ（與miRanda和TargetScan均相同）；PDSS2（與miRanda相同）。其余蛋白未找到相匹配的結(jié)果，這可能是因為miR-155通過間接調(diào)節(jié)的方式抑制了某些基因及蛋白的表達，或者通過其他非結(jié)合的方式進而影響相關(guān)蛋白的表達。

2.3 miR-155篩選蛋白C/EBPβ的Western blot驗證結(jié)果

與瘤旁組織相比，骨肉瘤及肺轉(zhuǎn)移瘤組織中C/EBPβ的表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0003,P=0.0002），見圖4A；與人正常成骨細胞系CP-H111相比，人骨肉瘤細胞系HOS-143B中C/EBPβ表達亦顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004），見圖4B。

圖4 miR-155篩選蛋白C/EBPβ的Western blot驗證結(jié)果Figure 4 Western blot validation results of miR-155 screening protein C/EBP β

3 討論

骨肉瘤因其發(fā)病年齡偏小且預(yù)后不佳，一直是骨相關(guān)腫瘤研究的熱點及難點。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，miRNAs對腫瘤的相關(guān)影響研究逐漸進入人們的視野[7]。miRNAs是廣泛存在于真核生物中的非編碼小RNAs，長度為19～24個核苷酸序列，能在轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因的表達及翻譯，通過與mRNA的不完全堿基配對，從而影響其生物學(xué)過程[8]。近年來，miRNAs越來越受到重視，研究發(fā)現(xiàn)其在機體生理及病理學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，廣泛參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、自噬、腫瘤復(fù)發(fā)等多種生物學(xué)過程[9]。

miR-155是一類多功能的miRNA，參與了包括炎性反應(yīng)、細胞調(diào)控、腫瘤復(fù)發(fā)、自噬、細胞凋亡等[10]多種生物學(xué)過程。綜述相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)：miR-155在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[11]。Shi等[12]發(fā)現(xiàn)膜蛋白可以通過調(diào)控miR-155抑制胃癌細胞中Smad2的表達；Ulivi等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-155能夠作為判斷貝伐單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌療效的相關(guān)預(yù)測因子之一；Santos等[14]指出外泌體介導(dǎo)的miR-155移位能夠影響乳腺癌化療的藥物耐受性；Wei等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-155可以阻斷TGF-β1信號通路，進而緩解肺癌細胞的纖維化進程；Xue等[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-155能夠降低SOCS1、SOCS6和PTEN的表達，進而加速非小細胞肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

研究表明miR-155能夠影響與腫瘤相關(guān)的多種生理病理過程。Yu等[17]利用miR-155基因敲除小鼠建立骨髓瘤相關(guān)實驗動物模型，發(fā)現(xiàn)通過抑制骨髓中miR-155基因能夠顯著增加腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移；Wang等[18]利用miR-155基因敲除小鼠建立骨髓瘤相關(guān)實驗動物模型，通過沉默miR-155基因顯著促進了骨髓腫瘤的發(fā)生發(fā)展及生長。

本實驗闡釋miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中的作用，并利用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移進程中潛在的靶蛋白，最終鑒定到蛋白3 714個，骨肉瘤組織中差異表達蛋白253個。通過與miRNA靶基因的數(shù)據(jù)庫的匹配分析，經(jīng)臨床樣本實驗與細胞相關(guān)實驗的蛋白定量驗證，提示C/EBPβ是miR-155潛在的作用靶蛋白。

C/EBPβ是堿性亮氨酸拉鏈蛋白（bZIP）的家族成員之一。CEBPB的轉(zhuǎn)運RNA能夠經(jīng)過差異性剪切形成4種蛋白異構(gòu)體（LAP、LIP、LAP2及14 kDa的蛋白）。C/EBPβ也被發(fā)現(xiàn)在許多組織及器官內(nèi)廣泛表達，參與調(diào)控許多病理生理進程，其中包括細胞分化及增殖、組織及細胞再生、腫瘤、炎性反應(yīng)等。另外，C/EBPβ已被證實與乳腺癌、胰腺癌、軟骨肉瘤等多種腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)[19]，尤其是能夠參與調(diào)控腫瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition,EMT）過程。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)C/EBPβ參與調(diào)控尼古丁誘發(fā)的乳腺上皮細胞的EMT激活過程，從而影響乳腺癌的發(fā)展；Cheng等[21]研究指出C/EBPβ能夠激活CDKN2A轉(zhuǎn)錄并抑制胰腺腫瘤細胞EMT，進而抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生及發(fā)展；Lu等[22]研究發(fā)現(xiàn)對骨肉瘤細胞轉(zhuǎn)染C/EBPβ可以下調(diào)CLEC5A，進而緩解骨肉瘤細胞的增殖，但對其作用機制并未作深入的相關(guān)研究。

骨肉瘤為惡性骨腫瘤之一，腫瘤切除術(shù)后需進行化療等進一步治療。臨床上需首先保證患者得到有效且及時的治療，故在本實驗中無法收集無化療的肺轉(zhuǎn)移瘤及瘤旁組織樣本，因此不能完全避免化療對實驗結(jié)果的影響。但是本項目制定了嚴格的入組標準及實驗方案，以減少實驗結(jié)果的偏移。首先，所有入組的骨肉瘤患者，第一次手術(shù)前均無新輔助化療等相關(guān)治療，術(shù)后化療的方案、劑量、次數(shù)均無差異，以保證實驗過程的均一性；其次，入組為化療后＞12月新發(fā)肺轉(zhuǎn)移的患者，保證新發(fā)肺轉(zhuǎn)移瘤與化療治療具有較長的時間間隔，以減輕化療治療因素的干擾和偏移；最后，肺轉(zhuǎn)移瘤手術(shù)前不進行化療等相關(guān)治療，且PET/CT明確骨肉瘤無復(fù)發(fā)且除肺轉(zhuǎn)移外無其他轉(zhuǎn)移，以排除化療及其他因素對肺轉(zhuǎn)移瘤體的影響。項目初期進入臨床觀察的患者96例，因入組標準較嚴格，最后入組的僅有12例患者。本實驗結(jié)果雖然不能完全避免化療治療對實驗結(jié)果的影響，但是通過嚴格的入組管理和長時間的臨床隨訪最大限度地降低其對實驗結(jié)果的偏移，實驗結(jié)果具有較高的可信性及準確性。

本研究揭示了miR-155在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展及其肺轉(zhuǎn)移過程中的作用，并成功篩選其靶向蛋白C/EBPβ?；诖搜芯?，進而探究在骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移過程中miR-155及其相關(guān)靶蛋白具體的通路及相關(guān)機制，不但可以明確miR-155在骨肉瘤及其肺轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)分子基礎(chǔ)，而且對開發(fā)其新的治療策略具有重要意義。