應(yīng)用不平衡法檢測贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌ALK融合突變

鐘煒祥，韋晰鳳

0 引言

肺癌是目前我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，作為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）繼表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突變之后被發(fā)現(xiàn)的第二大突變基因—棘皮動物微管相關(guān)蛋白4-間變淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK）融合基因在NSCLC發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸中扮演著重要角色，尤其是肺腺癌最具有特點的致癌基因。文獻(xiàn)[1-4]報道不同地區(qū)的NSCLC患者中EML4-ALK融合突變存在差異，目前贛南地區(qū)尚無ALK融合基因的相關(guān)報道。本研究通過不平衡法（即基于3'端和5'端的表達(dá)水平不平衡策略的qRT-PCR方法）檢測贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌組織中ALK融合基因的表達(dá)情況，回顧性分析其臨床病理特征，旨在探討贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌ALK融合基因的特點，科學(xué)指導(dǎo)此類患者優(yōu)選靶向用藥。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2016年—2020年經(jīng)病理檢查確診為原發(fā)性肺腺癌的病例233例，其中男127例（54.51%），女106例（45.49%），平均年齡（60.3±10.618）歲，中位年齡61歲（34～89歲）；無吸煙史142例（60.94%），有吸煙史91例（39.06%）；臨床分期按國際肺癌研究協(xié)會第八版國際肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行：Ⅰ期42例（18.02%）、Ⅱ期17例（7.30%）、Ⅲ期21例（9.01%）、Ⅳ期153例（65.67%）。入組患者分布于贛南地區(qū)，均為初治，未接受過化療、放療或靶向治療。

1.2 方法

1.2.1 篩選病例 經(jīng)外科手術(shù)切除或CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺活檢或電子支氣管鏡活檢組織標(biāo)本233例，其中石蠟切片組織標(biāo)本201例，新鮮活檢組織標(biāo)本32例。經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科學(xué)研究倫理委員會審查批準(zhǔn)（編號：LLSC-2021081601）。

1.2.2 標(biāo)本固定 由醫(yī)院病理科進(jìn)行石蠟包埋固定，按至少5 μm厚度切取病理白片15張外送。32例新鮮組織標(biāo)本離體后儲存在RNAfixer組織保存液中固定后外送。經(jīng)患者知情同意后，233例樣本先后外送至浙江鼎晶醫(yī)學(xué)檢驗所進(jìn)行ALK融合基因檢測。

1.2.3 總RNA提取 采用組織RNA抽提kit（Qiagen）試劑盒提取樣本總RNA，紫外分光光度儀測定模板總RNA的濃度（＞30 ng/μl）和純度（OD260/OD280值為1.8～2.0）。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄（reverse transcription,RT）合成cDNA 參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書設(shè)置RT程序：25℃ 5 min；42℃ 60 min；75℃ 5 min；4℃ 5 min。

1.2.5 Real-time PCR體系 RT產(chǎn)物通過SYBR Green PCR master mix（Applied Biosystems）試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)并采用ABI 7500 PCR儀檢測。PCR程序參照人EML4-ALK融合基因檢測試劑盒（real time PCR）使用說明書進(jìn)行設(shè)置：（1）UNG酶反應(yīng)：50℃ 2 min 1個循環(huán)；（2）預(yù)變性：95℃ 10 min 1個循環(huán)；（3）變性：95℃ 15 s；退火、延伸及檢測熒光（熒光通道為FAM）60°C 32 s，共45個循環(huán)；（4）溶解曲線（60℃～95℃按1%的速度遞增，此階段吸收熒光信號）：95℃ 15 s 1個循環(huán)；60℃ 1 min 1個循環(huán)；95℃ 30 s 1個循環(huán)；60℃ 15 s 1個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

本組資料為計數(shù)資料，以百分?jǐn)?shù)表示。應(yīng)用SPSS24.0軟件，采用χ2檢驗或確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALK融合基因的表達(dá)情況

入組233例樣本，共檢測出21例ALK基因融合，表達(dá)率為9.01%，見圖1。

圖1 ALK融合突變Real-time PCR圖Figure 1 Real-time PCR pictures of ALK fusion mutation

2.2 ALK融合突變與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

女性、N1-3患者ALK融合基因表達(dá)率為13.2%（14/106）、12.5%（18/144），均顯著高于男性（5.5%）、N0（3.4%）患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；ALK融合基因在新鮮組織標(biāo)本、年齡＜55歲、無吸煙史以及M1期患者中的表達(dá)率相對較高，但未達(dá)統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；ALK融合基因的表達(dá)與TNM分期、T分期、是否手術(shù)治療以及腫瘤分布位置均無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

表2 贛南地區(qū)肺腺癌患者ALK基因融合與臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relation between ALK fusion and clinicopathological characteristics of patients with lung adenocarcinoma in Gannan region

2.3 ALK融合突變與肺癌常見部位轉(zhuǎn)移的關(guān)系

在153例M1期病例中，肺癌常見轉(zhuǎn)移部位按發(fā)生率大小依次是骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移、對側(cè)肺轉(zhuǎn)移、胸膜播散（惡性胸水、心包積液或胸膜結(jié)節(jié)）/腎上腺轉(zhuǎn)移以及肝轉(zhuǎn)移，亞組分析均未發(fā)現(xiàn)ALK融合突變與肺癌常見部位轉(zhuǎn)移的相關(guān)性（均P＞0.05），見表3。

表3 贛南地區(qū)153例M1期肺腺癌患者ALK基因融合與肺癌常見部位轉(zhuǎn)移的關(guān)系Table 3 Relation between ALK fusion and metastasis of common sites of lung cancer in 153 M1-stage patients with lung adenocarcinoma in Gannan region

3 討論

目前肺癌的診療已邁入了精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時代，EML4-ALK是繼EGFR之后第二受關(guān)注的基因，也是NSCLC中最常見的ALK融合基因，亦是在NSCLC中第一個發(fā)現(xiàn)的融合基因激酶抑制靶點。在EML4-ALK融合基因中，EML4的N端與ALK胞內(nèi)的絡(luò)氨酸激酶區(qū)發(fā)生融合，導(dǎo)致ALK融合基因異常表達(dá)，此外融合伴侶EML4可促進(jìn)融合蛋白的二聚和低聚反應(yīng)，導(dǎo)致ALK酪氨酸激酶區(qū)及下游PI3K/AKT及MAPK等信號通路激活，從而引起細(xì)胞異常增殖和分化[5]。在NSCLC中被發(fā)現(xiàn)的ALK融合基因還包括KIF5B-ALK、TFG-ALK、KLC1-ALK等[6-7]。近年來，針對ALK融合基因的靶向治療藥物發(fā)展迅速，克唑替尼[8]、阿來替尼[9]、勞拉替尼[10]等ALK-TKIs的臨床使用顯著改善了ALK陽性晚期NSCLC患者的生存，對ALK融合突變 NSCLC具有類似于EGFR-TKIs的療效，ALK-TKIs通過競爭性結(jié)合于ALK激酶區(qū)，阻斷ALK下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而達(dá)到治療效果。

本研究入組病例來自贛南地區(qū)十八縣市區(qū)，以客家人居多，ALK融合基因的表達(dá)率為9.01%（21/233），高于ALK融合基因的整體表達(dá)水平（3%～7%）[11]，提示ALK融合突變可能存在一定的區(qū)域或人種差異?；仡櫺苑治霭l(fā)現(xiàn)，女性患者ALK融合基因的表達(dá)率明顯高于男性患者（P＜0.05），與王惠宇等[12]研究結(jié)果類似，Ke等[13]研究亦表明ALK融合基因更多見于女性。ALK融合突變的性別差異可能與雌激素相關(guān)，有研究[14]表明雌激素受體表達(dá)增加可能與性別相關(guān)的NSCLC發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)。同時，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（即N1-3）患者ALK融合基因的表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（即N0）患者，Tian等[15]回顧性研究亦表明ALK融合突變肺腺癌患者可能有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移傾向。

既往研究[16-18]表明ALK融合突變多見于年輕NSCLC患者，且ALK融合突變陽性患者的年齡較陰性患者小4～5歲[19-20]。本研究選取55歲作為年齡界定點進(jìn)行統(tǒng)計分析，未發(fā)現(xiàn)ALK融合突變在不同年齡組間的顯著差異（P＞0.05）。

吸煙作為肺癌最密切的致病因素，Sasaki等[21]報道非吸煙NSCLC患者具有更高的ALK融合突變風(fēng)險。本研究結(jié)果顯示，ALK融合基因在無吸煙史患者中的表達(dá)率相對較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

目前，手術(shù)大標(biāo)本和新鮮活檢組織標(biāo)本是肺癌基因檢測的理想標(biāo)本，腫瘤細(xì)胞含量較多，檢出率更高，結(jié)果更為可靠[22]。本研究比較了新鮮活檢組織和石蠟切片組織標(biāo)本中的ALK融合基因表達(dá)水平，前者相對較高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），可能與入組病例中新鮮活檢組織樣本量比例低有關(guān)。此外，贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌中ALK融合基因的表達(dá)與臨床分期、T分期、M分期、是否手術(shù)治療以及腫瘤分布位置均無相關(guān)性，可能與入組病例的篩選、檢測方法的選擇以及地域、種族差異等因素有關(guān)。

ALK融合突變一般與腫瘤的惡性程度相關(guān)，且更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜轉(zhuǎn)移及腦轉(zhuǎn)移[23]，ALK融合突變患者的預(yù)后相對更差。本研究亞組分析未發(fā)現(xiàn)ALK融合突變與肺癌常見部位（骨、腦、對側(cè)肺、胸膜播散、腎上腺及肝）轉(zhuǎn)移的相關(guān)性（P＞0.05），可能是由樣本量的差異、回顧性研究的偏倚等因素造成的。

本實驗采用基于3'端和5'端的表達(dá)水平不平衡策略的qRT-PCR方法[24]檢測腫瘤組織中ALK基因在3'端和5'端的表達(dá)差異，分析二者之間的不平衡現(xiàn)象，進(jìn)而明確是否存在ALK融合基因。只要存在ALK融合基因，即無論是已知的ALK融合基因，還是新的ALK融合基因，不平衡法就可以檢測到，而且與腫瘤靶基因高通量測序、FISH等比較，其檢測時間更短，對儀器設(shè)備和人員要求更低，值得在臨床中廣泛應(yīng)用并積極推廣。

綜上所述，贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌患者ALK融合基因的表達(dá)率相對較高，好發(fā)于女性、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。明確贛南地區(qū)原發(fā)性肺腺癌患者ALK融合基因的臨床特點，科學(xué)指導(dǎo)贛南地區(qū)NSCLC患者個體化治療，為此類患者優(yōu)選靶向用藥提供理論依據(jù)，進(jìn)而建立贛南地區(qū)肺癌靶向治療模式并推廣應(yīng)用于臨床。

（致謝：感謝鼎晶醫(yī)學(xué)檢驗所為本研究提供實驗部分的支持與幫助！）