CircRNA hsa_circ_0044569在肺癌診斷中的價值

侯巖君，田進海，王立斌，何進喜

0 引言

肺癌已經是發(fā)達國家和發(fā)展中國家男性癌癥死亡的主要原因[1]，中國腫瘤流行病現狀顯示，中國肺癌男性發(fā)病率居首位，女性發(fā)病率居第二位，但是中國肺癌在男性及女性的死亡率中均居首位[2]，肺癌分為非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌（SCLC），非小細胞肺癌主要分為：腺癌、鱗癌和大細胞肺癌[3]。非小細胞肺癌較小細胞肺癌發(fā)展和轉移慢，受到現有的檢查方式，體檢意識，醫(yī)療資源分配等相關因素的影響，大部分患者診斷肺癌時已為晚期，5年生存率不足20%[4]，晚期診斷的主要原因是患者癥狀出現晚，不易早期發(fā)現，所以發(fā)現新的可以早期診斷肺癌的標志物迫在眉睫。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）在最初發(fā)現時被認為是剪接錯誤的產物[5]，隨著科技的發(fā)展高通量RNA測序的普及，發(fā)現環(huán)狀RNA在真核細胞中豐富且穩(wěn)定[6]。它是一類新興的非編碼RNA分子，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，circRNA的分子結構呈封閉環(huán)形，不易被核酸內切酶降解[7]，并且具有疾病和組織特異性。越來越多的研究顯示，circRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色[8-9]。有報道已經表明circRNA參與了很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移等過程[10-13]，結合circRNA的這些特點，其具備可以成為疾病診斷標志物的潛力。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2018年4月—2019年8月寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院普胸外科手術的56對肺癌組織和與其配對的癌旁組織標本，其中4對用于芯片篩選。排除標準為：（1）合并其他腫瘤的患者；（2）術前有放化療病史；（3）臨床信息不完善。納入標準：（1）有明確肺癌的病理診斷；（2）既往沒有癌癥病史；（3）沒有艾滋/艾滋病病毒感染；（4）患者術前均無放療或化療史。本研究獲寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 樣本及臨床信息采集

收集肺癌組織和離腫瘤邊緣＞5 cm處癌旁組織，立即放入液氮內，之后取出整理放于-80℃冰箱長期保存，最終病理診斷由病理科2名主任醫(yī)師確診。其中Ⅰ期28例，Ⅱ期7例，Ⅲ期11例，Ⅳ期6例，其中Ⅰ期和Ⅱ期為早期肺癌，Ⅲ期和Ⅳ期為中晚期肺癌。收集所有患者信息，包括：（1）基本信息：患者年齡、性別、電話、登記號、住院號、患者手術時間、吸煙、飲酒等；（2）肺癌診斷和分型；（3）肺癌患者的臨床特征：腫瘤大小、是否轉移、腫瘤TNM分期等臨床指標；（4）血清檢驗結果：血常規(guī)、腫瘤標志物指標（CA125、CA199、CEA）等。

1.3 circRNA芯片分析

使用Arraystar Human circRNA Array（V2.0）（北京博奧生物有限公司，中國）和GeneSpring 13.0（Agilent）軟件對4對肺癌患者的肺癌和癌旁組織樣品進行芯片篩選。對RNA進行消化、擴增及標記后，通過人circRNA表達譜芯片（Human circRNA array version 2.0，北京博奧生物有限公司，中國）檢測樣品中circRNA表達情況，該芯片覆蓋162351條已知circRNA的探針。檢測結果進行初步過濾和質控去除不達標部分，剩余數據進行篩選，篩選條件為：差異倍數（fold change,FC）≥5,P＜0.01，熒光信號值≥100。使用Feature Extraction（CapitalBio）軟件提取芯片數據，GeneSpring V13.0軟件（Agilent）分析差異倍數、熒光信號值和顯著性，Cluster3.0軟件進行差異聚類分析。

1.4 RNA提取及反轉錄

首先從組織中提取總RNA，應用OMEGA的E.Z.N.A.Total RNA Kit Ⅰ試劑盒按照說明進行組織RNA的提取，提取后使用分光光度計Nano-Drop2000（Thermo Fisher Scientific）測定RNA的純度和濃度，OD260/280的比值約為1.9～2.0，然后通過GoScript反轉錄（RT）系統(tǒng)（Promega Corporation，Fitchburg，WI，USA）將RNA反轉錄為cDNA。反轉錄體系為：1 μl總RNA（約500 ng），1 μl 隨機引物，10 μl ddH2O，2 μl dNTP，4 μl反轉錄緩沖液，1 μl RNA酶抑制劑，1 μl反轉錄酶，總體積20 μl；反應條件為：25℃ 5 min；42℃ 60 min，70℃ 5 min。RNA及cDNA置于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 qRT-PCR檢測circRNA hsa_circ_0044569在肺癌及癌旁組織的表達差異

使用反轉錄系統(tǒng)合成cDNA。qRT-PCR使用TB Green qPCR Mastermix（TaKaRa，日本），在LightCycler480實施PCR反應。qRT-PCR反應的總體積為20 μl，其中包括0.8 μl正向/反向引物，10 μl TB Green，6.4 μl二次蒸餾水和2 μl cDNA。循環(huán)程序95℃下持續(xù)10 s，然后再40個循環(huán)中95℃持續(xù)15 s，退火溫度30 s，β-actin在表達中起內參對照作用，基因的相對表達量使用ΔCT法計算。所有樣品進行3次重復實驗，見表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers

1.6 統(tǒng)計學方法

使用SPSS23.0，GraphPad Prism7.0進行統(tǒng)計分析。數據表示為平均值±標準差（±s），從肺癌組和癌旁對照組之間的分布差異計算每個circRNA的倍數變化，并通過獨立樣本t檢驗分析顯著性，使用SPSS23.0構建接收器工作特征曲線（ROC），當AUC≤0.5時，circRNA沒有診斷價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肺癌患者組織中的circRNA表達譜芯片分析

結果顯示：肺癌及癌旁組織間存在大量差異表達的circRNA，見圖1。通過芯片設定的差異篩選標準和生物信息學分析最終獲得19個差異表達的circRNA，其中11個表達上調，8個表達下調的circRNA作為候選分子進行進一步研究，經臨床標本驗證最終選擇在肺癌中穩(wěn)定顯著上調的hsa_circ_0044569作為研究目標，見圖2。

圖1 肺癌與癌旁組織之間差異表達的circRNA火山圖Figure 1 Volcano map of differentially-expressed circRNA between lung cancer and adjacent tissues

圖2 肺癌與癌旁組織之間差異表達的circRNA聚類圖Figure 2 Clustergram of differentially-expressed circRNA between lung cancer and adjacent tissues

2.2 hsa_circ_0044569的表達與肺癌患者臨床病理特征之間的關系

結果顯示：hsa_circ_0044569表達與肺癌患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移、CEA、CA12-5、CA19-9、飲酒、吸煙等差異無統(tǒng)計學意義，但與肺癌的病理類型之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 hsa_circ_0044569的表達與肺癌患者臨床病理特征之間的關系 (±s)Table 2 Correlation between expression of hsa_circ_0044569 and clinicopathological characteristics of lung cancer patients (±s)

表2 hsa_circ_0044569的表達與肺癌患者臨床病理特征之間的關系 (±s)Table 2 Correlation between expression of hsa_circ_0044569 and clinicopathological characteristics of lung cancer patients (±s)

Notes:CEA:carcinoembryonic;CA19-9:carbohydrate antigen 19-9;CA12-5:carbohydrate antigen 12-5 antigen.

2.3 hsa_circ_0044569在肺癌組織中的表達

對5 2 對肺癌患者癌和對應的癌旁組織中hsa_circ_0044569表達水平進行分析結果顯示，hsa_circ_0044569在肺癌組織中的表達水平高于與其對應的癌旁組織，見圖3A～B；肺癌組織46例表現出高表達（88.5%），6例表現為低表達（11.5%），見圖3C。

圖3 qRT-PCR驗證在肺癌和癌旁組織中差異表達的hsa_circ_0044569 Figure 3 Differential hsa_circ_0044569 expression between lung cancer tissues and adjacent tissues verified by qRT-PCR

2.4 hsa_circ_0044569在肺癌中的診斷價值

應用ROC曲線評價hsa_circ_0044569對肺癌的診斷價值，獲得hsa_circ_0044569在52對肺癌組織中的臨界值值為9.62，曲線下面積AUC值為0.758,P＜0.01，敏感度為0.712，特異性為0.712，見圖4。因此，hsa_circ_0044569具備早期肺癌診斷的潛能。

圖4 肺癌與配對癌旁組織中hsa_circ_0044569表達的ROC曲線Figure 4 ROC curves of hsa_circ_0044569 expression in lung cancer and adjacent tissues

2.5 與hsa_circ_0044569結合的miRNA預測分析

hsacirc_0044569 結合的miRNA預測結果，見圖5。本研究采用miRanda數據庫預測與hsa_circ_0044569結合miRNA情況，hsa_circ_0044569共計有138個miRNA結合位點，根據結合位點類型（Site type）、結合位點總評分（Context++score）及miRNA家族的保守靶向概率（PCT）計算與hsa_circ_0044569結合的靶向miRNA排名靠前的前20個，供進一步機制研究參考。

圖5 通過miRanda數據庫預測到與hsa_circ_0044569結合的miRNA結合位點分布Figure 5 Distribution of miRNA binding sites that bind to hsa_circ_0044569 predicted by miRanda database

3 討論

環(huán)狀RNA的種類和形式多種多樣，可以起源于基因組序列的任何區(qū)域[14]，根據來源主要分為 3 類:內含子序列形成的環(huán)狀RNA（circular intronic RNA,ciRNA），外顯子序列形成的環(huán)狀RNA（exonic circular RNA,ecircRNA）以及內含子和外顯子序列共同形成的環(huán)狀RNA（exon-intron circular RNA,EIciRNA）外顯子環(huán)狀RNA可以由一個或者多個外顯子序列組成，主要存在于細胞質內，而內含子環(huán)狀RNA主要分布在細胞核內[15]。環(huán)狀RNA廣泛存在于哺乳動物細胞中，與線性RNA相比，它們有著較高的表達水平。circRNA的兩個最重要的特性是它們高度保守且非常穩(wěn)定。與其他非編碼RNA相比，這些優(yōu)勢為circRNA提供了成為診斷癌癥疾病的理想生物標志物的潛力[16]。隨著RNA測序和其他檢測技術的應用，我們注意到，環(huán)狀RNA在許多腫瘤中都存在差異表達的現象，如膀胱癌[17]、結腸癌[18]、肝細胞癌[19]等腫瘤，由于環(huán)狀RNA比線性RNA更穩(wěn)定，并±s且環(huán)狀RNA由細胞囊泡儲存并通過胞吐方式釋放進入血液，致使環(huán)狀RNA在臨床工作中易于獲取。以上特點為環(huán)狀RNA在腫瘤診斷方面提供了臨床優(yōu)勢。

本研究發(fā)現hsa_circ_0044569在鑒別肺腺癌及肺鱗癌之間差異有統(tǒng)計學意義，但是與患者的年齡，性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移、CEA、CA12-5、CA19-9、飲酒、吸煙等之間差異無統(tǒng)計學意義。目前為止，很多實驗都驗證了circRNA與肺癌患者臨床特點之間的關系。Cheng等[20]的研究表明，肺鱗癌中circTP63被上調，并且其上調與肺鱗癌患者中更大的腫瘤大小和更高的TNM分期相關。升高的circTP63在體外和體內均可促進腫瘤細胞增殖。Wang等[21]的研究顯示，環(huán)狀RNA circ_0020123通過海綿miR-590-5p調控THBS2促進NSCLC細胞增殖和遷移，抑制細胞凋亡。Liu等[22]的研究顯示，基因微陣列檢測結果表明hsa_circ_0046264是最顯著的上調基因，qRT-PCR檢測進一步證明hsa_circ_0046264在腫瘤患者組織中表達顯著上調。臨床分析表明，hsa_circ_0046264的表達水平與患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤分期（TNM）和淋巴結轉移顯著相關（P＜0.01）。

早期診斷是有效治療肺癌的重要前提，胸部CT可早期發(fā)現肺部病變，然而，有些病變通過CT很難區(qū)分良惡性；支氣管鏡檢查和經皮肺穿刺可以獲取病理組織，但侵入性檢查通常有不良反應甚至會危及到患者生命；痰液脫落細胞學檢查和血清中與肺癌相關蛋白質標志物檢測的敏感度和特異性有限，需要新的標志物來輔助肺癌的臨床診斷?；赾ircRNA的特點其不易被核酸外切酶降解，故它可以作為肺癌早期診斷的有效生物標志物。

本研究結果顯示hsa_circ_0044569在肺癌中表達顯著上調，且穩(wěn)定性較好，ROC曲線分析其具備成為肺癌早期診斷標志物的潛能。hsa_circ_0044569對于診斷肺癌具有重要意義，且對于肺腺癌和肺鱗癌的鑒別有一定的作用。因本實驗納入的樣本數量有限，存在選樣偏倚的可能性，后期需要更多的臨床實驗數據進一步的研究其可行性。