沙棘提取物通過(guò)CD68 對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制研究

高娟，邢海洲

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450052）

淋巴瘤是血液系統(tǒng)惡性腫瘤，彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是常見(jiàn)的惡性淋巴瘤，目前臨床上多采用利妥昔單抗聯(lián)合化療的治療方法，因治療手段單一且部分患者易復(fù)發(fā)，所以需要研發(fā)新的治療手段，為患者臨床治療提供新方向[1,2]。 沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是一種傳統(tǒng)中藥，含有多種天然活性物質(zhì)，其提取物主要有類(lèi)胡蘿卜素、黃酮類(lèi)化合物、多糖和沙棘油等，具有殺菌、抗氧化、增加免疫力、抗癌抑瘤等作用[3]。 有研究發(fā)現(xiàn)沙棘總黃酮可增強(qiáng)心功能和對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，從而發(fā)揮抗心肌缺血的作用[4]。 沙棘黃酮可抑制人前列腺癌PC-3 細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。 但沙棘提取物對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響還尚未清楚。 CD68是巨噬細(xì)胞的表面抗原標(biāo)記，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（Tumor associated macrophage，TAM）是淋巴瘤微環(huán)境的重要成分，TAM 數(shù)量在DLBCL 中增高，是其預(yù)后不良的指標(biāo)[6]。 有研究發(fā)現(xiàn)CD68 在原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤中高表達(dá)，與較差的總體存活和無(wú)進(jìn)展存活相關(guān)，影響患者預(yù)后[7]。 胃癌組織中CD68 過(guò)表達(dá)，可作為判斷胃癌病情的參考指標(biāo)[8]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究沙棘提取物對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其機(jī)制是否與CD68 有關(guān)。 為淋巴瘤的治療提供新思路和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人B 淋巴瘤細(xì)胞Raji 購(gòu)自上海君瑞生物技術(shù)有限公司。 沙棘提取物購(gòu)自西安天瑞生物有限公司； 胎牛血清、RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；LipofectamineTM 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司； 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和碘化丙錠（PI）試劑盒、二辛可寧酸（BCA）試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；載體質(zhì)粒購(gòu)自上?；偕锟萍加邢薰?。 Thermo FC 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；FACS caliber 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人B 淋巴瘤細(xì)胞Raji 復(fù)蘇后接種于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，1～2d 換一次新鮮培養(yǎng)液，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞處理與分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞Raji，無(wú)血清培養(yǎng)12h 后分別加入終濃度為0.185mg/m、0.37mg/m、0.74mg/m 的沙棘提取物，作為沙棘提取物低、中、高濃度（HrL-L、HrL-M、HrL-H）組；未添加藥物的細(xì)胞作為正常對(duì)照（Con）組。 將CD68 干擾載體陰性對(duì)照（si-NC）、CD68 干擾載體（si-CD68）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞Raji 中，記為si-NC 組、si-CD68組；CD68 過(guò)表達(dá)載體陰性對(duì)照（pcDNA3.1）、D68過(guò)表達(dá)載體（pcDNA3.1-CD68）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞Raji 后再用0.74mg/ml 的沙棘提取物處理，記為HrL-H+pcDNA3.1 組、HrL-H+pcDNA3.1-CD68 組。 轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1A（P21）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、CD68 蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后提取總蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度后取40 μg 總蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，再分別加入一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜； 加入二抗室溫孵育90 min，TBST 洗滌3 次，用ECL 化學(xué)發(fā)光液顯像，用Quantity One 凝膠分析軟件處理，測(cè)定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。 每個(gè)蛋白樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.2.4 MTT 試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性 各組細(xì)胞培養(yǎng)至48h 時(shí)分別加入5mg/ml 的MTT 溶液20μl，37℃孵育4h；棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO 后振蕩反應(yīng)15 min，然后用酶標(biāo)儀于490nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（A）值。 細(xì)胞活性（%）=實(shí)驗(yàn)組A 值/空白對(duì)照組A 值×100%。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后用PBS 漂洗2 次，加500 μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，先后加入Annexin VFITC 和PI 避光孵育。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.00 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料以±s 表示，兩組比較行t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 增殖的影響 與對(duì)照組相比，隨著沙棘提取物濃度的升高，細(xì)胞Raji 中Cyclin D1 表達(dá)水平逐漸顯著降低，P21 表達(dá)水平逐漸顯著升高,細(xì)胞活性逐漸顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1，表1。 可見(jiàn),沙棘提取物可抑制細(xì)胞Raji 增殖，且呈濃度依賴(lài)性。 選用抑制作用較為明顯的沙棘提取物濃度0.74 mg/ml, 即HrL-H 用做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 增殖的影響（±s，n=9）

表1 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 增殖的影響（±s，n=9）

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與HrL-L 組比較，#P＜0.05；與HrL-M 組比較，&P＜0.05。Con：未用藥物處理的細(xì)胞；HrL-L：沙棘提取物0.185 mg/mL；HrL-M：沙棘提取物HrL 0.37 mg/mL；HrL-H：沙棘提取物0.74 mg/ml。

分組 Cyclin D1 P21 24h細(xì)胞活性（490 nm）48h 72h Con HrL- L HrL- M HrL- H FP 0.74±0.07 0.60±0.06*0.43±0.04*#0.21±0.02*#&178.857 0.000 0.14±0.01 0.18±0.02*0.29±0.03*#0.50±0.05*#&240.231 0.000 0.53±0.05 0.43±0.04*0.34±0.03*#0.22±0.02*#&116.000 0.000 0.86±0.09 0.69±0.07*0.55±0.05*#0.38±0.04*#&87.719 0.000 1.21±0.12 0.92±0.09*0.72±0.07*#0.59±0.06*#&84.619 0.000

圖1 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 增殖蛋白表達(dá)的影響

2.2 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 凋亡的影響 與Con相比，HrL-H 組細(xì)胞Raji 中Bax 表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2，表2?？梢?jiàn)，沙棘提取物促進(jìn)細(xì)胞Raji 凋亡。

圖2 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 凋亡的影響

表2 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 凋亡的影響（±s，n=9）

表2 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 凋亡的影響（±s，n=9）

注：與Con 組比較，*P＜0.05。

分組Con HrL-H t P Bax Bcl-2 0.23±0.02 0.78±0.08*20.009 0.000 0.81±0.08 0.33±0.03*16.854 0.000凋亡率（%）7.83±0.78 23.24±2.41*18.251 0.000

2.3 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 中CD68 表達(dá)的影響與Con 相比，HrL-H 組細(xì)胞Raji 中CD68 表達(dá) 水平顯著降低（P＜0.05）,見(jiàn)圖3，表3。 可見(jiàn)，沙棘提取物抑制細(xì)胞Raji 中CD68 表達(dá)。

圖3 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 中CD68 蛋白表達(dá)的影響

表3 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 中CD68 表達(dá)的影響（±s，n=9）

表3 沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 中CD68 表達(dá)的影響（±s，n=9）

注：與Con 組比較，*P＜0.05。

分組 CD68 Con HrL-H t P 0.85±0.08 0.27±0.03*20.365 0.000

2.4 抑制CD68 對(duì)細(xì)胞Raji 增殖、凋亡的影響 與si-NC 組相比，si-CD68 組細(xì)胞Raji 中CD68 表達(dá)水平顯著降低，Cyclin D1、Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，P21、Bax 表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4，表4，表5。 可見(jiàn)，抑制CD68 表達(dá)抑制細(xì)胞Raji 增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

表4 抑制CD68 對(duì)細(xì)胞Raji 增殖的影響（±s，n=9）

表4 抑制CD68 對(duì)細(xì)胞Raji 增殖的影響（±s，n=9）

注：與si-NC 組比較，*P＜0.05。

分組 CD68 Cyclin D1 P21 24h細(xì)胞活性（490 nm）48h 72h si- NC si- CD68 t P 0.82±0.08 0.34±0.03*16.854 0.000 0.73±0.07 0.27±0.03*18.120 0.000 0.12±0.01 0.41±0.04*21.101 0.000 0.52±0.05 0.29±0.03*11.833 0.000 0.88±0.09 0.46±0.05*12.238 0.000 1.23±0.12 0.71±0.07*11.229 0.000

表5 抑制CD68 對(duì)細(xì)胞Raji 凋亡的影響（±s，n=9）

表5 抑制CD68 對(duì)細(xì)胞Raji 凋亡的影響（±s，n=9）

注：與si-NC 組比較，*P＜0.05。

分組si-NC si-CD68 t P Bax Bcl-2 0.21±0.02 0.65±0.06*20.871 0.000 0.82±0.08 0.47±0.05*11.130 0.000凋亡率（%）7.86±0.78 19.67±2.11*15.750 0.000

圖4 抑制CD68 對(duì)細(xì)胞Raji 增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

2.5 過(guò)表達(dá)CD68 能逆轉(zhuǎn)沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji增殖的抑制作用與Con 相比，HrL-H 組細(xì)胞Raji中CD68 表達(dá)水平顯著降低，Cyclin D1 表達(dá)水平顯著降低，P21 表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低（P＜0.05）；與HrL-H+pcDNA3.1 組相比，HrLH+pcDNA3.1-CD68 組細(xì)胞Raji 中CD68 表達(dá)水平顯著升高，Cyclin D1 表達(dá)水平顯著升高，P21 表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5，表6。 可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)CD68 能逆轉(zhuǎn)沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 增殖的抑制作用。

表6 過(guò)表達(dá)CD68 能逆轉(zhuǎn)沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 增殖的抑制作用（±s，n=9）

表6 過(guò)表達(dá)CD68 能逆轉(zhuǎn)沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 增殖的抑制作用（±s，n=9）

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與HrL-L 組比較，#P＜0.05。

分組 CD68 Cyclin D1 P21 24h細(xì)胞活性（490 nm）48h 72h Con HrL- H HrL- H+pcDNA3.1 HrL- H+pcDNA3.1- CD68 F P 0.84±0.08 0.27±0.03*0.28±0.03 0.67±0.07#224.336 0.000 0.73±0.07 0.21±0.02*0.23±0.02 0.58±0.06#258.936 0.000 0.14±0.01 0.50±0.05*0.52±0.05 0.20±0.02#256.582 0.000 0.53±0.05 0.22±0.02*0.23±0.02 0.43±0.04#171.612 0.000 0.88±0.09 0.38±0.04*0.36±0.04 0.69±0.07#141.093 0.000 1.23±0.12 0.59±0.06*0.61±0.06 0.93±0.09#111.354 0.000

圖5 增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.6 過(guò)表達(dá)CD68 能逆轉(zhuǎn)沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji凋亡的促進(jìn)作用 與Con 相比，HrL-H 組細(xì)胞Raji中Bax 表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低,細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與HrL-H+pcDNA3.1 組相比，HrL -H +pcDNA3.1-CD68 組細(xì)胞Raji 中Bax 表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 表達(dá)水平顯著升高,細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6,表7。 可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)CD68 能逆轉(zhuǎn)沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 凋亡的促進(jìn)作用。

表7 過(guò)表達(dá)CD68 能逆轉(zhuǎn)沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 凋亡的促進(jìn)作用（±s，n=9）

表7 過(guò)表達(dá)CD68 能逆轉(zhuǎn)沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 凋亡的促進(jìn)作用（±s，n=9）

注：與Con 組比較，*P＜0.05；與HrL-L+pcDNA3.1 組比較，#P＜0.05。

分組Con HrL-H HrL-H+pcDNA3.1 HrL-H+pcDNA3.1- CD68 FP Bax Bcl-2 0.23±0.02 0.79±0.08*0.82±0.08 0.36±0.03#228.936 0.000 0.81±0.08 0.32±0.03*0.31±0.03 0.65±0.06#188.212 0.000凋亡率（%）7.83±0.78 23.43±2.45*24.58±2.52 10.06±1.10#194.719 0.000

圖6 凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

DLBCL 是常見(jiàn)的非霍奇金淋巴瘤亞型, 具有高度異質(zhì)性[9];研究發(fā)現(xiàn)中藥在DLBCL 的治療中有一定作用[10]。 沙棘作為傳統(tǒng)中藥，具有增強(qiáng)免疫力和抗腫瘤的作用, 研究報(bào)道沙棘總黃酮可刺激NK92-MI 細(xì)胞激活, 增強(qiáng)NK92-MI 細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷力[11]。 沙棘葉提取物可以保護(hù)神經(jīng)元PC-12 細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[12]。 沙棘漿果的同型半乳糖醛酸通過(guò)TLR4/MyD88 途徑介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)活性[13]。 沙棘水提物可減輕短波紫外線(xiàn)輻射對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT 的氧化損傷，抑制HaCaT 細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，且呈劑量依賴(lài)[14]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沙棘提取物處理的人B 淋巴瘤細(xì)胞Raji 中細(xì)胞周期蛋白D1 （Cyclin D1）表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1A（Cyclin-dependent kinase inhibitor1A，P21）表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表達(dá)水平顯著升高，B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 （B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）表達(dá)水平顯著降低；細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高。 Cyclin D1 是細(xì)胞周期正調(diào)控因子，高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，P21 是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子，抑制細(xì)胞增殖；Bax 是促凋亡因子，Bcl-2 是抑凋亡因子，有研究發(fā)現(xiàn)抗凋亡的BCL-2 在DLBCL 細(xì)胞系和患者中高表達(dá)[15]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明沙棘提取物可抑制人B 淋巴瘤細(xì)胞Raji 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)CD68 在DLBCL 中高表達(dá)，CD68 高表達(dá)的淋巴瘤患者預(yù)后較差，其可作為淋巴瘤患者的預(yù)后指標(biāo)[16]。 乳腺癌組織中CD68 蛋白表達(dá)升高，參與了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)[17]。 CD68 在胃癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期增高而增高，與胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[18]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑制CD68表達(dá)后，Cyclin D1、Bcl-2 表達(dá)水平顯著降低，P21、Bax 表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活性顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高。 說(shuō)明抑制CD68 表達(dá)可抑制人B淋巴瘤細(xì)胞Raji 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 且本研究還發(fā)現(xiàn)，沙棘提取物處理的細(xì)胞Raji 中CD68 表達(dá)水平顯著降低，而過(guò)表達(dá)CD68 逆轉(zhuǎn)了沙棘提取物對(duì)細(xì)胞Raji 增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。 提示，沙棘提取物可能通過(guò)下調(diào)CD68 的表達(dá)影響細(xì)胞Raji 的增殖和凋亡。

綜上所述，沙棘提取物可抑制人B 淋巴瘤細(xì)胞Raji 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與CD68的表達(dá)有關(guān)。 將可為淋巴瘤的診斷與治療提高新思路和新途徑。