TGFB1 和TLR4 mRNA 在糖尿病腎病患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及其與病情嚴(yán)重度的關(guān)系

陳雪輝，王迪，孟祥雨，海潔

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，河南 衛(wèi)輝 453100）

糖尿病腎病（DN）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，是終末期腎病的主要原因之一[1]。 在中國，DN發(fā)病率呈現(xiàn)快速增長的趨勢[2]。 有研究顯示，DN 發(fā)生發(fā)展與機(jī)體炎性反應(yīng)、 免疫系統(tǒng)紊亂等密切相關(guān)[3]。 轉(zhuǎn)化生長因子B1（TGFB1）是介導(dǎo)DN 腎小球硬化的主要細(xì)胞因子。 在血管緊張素、高血糖的刺激下，糖尿病患者TGFB1 mRNA 表達(dá)被激活，引起細(xì)胞外基質(zhì)集聚，導(dǎo)致腎小球硬化[4]。 Toll 樣受體4（TLR4）是Toll 樣受體成員之一，可刺激炎性因子的轉(zhuǎn)錄和合成，激活炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，促進(jìn)炎癥因子的釋放[5]。 本研究主要探討TGFB1 mRNA 和TLR4 mRNA 在DN 患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及與病情程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年12月-2018年12月于本院門診和住院治療的186 例2 型糖尿病患者為研究對象，其中男性85 例，女性101 例，年齡39～81歲，平均55.26±7.12歲。 排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并遺傳性腎病、 急性腎小球腎炎等疾病患者； ⑵合并心、肝等重要臟器功能障礙者；⑶合并糖尿病其他嚴(yán)重并發(fā)癥患者。 參照《中國2 型糖尿病防治指南（2013年版）》[6]及《糖尿病腎病防治專家共識（2014年版）》[7]中的2 型糖尿病診斷及DN 診斷、臨床分期參考標(biāo)準(zhǔn)，將2 型糖尿病患者分為單純2 型糖尿病組（A 組）62 例；早期DN 組（B 組）47 例；臨床期DN 組（C 組）42 例；腎衰竭期組（D 組）35 例。 另選取同時期于本院體檢的60 例健康人群作為對照組，男性27 例，女性33 例，年齡40～78歲，平均年齡54.68±6.49歲。 各組患者性別、年齡和BMI 比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 各組患者性別、年齡和體重指數(shù)比較

1.2 體格檢查 測量所有受試者血壓、 身高和體重，并計算體重指數(shù)（BMI）。 BMI=體重（kg）/身高2（m2）。

1.3 血液標(biāo)本采集和臨床指標(biāo)檢測 采集所有受試者清晨空腹肘靜脈血5ml，全自動生化儀檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、空腹血糖（FBG）、血肌酐，高效液相法檢測糖化血紅蛋白（HbAlc）。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測外周血單核細(xì)胞TGFB1mRNA 和TLR4mRNA 表達(dá) 使用天津灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司的人單核細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞，參照說明書進(jìn)行操作。 采用RNA 抽屜試劑盒提取外周血單核細(xì)胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA 的純度和濃度。 參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其合成為cDNA，并以cDNA 為模板，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃10 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72℃30 s，共35 個循環(huán)。 引物序列：TGFB1 上游5'-CGAGCCCTGGACACCAATCA-3'，下 游5' -AGGCAGAAATTGGCGTGGTA -3'；TLR4上游5'-ATGAGGACTGGGTGAGAAACG-3'，下游5'-TCAAAGATACACCAACGGCTC -3'；β -actin 上游5'-GTAAA GACCTCTATGCCAACA -3'，下 游5'-GGACTCATCGTACTCCTGCT -3'。 以β-actin 為內(nèi)參，2－△△Ct法計算TGFB1 和TLR4 的mRNA 相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS.22.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)。 計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 兩組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗。 多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗。兩組連續(xù)變量相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)性分析。 多因素Logistic 回歸分析影響DN 的危險因素。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象外周血單核細(xì)胞TLR4、TGFB1 mRNA 表達(dá)水平的比較 單因素方差分析顯示，各組研究對象外周血單核細(xì)胞TLR4、TGFB1 mRNA表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，外周血單核細(xì)胞TLR4、TGFB1 mRNA 表達(dá)水平，D 組顯著高于C 組、B 組、A 組、對照組（P＜0.05），C 組顯著高于B 組、A 組、對照組（P＜0.05），B 組患者顯著高于A 組、 對照組（P＜0.05），A 組患者顯著高于對照組（P＜0.05）。 見表2。

表2 各組研究對象TLR4、TGFB1 mRNA 表達(dá)水平的比較（±s）

表2 各組研究對象TLR4、TGFB1 mRNA 表達(dá)水平的比較（±s）

分組對照組A 組B 組C 組D 組總例數(shù) TLR4 mRNA相對表達(dá)量50 62 47 42 35 1.05±0.08 1.26±0.11 1.84±0.19 2.25±0.23 3.12±0.34 TGFB1 mRNA相對表達(dá)量1.04±0.05 1.37±0.13 1.65±0.18 2.31±0.25 2.97±0.31

2.2 DN 患者外周血單核細(xì)胞TLR4、TGFB1 mRNA表達(dá)水平與各指標(biāo)的相關(guān)性分析DN 患者外周血單核細(xì)胞TLR4 mRNA、TGFB1 mRNA 表達(dá)水平與血清TG、TC、LDL-C，F(xiàn)BG，全血HbAlc 等指標(biāo)呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與血清HDL-C，eGFR 等指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與年齡、病程、體重指數(shù)、收縮壓、舒張壓等指標(biāo)無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。 見表3。

表3 DN 患者TLR4、TGFB1 mRNA表達(dá)水平與各指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.3 影響DN 發(fā)生發(fā)展的多因素Logistic 回歸分析血清LDL-C，F(xiàn)BG，HbAlc，外周血單核細(xì)胞TLR4、TGFB1 mRNA 是DN 發(fā)生發(fā)展的獨立危險因素（P＜0.05），血清HDL-C 是DN 發(fā)生發(fā)展的獨立保護(hù)因素（P＜0.05）。 見表4。

表4 影響DN 發(fā)生發(fā)展的多因素Logistic 回歸分析分析

3 討論

糖尿病屬于代謝紊亂性炎性疾病，炎癥在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 TGFB1 是目前公認(rèn)的腎臟促纖維化因子。 研究顯示，DN 組患者血清TGFB1 水平明顯高于單純糖尿病患者，與腎臟病理改變的嚴(yán)重程度呈正相關(guān),原因可能與高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞TGFB1 mRNA 表達(dá)激活有關(guān)[8]。抑制TGFB1 等信號通路可減輕炎性反應(yīng)，從而減輕和延緩腎間質(zhì)纖維化[9]。 TLR4 是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白，在腎疾病中發(fā)揮重要作用。 研究顯示，抑制TLR4 表達(dá)可降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞炎性因子表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)集聚，延緩DN 進(jìn)展[10]。本研究顯示，DN 患者外周血單核細(xì)胞中TGFB1 和TLR4 mRNA 表達(dá)均高于健康體檢者，且TGFB1 和TLR4 mRNA 表達(dá)水平隨著DN 患者病情的嚴(yán)重程度逐漸增加，不同階段DN 患者中TGFB1 和TLR4 mRNA 表達(dá)水平差異顯著，提示外周血單核細(xì)胞中TGFB1 和TLR4 mRNA 表達(dá)水平可反映DN 患者病情嚴(yán)重程度，對于該疾病的診斷具有重要價值。機(jī)體內(nèi)升高的脂質(zhì)沉積在腎小球基底膜，會刺激膜底膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外間質(zhì)生成，導(dǎo)致腎小球硬化和間質(zhì)損害[11]。 有報道稱，脂代謝紊亂是DN的危險因素，HDL-C 降低、TG 和LDL-C 的異常升高是DN 進(jìn)展的獨立危險因素[12,13]，與本研究結(jié)果一致。 本研究還顯示，DN 患者外周血單核細(xì)胞TLR4 和TGFB1 的mRNA 表達(dá)均與TG、TC、LDLC 指標(biāo)呈正相關(guān)，與HDL-C 呈負(fù)相關(guān)。

HbAlc 是血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與葡萄糖經(jīng)非酶促反應(yīng)結(jié)合的產(chǎn)物,其合成速度較慢而且不可逆轉(zhuǎn)，HbAlc 值能反應(yīng)檢測前8～12 周的平均血糖水平,且與血糖升高程度及持續(xù)時間呈顯著正相關(guān)，常輔助FBG 對糖尿病進(jìn)行診斷，以及對糖尿病血糖控制效果進(jìn)行評估[14]。 本研究顯示,FBG 和HbAlc 水平升高是影響DN 發(fā)生發(fā)展的危險因素，與相關(guān)研究報道結(jié)果一致[15,16]。 DN 患者外周血單核細(xì)胞TLR4 和TGFB1 的mRNA 表達(dá)與FBG 和HbAlc 水平呈正相關(guān)，說明TLR4 和TGFB1 也可用于反映糖尿病腎病的嚴(yán)重程度。

綜上所述，TGFB1 和TLR4 mRNA 在DN 患者中呈高表達(dá)，并且DN 患者病情越嚴(yán)重，其表達(dá)越高，兩者均是影響DN 發(fā)生發(fā)展的危險因素。