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    尋常型銀屑病患者皮損組織中miR- 124- 3p表達(dá)水平及意義

    2022-01-06 04:07:02翟翊然曹麗楠李偉棟
    關(guān)鍵詞:生物科技銀屑病皮損

    翟翊然,曹麗楠,李偉棟

    (南陽市中心醫(yī)院皮膚科,河南 南陽 473000)

    銀屑?。≒soriasis Vulgaris,PV)是一種表皮過度增殖的慢性炎癥性皮膚病, 其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,目前認(rèn)為炎癥、表皮細(xì)胞過度增殖和免疫學(xué)異常是其發(fā)病機(jī)制的3 個(gè)中心環(huán)節(jié)[1]。 miR -124-3p是微小RNAs(microRNAs,miRNAs)的一員,在膠質(zhì)瘤、膀胱癌、肝細(xì)胞癌和肺癌等惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化和發(fā)展中表現(xiàn)出顯著的抑制作用[2]。 近年來研究顯示,miR-124-3p 在特應(yīng)性濕疹患者的慢性皮損皮膚中表達(dá)降低[3],可以靶向調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transduction and transcriptional activators 3,STAT3)蛋白表達(dá),參與炎癥、多組織損傷等[4,5]。 STAT3 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,參與炎癥反應(yīng)、 角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生等多種病理生理過程,在PV 發(fā)病中起重要作用[6]。 基于此,我們推測(cè)miR-124-3p 可能作為STAT3 的上游調(diào)節(jié)因子,參與PV 的發(fā)生和進(jìn)展,但其具體作用和機(jī)制尚不清楚。 本研究檢測(cè)miR-124-3p 及STAT3 在尋常型銀屑病皮損組織中的表達(dá),并探討miR-124-3p 參與銀屑病的發(fā)病機(jī)制,以期為尋常型銀屑病的臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 選取2018年3月-2020年7月在本院確診的102 例尋常型銀屑病患者,男62 例,女40 例,年齡24~65歲,平均40.15±9.83歲,其中進(jìn)行期患者50 例,靜止期患者52 例,病程6 個(gè)月~17年。 納入標(biāo)準(zhǔn):⑴所有患者按照《中國銀屑病診療指南》(2018 版)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[7],并經(jīng)組織病理檢查確診;⑵患者行為能力正常,能積極配合本次研究,且病歷資料完整;⑶年齡≥18歲。 排除標(biāo)準(zhǔn):⑴患者3 個(gè)月內(nèi)服用治療藥物,例如:糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等;⑵并發(fā)其他疾病者,例如:凝血障礙性疾病、惡性腫瘤、其他自身免疫性疾病及感染性疾病者;⑶隨訪過程中無法聯(lián)系者、病歷資料不完整者;⑷術(shù)前已行放療、化療者。 另收集102例正常人皮膚組織(經(jīng)整形外科手術(shù)切除)作為對(duì)照組,男57 例,女45 例,年齡22~60歲,平均38.25±8.19歲,兩組間性別與年齡比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P 值均>0.05)。 本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者及家屬均簽署知情同意書。

    1.2 主要試劑 RNA 抽提試劑Trizol (廣州泰勒生物科技有限公司);miRNA 分離試劑盒(Ambion miRNA Isolation Kit,美 國Ambion 公 司);miR -124-3p 特異性引物和U6 內(nèi)參特異性引物均由上海艾研生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成,序列為:miR-124-3p 上游引物5'-GGGTATTGAG -GAAGGTGTT-3'、下游引物5' -CAGTGCGTGTCGTG -GAGT-3';內(nèi)參U6 上游引物5'-GAGCCACAGCGTAACG-3'、下游引物5' -CTAGCA -CATAGTACAGG-3';STAT3 兔多克隆抗體(上海江萊生物科技有限公司);β-actin 單克隆抗體(上海江萊生物科技有限公司);通用型二步法檢測(cè)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司);鼠兔通用型二抗試劑盒(PV-6000);DAB 顯色試劑盒(上海江萊生物科技有限公司);BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京中科瑞泰生物科技有限公司)。

    1.3 皮膚組織總RNA 的提取 對(duì)皮損組和對(duì)照組進(jìn)行皮膚活檢,兩組均是大小約1cm×0.5cm 被切下的皮膚組織,然后分別剪切成2~3 小塊,迅速儲(chǔ)存在液氮中,之后放入-80℃中保存。待所有樣本前處理結(jié)束后,使用液氮研磨皮膚組織至粉末狀,并將研缽及杵均滅菌均保存在-80℃下,過夜,第二天將粉末倒入去RNA 酶的EP 管中,根據(jù)說明書采用Trizol 法提取細(xì)胞系總RNA。

    1.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 將上述抽提的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,逆轉(zhuǎn)錄條件:25℃,10min;50℃,45 min;85℃,5 min。 按照PCR試劑盒說明檢測(cè)成熟的miR,以cDNA 為模板,miR-124-3p 和U6 熒光探針作引物擴(kuò)增,反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃,10 min;95℃,15s;、60℃,1min;共40 個(gè)循環(huán)。 所有試驗(yàn)重復(fù)3 次,相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法測(cè)定: 用△Ct 值代表基因的相對(duì)定量,△Ct 值=目的基因Ct 值-同組內(nèi)參Ct 值,△△Ct 值=各樣本△Ct 值-最低樣本△Ct 值,基因表達(dá)的差別倍數(shù)用2-△△Ct值表示。

    1.6 STAT3 表達(dá)檢測(cè) 在勻漿器的球狀部位加入少量皮膚組織,再加入去污劑裂解液,混合后進(jìn)行勻漿,重復(fù)碾壓樣本3 次,使皮膚組織完全裂解。30min 后在在4℃下,12000r/min,離心5min,取適當(dāng)被稀釋過的上清液。 蛋白濃度采用BCA 法來測(cè)定,然后對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行調(diào)整,采用免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)皮膚組織中STAT3 的表達(dá)。 采取的具體步驟:⑴經(jīng)過灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜等一系列操作后,用5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液將膜裝入其中;⑵將標(biāo)本制置于室溫?fù)u床1h,然后加入一抗稀釋液5ml,混合均勻,并放于4℃冰箱過夜;⑶再加入二抗稀釋液(配比為1:10000)10mL置于搖床上1h,待顯色后,將其置于暗室內(nèi)進(jìn)行壓片曝光顯影。 最后用Quantity-one 圖像軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析及光密度值掃描,分別計(jì)算出目的蛋白條帶與β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的強(qiáng)度,然后把結(jié)果相除計(jì)算出其比值(%)。

    1.5 皮損面積和嚴(yán)重程度評(píng)分 對(duì)患者進(jìn)行PASI評(píng)分,病情程度根據(jù)PASI 評(píng)分分級(jí),重度≥30 分、中度15~29 分、輕度<15 分[8]。 PASI 評(píng)分=皮損面積×[0.1×(Dh+Ih+Eh)+0.2×(Du+Iu+Eu)+0.3×(Dl+Il+El)+0.4×(Dt+It+Et)],E:紅斑,I:浸潤,D:鱗屑,h:頭(包括頸),u:上肢,t:下肢,l:軀干,皮疹部位均為5 個(gè)等級(jí):0~4 分。 皮損面積為(0~6)分,0%為0 分;<10%為1 分;10%~29%為2 分;30%~49%為3 分;50%~69%為4 分;70%~89%為5 分;90%~100%為6 分。 總分(0~72)分,得分越高,皮損越嚴(yán)重。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用兩樣本獨(dú)立t 檢驗(yàn)比較組間差異,采用Pearson 相關(guān)分析尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-124-3p 表達(dá)水平與PASI 評(píng)分的相關(guān)性,P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 皮損組織和正常組織中miR -124 -3p 與STAT3 的表達(dá) 尋常型銀屑病患者皮損組織及對(duì)照組中均檢測(cè)出有miR-124-3p 表達(dá),皮損組及對(duì)照組中miR-124-3p 表達(dá)的2-△△Ct值分別為0.82 ±0.09 和1.20±0.17,皮損組明顯低于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ;通過Western blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),皮損組和對(duì)照組STAT3 表達(dá)量分別為0.52±0.07 和0.25±0.05,皮損組顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

    圖1 皮損組及對(duì)照組中miR- 124- 3p 和表達(dá)水平

    2.3 miR-124-3p 和STAT3 表達(dá)水平與尋常型銀屑病臨床病理特征之間的關(guān)系 分析這些皮損組織樣本與患者年齡、性別、病程和臨床分期等病理特征發(fā)現(xiàn),miR-124-3p 和STAT3 表達(dá)水平與年齡、性別和病程等病理特征無相關(guān)性(P>0.05),但與患者的臨床分期有關(guān)。 在進(jìn)行期患者皮損中,miR-124-3p 表達(dá)水平更低,與靜止期患者的miR-124-3p 表達(dá)水平比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 而進(jìn)行期患者皮損中的STAT3 表達(dá)水平比靜止期患者的更高,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見表1。

    表1 miR- 124- 3p 在尋常型銀屑病患者皮損中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系(±s)

    表1 miR- 124- 3p 在尋常型銀屑病患者皮損中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系(±s)

    臨床病理特征 例數(shù) P STAT3 t P年齡(歲)≥60歲<60歲性別miR- 124- 3p t 1.056 0.293 1.539 0.127 48 54 0.81±0.09 0.83±0.10 0.53±0.06 0.51±0.07 1.173 0.243 0.719 0.473男女病程62 40 0.82±0.08 0.84±0.09 0.53±0.06 0.52±0.08 1.104 0.272 1.864 0.065≥5年<5年臨床分期進(jìn)行期靜止期42 60 0.80±0.09 0.82±0.09 0.54±0.08 0.51±0.08 7.788<0.001 5.012<0.001 50 52 0.75±0.08 0.89±0.10 0.56±0.08 0.49±0.06

    2.4 皮損組中miR-124-3p 與STAT3 的相關(guān)性分析 采用Pearson 相關(guān)分析患者皮損組織中miR-124-3p 表達(dá)水平與STAT3 的相關(guān)性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-124-3p 表達(dá)水平與STAT3 呈負(fù)相關(guān)(r=-0.835, P<0.001),見圖2。

    圖2 皮損組中miR- 124- 3p 與STAT3 的相關(guān)性分析

    2.5 miR-124-3p 和STAT3 表達(dá)量與PASI 評(píng)分的相關(guān)性分析 皮損組中所有患者的PASI 評(píng)分為10.9~29.5 分,平均18.22±7.84 分。 采用Pearson 相關(guān)分析尋常型銀屑病患者皮損中miR-124-3p 表達(dá)水平及其與PASI 評(píng)分的相關(guān)性,兩者呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.778,P<0.001); STAT3 表達(dá)水平及其PASI 評(píng)分的相關(guān)性,兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.818,P<0.001),見圖3、4。

    圖3 miR- 124- 3p 表達(dá)量與PASI 評(píng)分的相關(guān)性分析相

    3 討論

    圖4 STAT3 表達(dá)量與PASI 評(píng)分的相關(guān)性分析相

    銀屑病是一種T 細(xì)胞介導(dǎo)皮膚病,屬于慢性炎癥性疾病,其特征是表皮增生、 角質(zhì)形成細(xì)胞(KCs)異常分化和血管過度增生[9,10]。 銀屑病除了表現(xiàn)為皮膚臨床癥狀,還會(huì)發(fā)生一系列合并癥,包括由銀屑病導(dǎo)致的關(guān)節(jié)炎、 心血管疾病和代謝綜合征等,其對(duì)患者的正常生活產(chǎn)生較大的影響[11]。 既往研究顯示[12,13],在表皮和毛囊中存在多種高表達(dá)的miRNA,包括miR-125b、miR-21、miR-203 等可以調(diào)控皮膚發(fā)育和功能,參與銀屑病等多種皮膚病的發(fā)生、發(fā)展。 本研究探討了尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-124-3p 的表達(dá)水平,結(jié)果顯示miR-124-3p 在尋常型銀屑病患者皮損組織中的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組明顯下調(diào),STAT3 蛋白表達(dá)明顯上調(diào),說明miR-124-3p 和STAT3 表達(dá)異常可能與尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。 既往研究顯示,miR-124-3p 可以調(diào)控多種腫瘤的生物學(xué)行為,抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡[14,15]。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-124-3p 還可以促進(jìn)皮損組織修復(fù)、愈合[16],但其在銀屑病發(fā)生中的調(diào)控機(jī)制尚不明確。 STAT3 是一種蛋白質(zhì),參與了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的信號(hào)傳遞,在角質(zhì)形成細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用起著關(guān)鍵因素。 Nakajima 等[17]發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損組織中STAT3 異?;罨?,STAT3 通過與相應(yīng)的miRNA 結(jié)合抑制角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖,對(duì)于銀屑病的發(fā)生、發(fā)展起著重要的保護(hù)作用。Shan 等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-124-3p 通過干擾STAT3的3' 非編碼區(qū)負(fù)向調(diào)控STAT3 的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。 本研究結(jié)果顯示,miR-124-3p 表達(dá)水平與STAT3 呈負(fù)相關(guān)性,提示miR-124-3p可能通過調(diào)節(jié)STAT3 蛋白表達(dá),參與銀屑病的進(jìn)展。

    本研究結(jié)果還顯示尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-124-3p 表達(dá)量與PASI 評(píng)分具有相關(guān)性。 通過分析所選患者的臨床分期以及對(duì)比PASI評(píng)分發(fā)現(xiàn),皮損嚴(yán)重程度隨著皮損面積的增大而增大,則miR-124-3p 表達(dá)水平相應(yīng)降低,而STAT3 表達(dá)水平則升高。 同時(shí),miR-124-3p 在進(jìn)行期患者皮損組織中有著更低的表達(dá)水平,說明miR-124-3p 在臨床上能隨銀屑病的病理變化而變化,但與患者性別、年齡及病程沒有顯著相關(guān)性。 已有研究顯示,STAT3 表達(dá)水平與PASI 評(píng)分存在相關(guān)性[19]。提示miR-124-3p 和STAT3 可以作為評(píng)估尋常型銀屑病嚴(yán)重程度的相關(guān)性因子。

    綜上所述,尋常型銀屑病患者皮損組織中miR-124-3p 及其可能調(diào)控的靶基因蛋白STAT3表達(dá)水平與PASI 評(píng)分密切相關(guān),可望作為疾病的進(jìn)展及預(yù)后評(píng)估指標(biāo),為臨床治療銀屑病提供參考。

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