微柱凝膠法檢測(cè)頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉誘導(dǎo)形成藥物性抗體的可行性研究

王波，楊訊，韓海心，辛葉，楊旭

（南陽(yáng)市中心醫(yī)院輸血科，河南 南陽(yáng) 473000）

藥物誘導(dǎo)免疫性溶血性貧血（drug-induced immune hemolytic anemia，DIHA） 是一種免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG） 或免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM） 介導(dǎo)細(xì)胞毒性抗體的II型變態(tài)反應(yīng)，因在臨床較為少見，故容易被忽視[1,2]。DIHA 發(fā)病機(jī)制是機(jī)體中產(chǎn)生某種藥物的抗藥物抗體，如藥物再次使用將導(dǎo)致溶血，多見于患者使用抗菌藥物后[3,4]。目前臨床鮮有關(guān)于藥物性抗體及其檢測(cè)方式的相關(guān)報(bào)道，患者發(fā)生溶血后分析其發(fā)生原因面臨著一定的困難。 微柱凝膠法是一種通過觀察凝膠柱介質(zhì)中紅細(xì)胞抗原和相應(yīng)抗體的凝集反應(yīng)判斷是否有抗體生成的新型免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，相較于以往的試管法抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)、菠蘿酶法具有操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短等優(yōu)勢(shì)，但關(guān)于其應(yīng)用于抗菌素藥物性抗體生成情況的檢測(cè)中的研究尚少[5,6]。 頭孢菌素類藥物在臨床有著廣泛的應(yīng)用范圍，其中80%左右可誘發(fā)DIHA，同時(shí)相關(guān)報(bào)道也所有增加[7-10]。 頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉分別屬于第一代、第二代頭孢菌素，抗菌譜廣，殺菌力強(qiáng)，通常用于敏感性菌株感染性疾病的治療。 本研究選取使用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉的168 例患者為研究對(duì)象，分析微柱凝膠法檢測(cè)兩種藥物誘導(dǎo)形成藥物性抗體的可行性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年10月-2020年2月本院采用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉治療的患者168例，男91 例，女77 例；年齡19～78歲，平均（47.16±5.39）歲；頭孢唑啉鈉治療98 例，頭孢西丁鈉治療70 例。 納入標(biāo)準(zhǔn)： 入院前7 d 未使用抗菌藥物治療； 入院后采用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉治療＞3 d； 采用藥物治療后血液標(biāo)本中血紅蛋白水平＜用藥之前。 本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 藥物、試劑與儀器 頭孢唑啉鈉（1.0 g；深圳立健藥業(yè)有限公司；國(guó)藥準(zhǔn)字H20143067）；頭孢西丁鈉（1.0 g； 揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司； 國(guó)藥準(zhǔn)字H20057973）；LISS/Coombs/IgG +C3d 微柱凝膠卡（管中為中性凝膠，并含抗人球蛋白血清、低離子介質(zhì)，中山市生科試劑儀器有限公司）；O 型血健康受試者新鮮血液（采集自健康獻(xiàn)血者，EDTA 抗凝后冷藏）；待檢血液（采集自頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉治療的患者，EDTA 抗凝后冷藏）。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)多功能離心機(jī)TD2Y（中山市生科試劑儀器有限公司）；F37-12X2 37℃恒溫孵育器（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 間接抗人球蛋白試驗(yàn)（Indirect Antiglobulin Test，IAT） 篩查不規(guī)則抗體 清晨采集患者空腹?fàn)顟B(tài)下5ml 左右靜脈血，加入EDTA 抗凝。 血漿標(biāo)本與不規(guī)則抗體篩查細(xì)胞各50μl，加入微柱凝膠試驗(yàn)卡（含抗球蛋白試劑），37℃下孵育20min，1000 r/min 離心半徑12cm 離心3min，2000r/min 離心半徑10cm 離心2min，判定結(jié)果。

1.3.2 直接抗人球蛋白試驗(yàn) （direct antiglobulin test，DAT） 用0.9%的氯化鈉溶液經(jīng)濃縮紅細(xì)胞稀釋為0.8%紅細(xì)胞懸液，取50μl 加入微柱凝膠試驗(yàn)卡（含抗球蛋白試劑），1000r/min 離心半徑12cm離心3min，2000r/min 離心半徑10cm 離心2min，判定結(jié)果。如標(biāo)本DAT 結(jié)果為陽(yáng)性，繼續(xù)檢測(cè)其血漿及放散液中藥物性抗體； 如標(biāo)本DAT 結(jié)果為陰性，繼續(xù)檢測(cè)其血漿中藥物性抗體。

1.3.3 放散實(shí)驗(yàn) 從DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本中采集濃縮紅細(xì)胞1ml，經(jīng)生理鹽水洗滌3 次，嚴(yán)格按照《輸血技術(shù)操作規(guī)程》進(jìn)行酸放散試驗(yàn)，并快速離心、分離放散液。

1.3.4 制備空白O 型人紅細(xì)胞 采集20 例O 型血健康受試者新鮮血液，混合均勻后取壓積紅細(xì)胞10ml 于試管中，再混合生理鹽水90ml，2500r/min離心半徑10cm 離心3min，棄上清，采用生理鹽水將紅細(xì)胞洗滌3 次，制備為不含有藥物的空白紅細(xì)胞待用。

1.3.5 制備頭孢唑啉鈉、 頭孢西丁鈉包被紅細(xì)胞藥物0.1 g 溶于巴比妥緩沖液（pH 為9.6～9.8）0.25 ml 中，并與洗滌后O 型紅細(xì)胞170μl 混合均勻；另取一試管，加入等量巴比妥緩沖液與O 型紅細(xì)胞。兩試管均于室溫下孵育2h，每10min 輕搖勻1 次，之后生理鹽水洗滌3 次紅細(xì)胞，前者即為頭孢唑啉鈉、頭孢西丁鈉包被紅細(xì)胞，后者即為無藥物包被紅細(xì)胞。 使用前采用生理鹽水配置為2%紅細(xì)胞懸液。

1.3.6 鑒定藥物包被紅細(xì)胞 抗體檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性與陰性對(duì)照試劑（50μl）和2%紅細(xì)胞（藥物包被、無藥物包被各25μl）混合，加入微柱凝膠卡，37℃孵育1h，1000r/min 離心半徑12cm 離心3min，2000r/min 離心半徑10cm 離心2min。 采用兩種頭孢抗菌素抗體陰性與陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)試劑檢測(cè)藥物包被紅細(xì)胞，判定是否包被成功。

1.3.7 微柱凝膠柱凝集試驗(yàn)檢測(cè)藥物性抗體 取20μl 2%頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉紅細(xì)胞懸液，置于微柱凝膠柱上，同時(shí)再加100μl 待測(cè)血清，放置于恒溫孵育器中孵育20min，然后經(jīng)卡式定速離心機(jī)離心（1030r/min 離心15min）。 微柱凝膠抗人球蛋白卡自左向右標(biāo)記4 個(gè)孔，第1 個(gè)孔加入患者血漿/放散液50μl，藥物包被O 型紅細(xì)胞25μl；第2 個(gè)孔加入患者血漿/放散液50μl，無藥物包被O型紅細(xì)胞25μl； 第3 個(gè)孔加入混合的0 型紅細(xì)胞對(duì)應(yīng)血漿50μl，藥物包被O 型紅細(xì)胞25μl； 第4個(gè)孔加入混合的0 型紅細(xì)胞對(duì)應(yīng)血漿50μl，無藥物包被O 型紅細(xì)胞25μl。觀察微柱凝膠離心結(jié)果，陰性：紅細(xì)胞懸液沉積至微柱凝膠底部；陽(yáng)性：紅細(xì)胞懸液滯留于微柱凝膠上；弱陽(yáng)性：紅細(xì)胞群滯留于凝膠柱中間。 記錄凝集結(jié)果，如僅有第1 個(gè)孔中發(fā)生凝集，則為藥物性抗體陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方式 采用SPSS 19.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，以[n（%）]表示計(jì)數(shù)資料，理論頻數(shù)為1～5時(shí)行校正χ2檢驗(yàn)，＞5 時(shí)行χ2檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IAT 檢測(cè)結(jié)果 168 例血漿標(biāo)本中不規(guī)則抗體篩查結(jié)果均未出現(xiàn)陽(yáng)性。

2.2 DAT 檢測(cè)結(jié)果 168 例血漿標(biāo)本中DAT 結(jié)果陽(yáng)性32 例（19.05%），其中采用頭孢唑啉鈉治療的患者陽(yáng)性20 例，采用頭孢西丁鈉治療的患者陽(yáng)性12 例。

2.3 藥物包被紅細(xì)胞鑒定結(jié)果 微柱凝膠抗人球蛋白卡第1 孔（加入陰性對(duì)照試劑與藥物包被紅細(xì)胞）無凝集，第2 孔（加入陰性對(duì)照試劑與無藥物包被紅細(xì)胞）無凝集，第3 孔（加入陽(yáng)性對(duì)照試劑與藥物包被紅細(xì)胞）凝集，第4 孔（加入陽(yáng)性對(duì)照試劑與無藥物包被紅細(xì)胞）無凝集。 由此可見，僅有第3 孔發(fā)生凝集，提示藥物包被紅細(xì)胞成功。

2.4 頭孢唑啉鈉、 頭孢西丁鈉藥物性抗體陽(yáng)性率頭孢唑啉鈉藥物性抗體陽(yáng)性率高于頭孢西丁鈉（P＜0.05）； 頭孢唑啉鈉DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本與頭孢西丁鈉DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本中藥物性抗體陽(yáng)性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；頭孢唑啉鈉DAT結(jié)果陰性標(biāo)本中藥物性抗體陽(yáng)性率高于頭孢西丁鈉DAT 結(jié)果陰性標(biāo)本（P＜0.05）。 見表1。

表1 頭孢唑啉鈉、頭孢西丁鈉藥物性抗體陽(yáng)性率比較[n（%）]

2.5 DAT 陽(yáng)性標(biāo)本放散液檢測(cè)結(jié)果 頭孢唑啉鈉、頭孢西丁鈉DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本中不規(guī)則抗體檢測(cè)結(jié)果均為陰性，藥物性抗體均為陽(yáng)性。 見表2。

表2 DAT 陽(yáng)性標(biāo)本放散液檢測(cè)結(jié)果

3 討論

機(jī)體中生成藥物依賴性抗體是導(dǎo)致DIHA 的常見機(jī)制，通常為頭孢類藥物、哌拉西林等所致，DAT 試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)患者常表現(xiàn)為貧血、乏力、黃疸等溶血征象，蒼白、黃疸、脾腫大、淋巴結(jié)腫大等，甚至危及生命[11]。 因此，用藥前采取準(zhǔn)確、有效的藥物性抗體監(jiān)測(cè)預(yù)警技術(shù)，減少DIHA 發(fā)生，保障臨床用藥安全，避免藥物誘導(dǎo)性抗體導(dǎo)致的輸血性溶血。

微柱凝膠法通過離心技術(shù)、凝膠過濾技術(shù)、抗原抗體發(fā)生反應(yīng)的原理，凝集的紅細(xì)胞不能穿過凝膠間隙，留置于凝膠上層，從而呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，而未發(fā)生凝集的紅細(xì)胞在離心力作用下可穿過凝膠間隙沉積于凝膠柱底部，從而呈現(xiàn)陰性結(jié)果[12,13]。DAT 是檢測(cè)機(jī)體中已被補(bǔ)體或不完全抗體致敏的紅細(xì)胞，通常用于新生兒溶血病、 溶血性輸血反應(yīng)、藥物性溶血性貧血等的檢測(cè)。 既往研究顯示[14]，DAT 結(jié)果陽(yáng)性的標(biāo)本與藥物性抗體關(guān)系密切。 本研究結(jié)果顯示，168 例患者血漿標(biāo)本與DTA 結(jié)果為陽(yáng)性的標(biāo)本放散液中不規(guī)則抗體均顯示陰性，可排除實(shí)驗(yàn)過程中血型相關(guān)意外抗體陽(yáng)性導(dǎo)致假陽(yáng)性的可能性。此外，本研究的DAT 結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本中，血漿與放散液中均存在有兩種頭孢抗菌素的藥物性抗體；且DAT 結(jié)果陰性標(biāo)本中，同樣存在兩種頭孢抗菌素藥物性抗體。 分析原因可能為：DAT陽(yáng)性結(jié)果可能并非藥物性抗體所致； 部分患者在發(fā)生DIHA 部分癥狀時(shí)，已經(jīng)接受了抗菌藥物治療，誘使紅細(xì)胞表面吸附大量藥物性抗體，導(dǎo)致DAT 陽(yáng)性。 通常情況下，采用抗人球蛋白介質(zhì)試管法時(shí)需要洗滌紅細(xì)胞3 至4 次后才可用于檢測(cè)，但即使洗滌后血清蛋白極微量的殘留也可能與抗人球蛋白試劑中和。 洗滌不標(biāo)準(zhǔn)、不完全均可能導(dǎo)致結(jié)果可靠性降低，還可能由于抗體分子太少與紅細(xì)胞結(jié)合后無法被檢測(cè)出來。 根據(jù)紅細(xì)胞與IgG結(jié)合的檢測(cè)方式因采用的檢測(cè)方式不同而結(jié)果存在差異，相較于試管法，微柱凝膠法敏感性更強(qiáng)，該檢測(cè)方式不需要洗滌紅細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)加樣與結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)可控也是其優(yōu)勢(shì)之一[15,16]。然而，在某些特殊情況下，例如變形性較差的鐮狀細(xì)胞難以正常通過凝膠柱，影響結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性，需臨床檢測(cè)人員細(xì)心觀察并分析患者臨床診斷結(jié)果，需要時(shí)使用試管法DAT 鑒定、分析。

此外，本研究結(jié)果中，頭孢唑啉鈉及其DAT 陰性標(biāo)本中藥物性抗體陽(yáng)性率均高于頭孢西丁鈉，提示頭孢唑啉鈉面臨著更高的藥物性抗體形成風(fēng)險(xiǎn)； 兩種頭孢抗菌素的DAT 陽(yáng)性標(biāo)本中藥物性抗體陽(yáng)性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因可能是當(dāng)DAT 表現(xiàn)為陽(yáng)性時(shí)，患者已出現(xiàn)DIHA 相關(guān)癥狀，該種情況下產(chǎn)生的藥物性抗體可能與藥物的使用無關(guān)。

綜上所述，微柱凝膠法檢測(cè)頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉誘導(dǎo)形成藥物性抗體時(shí)操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，可行性強(qiáng)，可用于臨床檢驗(yàn)工作。 采用頭孢唑啉鈉和頭孢西丁鈉誘發(fā)DIHA 大多為外科手術(shù)圍術(shù)期預(yù)防性使用抗生素患者，如輸血患者發(fā)生溶血，特別是血管內(nèi)溶血時(shí)需要和輸血反應(yīng)進(jìn)行鑒別，以防誤診。 即便患者僅對(duì)一種頭孢菌素發(fā)生DIHA，同樣需建議其今后注意使用其他頭孢類藥物。