LncRNA CASC2表達(dá)在肝癌中的臨床意義及對細(xì)胞增殖的調(diào)控

李江濤 許 俊

(1.枝江市人民醫(yī)院 普通外科，湖北 枝江 443200； 2. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 胃腸外科， 湖北 宜昌 443003)

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國每年肝癌的新發(fā)和死亡病例均占全球一半以上[1]。近年來，雖然肝癌的早期診斷技術(shù)得到了提高，但由于其發(fā)病隱匿，早期無顯著癥狀，大部分確診患者已進(jìn)展到中晚期，難以進(jìn)行有效的手術(shù)治療，從而導(dǎo)致肝癌患者的5年生存率較低[2]。因此，深入研究肝癌發(fā)生和進(jìn)展的分子機(jī)制，對于尋找新的診治標(biāo)志物，提高肝癌患者的預(yù)后具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一類長度大于200 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，可通過影響轉(zhuǎn)錄激活、表觀修飾等機(jī)制對多種生物學(xué)過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用[3]。目前已發(fā)現(xiàn)多種lncRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。腫瘤易感性候選基因2(cancer susceptibility candidate 2, CASC2)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，其在非霍奇金淋巴瘤[4]、胃癌[5]、結(jié)直腸癌[6]中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用，但在肝癌中少有報(bào)道。本研究旨在探討CASC2在肝癌中的調(diào)控作用，并分析其表達(dá)的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料

本研究的組織樣本均來源于我院普外科收治的42例肝癌患者，其中癌旁正常組織距離腫瘤邊緣≥2 cm。所有患者均經(jīng)病理確診且隨訪資料完整，患者術(shù)前未經(jīng)過抗腫瘤治療。所有患者每1～3個(gè)月隨訪1次，隨訪過程記錄患者腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、生存情況，持續(xù)2年；2年后每6個(gè)月隨訪1次，2020年12月1日結(jié)束隨訪或患者死亡。所有患者均簽署知情同意書，研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721、Huh7、HCCLM3和正常肝細(xì)胞系HL7702均購自中國科學(xué)院。細(xì)胞采用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 RT-PCR檢測

采用Trizol試劑按照使用說明提取肝癌組織和細(xì)胞中總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。采用SYBR Green法進(jìn)行RT-PCR檢測，以U6作為內(nèi)參，結(jié)果采用2-△△Ct法進(jìn)行分析。設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃，5 min；再40個(gè)循環(huán)的95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s。其中CASC2上游引物序列：5‘-AGCGGTACCCCTGGCCGCGTCCT-3’，下游引物序列：5‘-TTGAGGGTCACGGCAGCACATTC-3’；miR-221上游引物序列：5‘-GGATCGGTGCATGTACTGC-3’，下游引物序列：5‘-CAGTGGCTGCATAAGAGT-3’；U6上游引物序列：5‘-ACACTCGTTGCTAGCGGTAT-3’；下游引物序列：5‘-ACACTGGGTCAGGTACCTGTC-3’。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用LipofectamineTM 2000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，首先將Huh7細(xì)胞接種到6孔板中，接種密度為每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞生長24 h后(匯合度>80%)，分別將pcDNA3.0-CASC2及其對照pcDNA3.0-NC與LipofectamineTM 2000試劑混勻，轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 CCK-8檢測

將對數(shù)期的Huh7細(xì)胞接種到96孔板中，接種密度為每孔7.5×103個(gè)細(xì)胞，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)平行孔。各組細(xì)胞分別于轉(zhuǎn)染后的24 h、48 h、72 h和96 h加入CCK-8試劑，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值，并繪制生長曲線。

1.6 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell小室的上室和下室分別加入無血清培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基，將200 μL的細(xì)胞懸液(密度為1×105個(gè)/mL)接種至Transwell小室的上室中，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。去除表面殘留細(xì)胞后，用0.5%(w/v)結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，隨機(jī)選取5個(gè)復(fù)孔計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)先準(zhǔn)備40 mL的Matrigel膠置于4℃冰箱中過夜，再與無血清培養(yǎng)基混合均勻，加入上室中，余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

通過TargetScan和Starbase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，CASC2與miR-221存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。分別將CASC2-WT和CASC2-MUT序列片段構(gòu)建至psiCHECK2載體，采用LipofectamineTM 2000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，48 h后采用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用Student’st檢驗(yàn)或單因素方差分析，采用Kaplan-Meier法和Logrank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，并對預(yù)后影響因素進(jìn)行多因素Cox分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CASC2在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)情況

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，CASC2在42例肝癌患者腫瘤組織中表達(dá)顯著低于癌旁正常組織(P<0.05)，如圖1A所示。同樣，在4種肝癌細(xì)胞系中，CASC2的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，如圖1B所示。

注：A：CASC2在42例肝癌組織中表達(dá)；B：CASC2在4種肝癌細(xì)胞系中表達(dá)。均以U6為內(nèi)參計(jì)算CASC2的相對表達(dá)量；與Normal組相比，**P<0.01；與HL7702組相比，*P<0.05圖1 CASC2在肝癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況

2.2 CASC2表達(dá)對肝癌患者臨床病理參數(shù)的影響

根據(jù)CASC2在肝癌組織中表達(dá)的中位數(shù)，將肝癌患者分為CASC2高表達(dá)組和CASC2低表達(dá)組，分析發(fā)現(xiàn)，CASC2表達(dá)與患者性別、年齡、乙型肝炎病毒(hepatitis b virus, HBV)感染、腫瘤大小及分化程度無關(guān)(均P>0.05)，而與腫瘤TNM分期和有無血管侵犯具有顯著的相關(guān)性(均P<0.05)，如表1所示。

表1 CASC2表達(dá)與肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 CASC2表達(dá)對肝癌患者預(yù)后的影響

預(yù)后分析結(jié)果顯示，CASC2高表達(dá)者比低表達(dá)者具有更長的總生存周期(overall survival，OS)和無病生存期(disease free survival，DFS)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008，P=0.015)，如圖2所示。CASC2高表達(dá)組的中位生存期為(2.44±0.21)年，顯著高于CASC2低表達(dá)者的中位生存期(1.25±0.17)年，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 CASC2表達(dá)對肝癌患者OS和DFS的影響

2.4 CASC2對Huh7肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，過表達(dá)CASC2后，CASC2組細(xì)胞的CASC2表達(dá)水平顯著高于CASC2-NC組(P<0.05)，如圖3A所示。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CASC2過表達(dá)組的細(xì)胞增殖活性顯著低于CASC2-NC組(P<0.05)，如圖3B所示。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CASC2過表達(dá)組發(fā)生遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)顯著少于CASC2-NC組(P<0.05)，如圖3C～3E。

注：A：各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中，以U6為內(nèi)參CASC2的相對表達(dá)；B：CCK-8檢測各組肝癌細(xì)胞的增殖活性；C：Transwell檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲情況；D：各組的遷移細(xì)胞數(shù)；E：各組的侵襲細(xì)胞數(shù)；與CASC2-NC組相比，*P<0.05圖3 CASC2對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

2.5 CASC2靶基因預(yù)測及驗(yàn)證

生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-221與CASC2存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，如圖4A所示。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，在野生型CASC2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221可觀察到細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，如圖4B，表明CASC2與miR-221存在直接靶向關(guān)系。進(jìn)而采用RT-PCR檢測各組細(xì)胞和組織樣本中miR-221的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CASC2過表達(dá)組細(xì)胞中miR-221的表達(dá)水平顯著低于對照組(P<0.05)，如圖4C所示。臨床肝癌組織中miR-221表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)，如圖4D。肝癌組織中CASC2與miR-221的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.324 4，P=0.002)，如圖4E所示。

2.6 miR-221對過表達(dá)CASC2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力影響

為證實(shí)CASC2是通過靶向作用miR-221發(fā)揮其調(diào)控作用的，我們在CASC2過表達(dá)組細(xì)胞中進(jìn)一步轉(zhuǎn)染miR-221 mimics。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-221 mimics后細(xì)胞miR-221表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Huh7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均得到顯著增強(qiáng)，與CASC2過表達(dá)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，如圖5所示。

注：A：生物信息學(xué)預(yù)測miR-221與CASC2存在靶向結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶檢測CASC2與 miR-221的靶向作用關(guān)系，與miR-221-NC組相比，*P<0.05；C：miR-221在各組細(xì)胞中的表達(dá)，以U6為內(nèi)參，與CASC2-NC組相比，*P<0.05；D：miR-221在臨床肝癌組織樣本中的表達(dá)，以U6為內(nèi)參，與Normal組相比，*P<0.05；E：CASC2與miR-221的相關(guān)性分析圖4 CASC2與miR-221的直接靶向作用及相關(guān)性分析

3 討論

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度在200 nt以上的RNA分子，已被證實(shí)與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，近年來，關(guān)于lnRNA在腫瘤中調(diào)控作用的研究逐漸被關(guān)注[7]。與miRNA不同的是，lncRNA可通過轉(zhuǎn)錄、翻譯等多個(gè)水平影響基因的表達(dá)。隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)參與了肝癌的發(fā)生和進(jìn)展過程。lncRNA CASC2通過調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡等發(fā)揮抑制腫瘤進(jìn)展的作用[8]，其在多種惡性腫瘤中表達(dá)降低。有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CASC2在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)水平與患者的TNM分期、腫瘤分化程度及患者的預(yù)后相關(guān)[9]。Xu等[10]發(fā)現(xiàn)，CASC2在胰腺癌中低表達(dá)，CASC2高表達(dá)的胰腺癌患者具有更長的總生存周期，CASC2可通過調(diào)控miR-24/MUC6信號軸影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。Li等[11]研究表明，過表達(dá)CASC2可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。另有研究發(fā)現(xiàn)，CASC2可作為競爭性內(nèi)源RNA調(diào)控miR-18a-5p，從而影響PTEN的表達(dá)，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲[12]。

我們通過分析臨床組織樣本發(fā)現(xiàn)，CASC2在肝癌患者腫瘤組織中顯著下調(diào)，且其表達(dá)水平與腫瘤TNM分期和有無血管侵犯具有顯著相關(guān)性。進(jìn)而通過預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，CASC2高表達(dá)的患者比CASC2低表達(dá)的患者具有更長的OS和DFS。這表明CASC2可影響肝癌患者的疾病進(jìn)展程度，并可能成為臨床上肝癌預(yù)后判斷的潛在指標(biāo)。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)CASC2在4種肝癌細(xì)胞系中均顯著低表達(dá)，這與腫瘤組織中的檢測結(jié)果一致。其中在Huh7細(xì)胞中的相對表達(dá)水平最低，因此選此細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染建立CASC2過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均被顯著抑制。一般情況下， lncRNA可靶向調(diào)控下游miRNA的表達(dá)[13]。通過生物信息學(xué)分析我們篩選出miR-221與CASC2存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)CASC2可靶向作用于miR-221，且在肝癌細(xì)胞和組織樣本中，CASC2與miR-221的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在CASC2過表達(dá)組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221 mimics，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-221后Huh7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著增強(qiáng)，這進(jìn)一步證實(shí)了CASC2是通過靶向作用miR-221發(fā)揮其調(diào)控作用的。

注：A：以U6為內(nèi)參，miR-221在各組細(xì)胞中的相對表達(dá)；B：miR-221對過表達(dá)CASC2細(xì)胞增殖能力的影響；C： Transwell檢測細(xì)胞的遷移和侵襲；D：miR-221對過表達(dá)CASC2細(xì)胞遷移能力的影響；F：miR-221對過表達(dá)CASC2細(xì)胞侵襲能力的影響；與CASC2組相比，*P<0.05圖5 miR-221對過表達(dá)CASC2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力影響

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CASC2在肝癌中低表達(dá)，且其表達(dá)水平與肝癌患者的腫瘤進(jìn)展程度和不良預(yù)后顯著相關(guān)。CASC2可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控miR-221的表達(dá)有關(guān)，但相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步探討。