基于數(shù)據(jù)庫分析COL1A2在肝細胞癌組織中的表達及對預后的影響

鄂志野，文怡欣，張 珊，聶 影，趙珈華，海艷潔，鞠寶玲，張紅軍

(牡丹江醫(yī)學院 1.免疫學教研室；2.病原生物學教研室；3.附屬紅旗醫(yī)院腫瘤科,黑龍江 牡丹江 157011)

肝細胞癌是全球發(fā)病率及死亡率均較高危害最為嚴重的腫瘤之一[1]，其死亡率在癌癥相關(guān)的死亡率中排名第三，每年在全球范圍內(nèi)因肝癌造成的死亡人數(shù)超過50萬[2]。HCC占所有原發(fā)性肝癌(Primary liver cancer，PLC)病例的75%～85%，是PLC的主要組織學類型。在臨床中，甲胎蛋白(AFP)作為一種診斷和預后生物標志物發(fā)揮著重要作用，但其敏感性和特異性不令人滿意，一些生理活動可能影響AFP的表達，因此，篩選對肝癌更敏感的診斷及預后生物標志物對于指導肝癌的治療具有重要意義。

Ⅰ型膠原蛋白存在于大多數(shù)結(jié)締組織和胚胎組織中，是膠原蛋白家族的重要成員，而膠原蛋白家族是細胞外基質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分。Ⅰ型膠原蛋白由兩條Ⅰ型膠原蛋白α1(COL1A1)鏈和一條Ⅰ型膠原蛋白α2(COL1A2)鏈組成。COL1A2具有多種生物學功能，近年來發(fā)現(xiàn)可在結(jié)腸癌、黑色素瘤等多種組織呈高表達狀態(tài)，且在癌細胞增殖、分化、侵襲等病理過程中發(fā)揮作用[3]，本研究通過生物信息學技術(shù)探討COL1A2在HCC組織的表達變化及其對肝癌預后的影響。

1 材料與方法

1.1 癌癥的基因分析通過GEPIA 2.0(http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)網(wǎng)絡平臺利用TCGA數(shù)據(jù)在線分析COL1A2在正常肝組織中及HCC組織中的表達量。通過UALCAN(http://ulcan.path.uab.edu/index.html)在線分析COL1A2與HCC腫瘤分級，分期及TP53基因突變的相關(guān)性，探討COL1A2對HCC發(fā)生發(fā)展的影響。

1.2 生存分析利用Kaplan-Meier(http://kmplot.com/analysis)網(wǎng)站評估COL1A2的差異表達對HCC整體存活率(OS)、無進展生存率(PFS)，無復發(fā)存活率(RFS)的影響。

1.3 免疫浸潤分析利用TIMER(http://timer.comp-genomics.org/)在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫HCC腫瘤組織中COL1A2的表達水平與CD8+T淋巴細胞腫瘤組織浸潤的相關(guān)性。通過GEPIA 2.0網(wǎng)絡平臺在線分析HCC癌組織中COL1A2的表達與T淋巴細胞免疫抑制檢查點PD-1、CTLA4的相關(guān)性。

1.4 GEO分析在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫中下載GSE101728(HCC中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達譜)GSE134568(間充質(zhì)亞型HCC基因表達數(shù)據(jù))GSE135375(miR-221介導HCC基因表達數(shù)據(jù))數(shù)據(jù)集，綜合分析驗證COL1A2在肝臟組織與HCC癌組織中的差異表達。

2 結(jié)果

2.1 COL1A2與HCC發(fā)展的相關(guān)性COL1A2表達在肝腫瘤組織中上調(diào)，并且COL1A2在存活時間的臨床意義也得到證實(如圖2)。為了進一步了解COL1A2對HCC發(fā)展的影響，我們在UALCAN分析了COL1A2的表達與肝癌腫瘤分級，腫瘤分期和TP53基因突變的相關(guān)性[4]。如(圖1A)所示，隨著腫瘤等級的增加，COL1A2表達進一步升高。同樣地，隨著腫瘤分期的進展，COL1A2表達也明顯上升(圖1B)，表明COL1A2表達水平與HCC的進展正相關(guān)。此外，TP53基因是機體的重要抑癌基因。其突變與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，TP53突變是HCC中最常見的突變，它會影響HCC的進展和預后。我們發(fā)現(xiàn)在TP53突變的HCC組織中COL1A2的表達較TP53無突變的HCC組織明顯升高(圖1C)，表明TP53基因突變伴隨著COL1A2的高表達，進而提示COL1A2的高表達與肝癌發(fā)展有關(guān)。

圖1 COL1A2表達與腫瘤分級、腫瘤分期和TP53突變的關(guān)系

2.2 COL1A2在HCC癌組織中表達及其對患者生存率的影響共納入369例肝癌(HCC)腫瘤樣本和160例正常肝組織樣本，在GEPIA[5]中評估COL1A2在HCC癌組織中表達，發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比，肝腫瘤組織中COL1A2表達升高(圖2A)。為了進一步明確HCC癌組織中COL1A2高表達對HCC發(fā)展的影響，我們進行了Kaplan-Meier生存分析[6]。如(圖2B～D)所示，COL1A2的表達量影響了患者無進展生存率(PFS)和無復發(fā)存活率(RFS)，而COL1A2表達高低對總體生存率影響差異不顯著，這些結(jié)果表明，肝癌組織中COL1A2水平與肝癌患者的生存預后有關(guān)，COL1A2表達高預后生存率較高，COL1A2表達低預后生存率相對較低。

圖2 COL1A2在正常組織與腫瘤組織中表達量的對比及其表達量的高低對患者生存預后的影響

2.3 COL1A2的表達對肝癌組織CD8+T細胞浸潤及抗腫瘤活性的影響運用Timer探討COL1A2對機體抗腫瘤免疫的影響[7]。顯示COL1A2與CD8+T細胞的浸潤度顯著相關(guān)(R=0.339，P=9.39×10-11，圖3A)。為進一步分析T細胞介導的抗腫瘤作用，我們評估了兩個經(jīng)典的免疫抑制檢查點，CTLA-4和PD-1與COL1A2表達的相關(guān)性。如圖3B和3C所示，COL1A2表達與CTLA-4和PD-1呈正相關(guān)相關(guān)，表明肝腫瘤組織中COL1A2升高會伴隨腫瘤組織中CTLA-4和PD-1的高表達。因為CTLA-4和PD-1的高表達可以抑制CD8+T細胞的殺傷腫瘤細胞活性，可見COL1A2可以通過調(diào)控CTLA-4和PD-1的表達繼而抑制CD8+T細胞的殺傷腫瘤細胞活性。

圖3 COL1A2的表達與肝癌組織CD8+T細胞浸潤及CTLA-4、PD-1表達的相關(guān)性

2.4 通過GEO數(shù)據(jù)庫綜合分析驗證COL1A2在HCC癌組織中的差異表達基因差異分析從GSE101728[8](HCC中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達譜)GSE134568(間充質(zhì)亞型HCC基因表達數(shù)據(jù))GSE135375(miR-221介導HCC基因表達數(shù)據(jù))三組數(shù)據(jù)分別用GEO2R進行差異分析，結(jié)果保留P≤0.05，Log.FC≥1或≤-1，將三組數(shù)據(jù)整理如(圖4)發(fā)現(xiàn)三組數(shù)據(jù)交集基因中包含COL1A2。從而證明COL1A2對HCC發(fā)展的關(guān)鍵的作用。

圖4 GSE101728、GSE134568和GSE135375三組數(shù)據(jù)差異基因的交集

3 討論

COL1A2是編碼Ⅰ型膠原α2鏈的重要基因，Ⅰ型膠原蛋白由兩條Ⅰ型膠原蛋白α1(COL1A1)鏈和一條Ⅰ型膠原蛋白α2(COL1A2)鏈組成。廣泛存在于細胞外基質(zhì)中。COL1A2 具有多種生物學功能，異常表達的甲基化的COL1A2可以引起機體內(nèi)環(huán)境的改變，從而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如顱內(nèi)動脈瘤、動靜脈畸形、腦出血等[9]。I型膠原纖維是膠原家族的主要成分，被認為是參與腫瘤侵襲和發(fā)展。然而，COL1A2在惡性腫瘤中的表達水平仍存在爭議。一方面，在腎細胞癌和HCC檢測COL1A1頻繁啟動子甲基化[10]，COL1A2在黑素瘤[11]，和膀胱癌下調(diào)[12]。在另一方面，COL1A2蛋白和mRNA表達的結(jié)腸直腸癌[13]和髓母細胞瘤被上調(diào)。

本研究主要通過TCGA數(shù)據(jù)庫運用在線工具GEPIA分析COL1A2在HCC組織表達量高于正常組織。生存分析顯示，COL1A2低表達的患者無進展生存(PFS)和無復發(fā)存活(RFS)生存期要長于高表達的患者，表明肝癌組織中COL1A2水平與肝癌患者的生存預后有關(guān)，COL1A2表達高預后生存率較低，COL1A2表達低預后生存率相對較高。有研究發(fā)現(xiàn)COL1A2在結(jié)腸癌組織中高表達，對腫瘤細胞的增殖、分化及侵襲具有促進作用，同時提高了腫瘤組織的臨床分期[15]。我們也在研究中發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤等級的增加，COL1A2表達進一步升高。同樣地，隨著腫瘤分期的進展，COL1A2表達也明顯上升，表明COL1A2表達水平與HCC的進展正相關(guān)。此外，TP53基因是機體的重要抑癌基因。其突變與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，TP53突變是HCC中最常見的突變，它會影響HCC的進展和預后。我們發(fā)現(xiàn)在TP53突變的HCC組織中COL1A2的表達較TP53無突變的HCC組織明顯升高，表明TP53基因突變伴隨著COL1A2的高表達，進而提示COL1A2的高表達與肝癌發(fā)展有關(guān)。

抗腫瘤免疫是決定腫瘤發(fā)展的重要因素，研究探討了COL1A2對機體抗腫瘤免疫的影響，顯示COL1A2與CD8+T細胞的浸潤度呈正相關(guān)；COL1A2表達與CTLA-4和PD-1正相關(guān)，表明肝腫瘤組織中COL1A2升高會伴隨腫瘤組織中CTLA-4和PD-1的高表達。CTLA-4和PD-1是兩個經(jīng)典的免疫抑制檢查點，CTLA-4和PD-1的高表達可以抑制CD8+T細胞的殺傷腫瘤細胞活性，可見COL1A2可以通過調(diào)控CTLA-4和PD-1的表達繼而抑制CD8+T細胞的殺傷腫瘤細胞活性。

為進一步綜合分析驗證COL1A2與肝癌的發(fā)展密切相關(guān)。從GEO數(shù)據(jù)庫抽取GSE101728(HCC中l(wèi)ncRNA和mRNA的表達譜)；GSE134568(間充質(zhì)亞型HCC基因表達數(shù)據(jù))；GSE135375(miR-221介導HCC基因表達數(shù)據(jù))三組數(shù)據(jù)進行差異分析取交集，發(fā)現(xiàn)三組交集的9個基因里包含COL1A2。顯示COL1A2高表達與肝癌的發(fā)展密切相關(guān)具有普遍性。

肝癌是世界上最具侵略性的癌癥之一，篩選對肝癌更敏感的診斷及預后生物標志物對于指導肝癌的治療具有重要意義。本研究分現(xiàn)，COL1A2可在HCC癌組織中高表達，通過促進TP53基因突變，誘導抗腫瘤細胞的免疫抑制與腫瘤的發(fā)展及患者生存密切相關(guān)，由此提示COL1A2具有作為篩查肝癌和判斷治療預后的標志物的潛力。