基于二代測(cè)序的碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌的分子特征分析*

陳典典，曹敬榮，白向榮，楊文碩，王培昌△

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2.藥學(xué)部，北京 100053

肺炎克雷伯菌(KP)是社區(qū)獲得性感染和院內(nèi)感染最常見(jiàn)的致病菌之一，臨床上根據(jù)其致病性的強(qiáng)弱分為經(jīng)典型肺炎克雷伯菌(cKP)和高毒力肺炎克雷伯菌(hvKP)[1]。隨著碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，hvKP菌株的耐藥性也逐漸增加，且已有產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)hvKP的報(bào)道[2]，而隨著耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(CRKP)在臨床上的大量出現(xiàn)，碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)分離株的報(bào)道越來(lái)越多[3]。CR-hvKP菌株不僅具有CRKP菌株的高耐藥性和傳播性，還具有hvKP菌株的高致病性，使得臨床治療非常棘手。既往研究發(fā)現(xiàn)，CRKP主要集中于CC258克隆復(fù)合群的ST11型和ST258型[4]，hvKP主要集中于CC258克隆復(fù)合群中的ST23、ST65及ST86型[5]。而二代測(cè)序?yàn)槿媪私饧?xì)菌耐藥、毒力基因分布、分子型別等的可靠方法，因此，為進(jìn)一步明確本院分離的CR-hvKP菌株，尤其CC258流行株的基因分布與分子特征，本研究收集本院分離的17株CR-hvKP，進(jìn)行了二代測(cè)序，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集本院檢驗(yàn)科2016—2020年臨床分離的17株CR-hvKP為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：改良碳青霉烯類(lèi)滅活試驗(yàn)(mCIM)與EDTA-碳青霉烯類(lèi)滅活試驗(yàn)(eCIM)陽(yáng)性，毒力表型試驗(yàn)陽(yáng)性，且同時(shí)存在耐藥基因KPC-2及毒力基因rmpA或Areo的CRKP菌株。排除標(biāo)準(zhǔn)：mCIM試驗(yàn)、eCIM試驗(yàn)和毒力表型試驗(yàn)陰性，PCR方法檢測(cè)不到耐藥或毒力基因。

1.2菌株篩選方法 通過(guò)Whonet5.6軟件篩選研究菌株，菌株的分離培養(yǎng)步驟按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》進(jìn)行操作，使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)儀(德國(guó)布魯克公司)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，采用Vitek 2 Compact細(xì)菌藥物敏感分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則和本院臨床研究相關(guān)規(guī)定，研究方案通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：臨研審2020052號(hào))。

1.3二代測(cè)序方法 參考文獻(xiàn)[6]，首先將留存菌株接種于血平板(英國(guó)Oxoid公司)進(jìn)行復(fù)蘇，35 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。使用DNA試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)提取細(xì)菌總DNA。采用Hisep 2500型Illumina高通量測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)進(jìn)行二代測(cè)序。使用SOAP、Spades、Abyss軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)拼接組裝，采用CISA軟件進(jìn)行整合，對(duì)結(jié)果進(jìn)行最終優(yōu)化處理，得到的基因組序列用于后期分析。

1.4耐藥、毒力基因和莢膜血清型的分子生物信息學(xué)分析 基因組序列首先使用GeneMarkS軟件進(jìn)行細(xì)菌的編碼基因預(yù)測(cè)。使用綜合抗菌藥物耐藥基因數(shù)據(jù)庫(kù)(ARDB)進(jìn)行耐藥基因分析。通過(guò)RGI軟件與ARDB數(shù)據(jù)庫(kù)中已知耐藥基因進(jìn)行比對(duì)，得到耐藥性相關(guān)基因的名稱及耐受的抗菌藥物種類(lèi)等信息。使用毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)(VFDB)分析毒力基因、功能和致病機(jī)制。通過(guò)Diamond軟件與VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)已知毒力基因進(jìn)行比對(duì)，得到毒力基因的名稱、基本特征描述、毒力基因功能和致病機(jī)制信息；將得到的基因組數(shù)據(jù)提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，與已知的莢膜血清型(K1-K82、KL103-KL125、KN1和KN2)序列進(jìn)行比對(duì)[7]，得到檢測(cè)菌株的血清型數(shù)據(jù)。耐藥和毒力基因選擇鑒定率≥90%基因進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。

1.5多位點(diǎn)序列分型(MLST)和分子克隆(CC) 將組裝后的基因組數(shù)據(jù)提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，利用7個(gè)管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB)序列結(jié)果進(jìn)行在線比對(duì)(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)，將比對(duì)的等位基因編碼組合與MLST庫(kù)中已經(jīng)提交的KP等位基因編碼組合進(jìn)行對(duì)比，獲得MLST分型。將本研究獲得的等位基因序列與eBURST網(wǎng)站(http://eburst.mlst.net)中的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)可得到CC鑒定結(jié)果(7個(gè)等位基因有6個(gè)相同定義為同一克隆系)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Whonet5.6軟件和SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用Fisher確切概率法。以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株標(biāo)本來(lái)源及耐藥情況 非重復(fù)的17株CR-hvKP中，16株(94.1%)分離自痰液標(biāo)本，1株(5.9%)分離自尿液標(biāo)本，復(fù)蘇后均經(jīng)MALDI-TOF MS二次鑒定。17株CR-hvKP均為多重耐藥菌株，對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)(第一、二、三代頭孢菌素，碳青霉烯類(lèi)，復(fù)合酶抑制劑類(lèi))、喹諾酮類(lèi)(環(huán)丙沙星和左氧氟沙星)、頭霉素類(lèi)(頭孢西丁)抗菌藥物均表現(xiàn)為100.0%耐藥，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑耐藥率最低，為23.5%；對(duì)阿米卡星和慶大霉素耐藥率為76.5%，未發(fā)現(xiàn)對(duì)替加環(huán)素和多黏菌素耐藥的菌株。

2.2CR-hvKP的分子分型和克隆型別 17株CR-hvKP菌株中10株為國(guó)際流行的CC258型克隆復(fù)合群ST11型，7株為國(guó)際上未分型的MLST新序列型別(新ST型)，CR-hvKP的MLST分型結(jié)果和克隆型別見(jiàn)表1。新ST型與ST11型的phoE等位基因不同，由phoE的1號(hào)等位基因點(diǎn)突變?yōu)?19號(hào)等位基因，見(jiàn)圖1。

表1 CR-hvKP的MLST分型結(jié)果和克隆型別

注：ST11型第58個(gè)堿基為C，新ST型變?yōu)門(mén)。

2.3CR-hvKP的耐藥基因分析 對(duì)基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行耐藥基因分析，共檢出29種耐藥基因，涉及8類(lèi)抗菌藥物耐藥表型，見(jiàn)圖2。17株CR-hvKP各自攜帶18～25個(gè)耐藥基因，見(jiàn)圖2。新ST型與ST11型相比所攜帶的耐藥基因存在較多差異：7株新ST型菌株均攜帶兩種及以上blaCTX-M基因，而ST11型僅1株(10%，1/10)攜帶兩種blaCTX-M基因(blaCTX-M-65和blaCTX-M-27)；新ST型中blaTEM-1基因占14%(1/7)，ST11型為70%(7/10)；blaTEM-2基因僅存在于新ST型菌株，而blaOXA-1基因僅在ST11型中出現(xiàn)，見(jiàn)圖2。CR-hvKP基因組中存在多種耐藥基因，包括5種氨基糖苷類(lèi)的基因(aph6id、aac6ib、ant2ia、acrb、acra)，3種甲氧嘧啶耐藥基因(dfra14、dfra12、dfra1)，2種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的耐藥基因(mpha、macb)，2種磷霉素耐藥基因(mdth、mdtg)，2種四環(huán)素耐藥基因(tetc、teta)，磺胺類(lèi)耐藥基因(sul1)、喹諾酮類(lèi)耐藥基因(mdtk)和氯霉素類(lèi)耐藥基因(catb3)各1種。ST11型菌株攜帶的耐藥基因較新ST型菌株更加復(fù)雜多元化。見(jiàn)圖2。

2.4CR-hvKP毒力基因分析 17株CR-hvKP 菌株共檢測(cè)到兩種莢膜血清型，包括14株(82.4%，14/17)KL64和3株KL47(17.6%，3/17)。10株ST11型菌中有7株(70.0%，7/10)為KL64，3株(30%，3/10)為KL47，7株新ST型菌株均為KL64型(100.0%，7/7)。CR-hvKP菌株毒力基因數(shù)據(jù)分析共獲得60多種相關(guān)毒力基因，包括鐵載體編碼基因氣桿菌素(iutA、iucA、iucB、iucC、iucD等)、耶爾森菌素(ybtA、ybtD、ybtE、ybtP、ybtQ、ybtS、ybtT、ybtU、irp1、irp2等)、沙門(mén)菌素(iroN)、腸桿菌素(ydbA、SenB/TieB、fepC)，莢膜多糖編碼基因Capsule(galF、wza等)、脂多糖編碼基因LPS(wbb0和wzm)、高黏液表型調(diào)節(jié)因子(rmpA、rmpA2)、菌毛相關(guān)編碼基因(mrkA、fimH等)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(RcsAB、fur)，以及Ⅳ型分泌系統(tǒng)相關(guān)編碼基因等。有12株CR-hvKP菌株同時(shí)檢測(cè)出iucA、rmpA、rmpA2和iroN基因。見(jiàn)圖3。

注:0為未攜帶該基因；1為攜帶1種亞型基因；2為攜帶2種亞型基因；3為攜帶3種亞型基因。

注：0為未攜帶該基因；1為攜帶1種亞型基因；2為攜帶2種亞型基因。

2.5耐藥與毒力基因差異分析 ST11型流行株與新ST型菌株中，耐藥基因blaCTX-M-27、blaTEM-1、blaTEM-2、ant2ia、sul1和毒力基因rmpA分布比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CR-hvKP分離株不同ST型菌株的主要差異耐藥基因和毒力基因分布[n(%)]

3 討 論

既往臨床認(rèn)為hvKP除對(duì)氨芐西林天然耐藥外，對(duì)臨床常用抗菌藥物保持高敏感性，隨著CRKP的分離率日益增加，目前已有hvKP耐藥性增加的報(bào)道[8-10]，尤其CR-hvKP的報(bào)道逐漸增多，使得臨床上最為廣泛使用的碳青霉烯類(lèi)藥物無(wú)法有效控制KP感染，臨床治療難度增加，甚至引起了醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)流行[11]。本研究通過(guò)對(duì)臨床分離自痰液和尿液標(biāo)本的17株CR-hvKP菌株的基因序列進(jìn)行分析，描繪了其攜帶的耐藥基因、毒力基因、分子型別等相關(guān)分子生物信息學(xué)的分布情況，以期為臨床制訂治療策略提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

CR-hvKP二代測(cè)序結(jié)果顯示，17株菌株均為國(guó)際流行的CC258克隆復(fù)合群，其中ST11型為主要流行株，與全國(guó)細(xì)菌耐藥檢測(cè)網(wǎng)(CHINET)報(bào)道結(jié)果一致[12]。17株CR-hvKP攜帶多種與抗菌藥物耐藥相關(guān)的基因，包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)基因(blaTEM、blaCTX-M和blaSHV)和碳青霉烯酶基因(blaKPC和blaOXA)[13-14]，其中編碼絲氨酸酶KPC基因(blaKPC-2)存在于全部CR-hvKP菌株中，是本院KP最常見(jiàn)的耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的決定性基因[15]。臨床應(yīng)重視位于質(zhì)粒上的blaKPC-2、blaCTX-M和blaTEM基因[16]，以防止這些基因在細(xì)菌間水平轉(zhuǎn)移產(chǎn)生更多耐藥菌，甚至引起醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)流行。β-內(nèi)酰胺類(lèi)耐藥基因方面，所有CR-hvKP均檢測(cè)出blaCTX-M基因，ST11型菌株主要為blaTEM-1基因，但新ST型菌株攜帶了更多的blaCTX-M亞型(兩種以上)，如blaTEM-2[17]，TEM-2含有賴氨酸，識(shí)別水解抗菌藥物的能力強(qiáng)于TEM-1，ST11型流行株與新ST型菌株耐藥基因blaTEM-1、blaTEM-2檢測(cè)結(jié)果有明顯差異；blaCTX-M-65是ST11型和新ST型菌株中檢測(cè)出最多的β-內(nèi)酰胺類(lèi)亞型，但新ST型中存在更多的blaCTX亞型，可能與其存在更復(fù)雜的耐藥機(jī)制及存在耐藥進(jìn)化有關(guān)，表明新ST型菌株在耐藥方面情況更復(fù)雜，更嚴(yán)峻。另外，本研究的CR-hvKP基因組中還檢測(cè)到了除上述基因外的其他類(lèi)型的耐藥基因,這些基因有可能導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥譜更為廣泛的超級(jí)耐藥菌，對(duì)我國(guó)乃至國(guó)際公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生巨大威脅[18]。值得注意的是，新ST型與ST11型菌株相比，雖然體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ST11型對(duì)阿米卡星多為敏感，但是實(shí)際上新ST型基因組中氨基糖苷類(lèi)耐藥基因ant2ia攜帶率明顯高于ST11型，造成體外藥敏實(shí)驗(yàn)與耐藥基因攜帶情況相悖的原因仍需要進(jìn)一步研究。由于體外實(shí)驗(yàn)無(wú)法完全代表體內(nèi)情況，此類(lèi)藥物具體臨床療效仍需進(jìn)一步確認(rèn)。新ST型磺胺類(lèi)藥物耐藥基因sul1的攜帶率高于ST11型，但體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)為新ST型與ST11型無(wú)明顯差異，所以復(fù)方磺胺類(lèi)藥物是否可用于治療新ST型感染需進(jìn)一步深入研究。體外藥敏實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)對(duì)替加環(huán)素和多黏菌素耐藥的CR-hvKP菌株，但檢測(cè)到tet耐藥基因，因此，臨床治療CR-hvKP感染時(shí)替加環(huán)素是否達(dá)到療效，有待進(jìn)一步觀察研究。

毒力基因結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究的菌株攜帶60多種毒力相關(guān)基因，包括莢膜多糖、與侵襲相關(guān)的基因、與黏附相關(guān)的基因、與莢膜形成相關(guān)的基因、與高毒力相關(guān)的rmpA/rmpA2基因、與宿主多部位散播感染和細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)相關(guān)的鐵載體編碼基因、與生物膜相關(guān)的編碼基因和與宿主不同部位免疫防御相關(guān)的編碼基因。既往研究顯示，hvKP菌株中最常見(jiàn)的莢膜血清型為K1、K2、K5、K20、K54和K57，其中K1和K2最多見(jiàn)，而CR-hvKP菌株的血清莢膜分型目前文獻(xiàn)報(bào)道的有K1、K2、K20、KL64和KL47，中國(guó)的CR-hvKP菌株的莢膜血清分型以KL64型為主[19-20]。本研究中CR-hvKP菌株中14株(82.4%)為KL64，3株為KL47(17.6%)，與以往研究結(jié)果一致[21]。無(wú)論是ST11型還是新ST型的CR-hvKP中都包含上述所有類(lèi)別的毒力基因，毒力基因總體分布無(wú)差異。但不同菌株毒力基因的數(shù)目有所不同，說(shuō)明CR-hvKP在毒力方面仍呈進(jìn)化趨勢(shì)。與ST11型相比，新ST型rmpA基因的攜帶率明顯較高，可能與新ST型形成時(shí)的點(diǎn)突變相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，hvKP菌株常攜帶pLVPK質(zhì)?；騪LVPK-like質(zhì)粒，并可通過(guò)檢測(cè)iucA、rmpA、rmpA2和iroN基因初步判定是否攜帶兩種質(zhì)粒[22]。本研究結(jié)果還顯示有12株菌均檢測(cè)出4種相關(guān)毒力基因，推測(cè)本院的CR-hvKP菌株可能為產(chǎn)KPC-2酶的ST11型CRKP菌株獲得相關(guān)毒力質(zhì)粒進(jìn)化而來(lái)，與國(guó)內(nèi)報(bào)道一致[23]。毒力質(zhì)粒相關(guān)研究及新ST型形成和進(jìn)化機(jī)制將在未來(lái)試驗(yàn)中進(jìn)一步闡述。

綜上所述，本院CR-hvKP菌株全部是由CC258克隆系組成，主要為ST11型和新ST型流行株，ST11型仍是目前本院和國(guó)內(nèi)臨床最常見(jiàn)的類(lèi)型。CR-hvKP菌基因組存在多種碳青霉烯類(lèi)耐藥基因及大量其他類(lèi)型耐藥基因，攜帶多種毒力基因和兩種莢膜血清型(KL64和KL47)，不同MLST分型菌株的部分耐藥基因與毒力基因分布有差異。本研究為單中心回顧性觀察研究，樣本量較少，僅對(duì)研究菌株進(jìn)行基因序列分析，未結(jié)合臨床特點(diǎn)和治療用藥等。因此，在未來(lái)研究中急需選取有代表性的CR-hvKP菌株進(jìn)行全基因組篩查，結(jié)合患者臨床資料進(jìn)行綜合分析，進(jìn)一步揭示新ST型形成及CR-hvKP進(jìn)化的具體機(jī)制，幫助臨床精準(zhǔn)診斷，并為治療患者提供針對(duì)性的方案。