孤立性肺結(jié)節(jié)患者血清和呼出氣冷凝液中微小RNA-21、微小RNA-486檢測(cè)的臨床意義研究

吳丹丹 陳金亮 姚蘇梅 何海艷 朱杰 呂學(xué)東

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率和死亡率均居全球惡性腫瘤首位[1]。70%的肺癌患者被確診時(shí)已進(jìn)展至晚期[2]，因此早期診斷和治療對(duì)于提高肺癌患者的生存率至關(guān)重要。隨著胸部CT的廣泛應(yīng)用，越來越多的孤立性肺結(jié)節(jié)(SPN)被發(fā)現(xiàn)，SPN作為Ⅰa期肺癌存在的可能，其術(shù)前的良惡性評(píng)估尤為重要。惡性SPN的及時(shí)手術(shù)切除對(duì)早期肺癌的預(yù)后具有至關(guān)重要的影響。但對(duì)于形態(tài)及血流動(dòng)力學(xué)特征并不典型的SPN，高分辨率CT在其良惡性鑒別診斷上亦存在困難[3]。而傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)記物如癌胚抗原(CEA)等對(duì)肺癌的早期診斷價(jià)值有限[4]，因此積極尋找新的腫瘤標(biāo)記物是目前臨床研究的熱點(diǎn)之一。微小RNA(miRNA，miR)是一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中[5]，它可以通過mRNA剪切和抑制蛋白翻譯的方式對(duì)靶基因進(jìn)行調(diào)控，參與發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程[6]。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤患者組織及體液中廣泛存在，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7]。miR-21位于染色體17p23.2的腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域的脆性位點(diǎn)，具有致癌基因的作用，可通過抑制凋亡基因的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。有研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中miR-21的表達(dá)高出正常水平5倍以上，miR-21的過表達(dá)還預(yù)示著肺癌患者預(yù)后不良[9]。miR-486在多種實(shí)體惡性腫瘤中均呈異常表達(dá)狀態(tài)，與肺癌亦高度相關(guān)[10]。傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物通常通過患者血清、痰液、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液(BALF)等標(biāo)本來檢測(cè)。呼出氣冷凝液(EBC)包含下呼吸道黏膜分泌的液體和揮發(fā)性的混合物，可反映氣道早期病變。近年來對(duì)于血液和腫瘤組織中miRNA的研究報(bào)道較多，而EBC中miRNA的相關(guān)研究尚少。本研究通過檢測(cè)SPN患者血清及EBC中miR-486、miR-21水平，對(duì)比傳統(tǒng)呼吸系統(tǒng)腫瘤相關(guān)指標(biāo)(CEA、細(xì)胞角蛋白19片段抗原 Cyfra21-1)，探討血清及EBC中miR-21、miR-486在SPN患者良惡性的鑒別、病情評(píng)估等方面的臨床意義。

對(duì)象與方法

1.對(duì)象：納入2017年6月～2019年7月于我科和我院胸外科待行活組織檢查或手術(shù)切除明確病理診斷的SPN患者79例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)典型的SPN；(2)既往無腫瘤病史；(3)術(shù)前影像學(xué)檢查無胸腔積液和縱隔淋巴結(jié)腫大(>1 cm)；(4)術(shù)前檢查未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。將術(shù)后被證實(shí)為肺癌的患者作為惡性組(54例)，良性病變患者作為良性組(25例)。同期隨機(jī)納入體檢的健康者60例作為對(duì)照組。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

2.方法

(1)EBC標(biāo)本收集：健康受試者及SPN患者術(shù)前使用Eric Jaeger Company生產(chǎn)的 EcoScreen冷凝器采集EBC標(biāo)本。在EBC收集前半小時(shí)內(nèi)，不做用力肺活量、時(shí)間肺活量、最大通氣量等檢查。檢查前受檢者先漱口清潔口腔，戴鼻夾通過單向活瓣平靜呼吸，20分鐘后取出收集管，待標(biāo)本融化后可收集到2～4 ml的EBC，然后立即置于-70 ℃低溫冰箱內(nèi)保存。

(2)血清標(biāo)本收集：SPN患者術(shù)前抽取空腹血3 ml置于促凝管中，3 500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘后收集血清，置于-70 ℃冰箱保存待檢，對(duì)照組受試者血清收集方法相同。

(3)miRNA的檢測(cè)：本研究采用Stem-loop法進(jìn)行檢測(cè)。Stem-loop技術(shù)主要包括2個(gè)步驟：①設(shè)計(jì)一個(gè)可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物(RT primer)，該引物3’端有6個(gè)堿基與成熟miRNA的3’端互補(bǔ)配對(duì)，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA；②miRNA cDNA與TaqMan探針雜交，并利用設(shè)計(jì)好的正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，當(dāng)引物PCR延伸到TaqMan探針與eDNA結(jié)合位置時(shí)，TaqMan探針被置換，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離，隨即觸發(fā)熒光，PCR反應(yīng)體系中TaqMan探針置換的越多，熒光信號(hào)越強(qiáng)。熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與目標(biāo)模板量之間存在一定的線性關(guān)系，通過熒光信號(hào)的收集與監(jiān)測(cè)，即可確定miRNA的表達(dá)量。

(4)CEA、Cyfra21-1水平的檢測(cè)：采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)CEA水平；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法檢測(cè)Cyfra21-1水平，試劑盒購自上海船夫生物科技有限公司，有關(guān)操作嚴(yán)格遵循說明書。

結(jié) 果

1.病理類型：入選的79例SPN患者中病理檢查明確為肺惡性腫瘤者54例(68.35%)，包括腺癌38例，鱗癌12例，小細(xì)胞癌4例；明確為良性病變者25例(31.65%)，包括結(jié)核8例，炎性假瘤11例，血管瘤2例，曲菌球2例，肺囊腫1例，錯(cuò)構(gòu)瘤1例。

2.良性組和惡性組患者結(jié)節(jié)直徑比較：良性組患者結(jié)節(jié)直徑[(11.36±7.80)mm]明顯小于惡性組[(18.72±7.28)mm]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.053,P<0.001)。良性組結(jié)節(jié)直徑≤0.8 cm患者比例高于惡性組，結(jié)節(jié)直徑為1.5～3.0 cm患者比例低于惡性組(P<0.05)，而兩組結(jié)節(jié)直徑為0.8～1.5 cm患者比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 良性組和惡性組不同結(jié)節(jié)直徑患者比例比較[例，(%)]

3.良性組和惡性組患者臨床資料比較：良性組和惡性組患者性別、年齡構(gòu)成比比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。惡性組有吸煙史和腫瘤家族史患者比例均高于良性組(P<0.05)。見表2。

4.不同直徑組SPN患者血清和EBC中miR-21、miR-486水平比較：不同直徑組SPN患者血清和EBC中miR-21、miR-486水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0.8～1.5 cm組和1.5～3.0 cm組患者血清及EBC中miR-21水平均高于≤0.8 cm組，血清及EBC中miR-486水平均低于≤0.8 cm組(P<0.05)，而0.8～1.5 cm組和1.5～3.0 cm組患者血清及EBC中miR-21、miR-486水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 良性組和惡性組患者臨床資料比較[例，(%)]

5.對(duì)照組、良性組及惡性組受試者血清和EBC中miR-21、miR-486、CEA及Cyfra21-1水平比較：對(duì)照組、良性組及惡性組受試者血清和EBC中miR-21及miR-486比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而3組受試者血清和EBC中CEA及Cyfra21-1水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。惡性組受試者EBC和血清中miR-21水平均高于良性組及健康組，EBC和血清中miR-486水平均低于良性組及健康組(P<0.05)，其余指標(biāo)兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

6.不同組別SPN患者血清和EBC中miR-21及miR-486水平比較：不同年齡、性別SPN患者及不同病理類型惡性SPN患者血清和EBC中miR-21及miR-486水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，吸煙組SPN患者血清及EBC中miR-21水平均高于不吸煙組，血清及EBC中miR-486水平均低于不吸煙組(P<0.05)。見表5。

表3 不同直徑組SPN患者血清和EBC中miR-21、miR-486水平比較

表4 對(duì)照組、良性組及惡性組受試者血清和EBC中miR-21、miR-486、CEA及Cyfra21-1水平比較

表5 不同組別SPN患者血清和EBC中miR-21及miR-486水平比較

7.SPN患者血清與EBC中miR-21、miR-486的相關(guān)性分析：Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，SPN患者血清與EBC中miR-21水平呈直線正相關(guān)(r=0.59，P=0.002)；血清與EBC中miR-486水平呈直線正相關(guān)(r=0.68，P=0.030)。

8.血清和EBC中miR-21及miR-486評(píng)估SPN良惡性的診斷價(jià)值：ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清中miR-21診斷惡性SPN的ROC曲線下面積(AUC)為0.774，診斷惡性SPN的敏感性為72.2%，特異性為76.0%。EBC中miR-21診斷惡性SPN的AUC為0.775，診斷惡性SPN的敏感性為83.3%，特異性為64.0%。EBC和血清中miR-21聯(lián)合檢測(cè)診斷惡性SPN的AUC為0.816，聯(lián)合檢測(cè)診斷惡性SPN的敏感性為81.5%，特異性為76.0%。血清中miR-486診斷惡性SPN的AUC為0.729，診斷惡性SPN的敏感性為76.0%，特異性為66.7%。EBC中miR-486診斷惡性SPN的AUC為0.881，診斷惡性SPN的敏感性為80.0%，特異性為85.2%。EBC和血清中miR-486聯(lián)合檢測(cè)診斷惡性SPN的AUC為0.910，聯(lián)合檢測(cè)診斷惡性SPN的敏感性為84.0%，特異性為92.6%。

討 論

近年來，肺癌的發(fā)病率和死亡率顯著增加，已成為全世界關(guān)注的重要問題，早期發(fā)現(xiàn)肺癌是成功治療和預(yù)防藥物治療失敗的關(guān)鍵因素之一[11]。隨著高分辨率CT等檢查的普及，臨床上發(fā)現(xiàn)SPN的比例明顯增加，有報(bào)道指出正常人群普查發(fā)現(xiàn)孤立性肺結(jié)節(jié)的比例達(dá)0.2%[3]。目前SPN的治療方法主要包括動(dòng)態(tài)觀察、活組織檢查及手術(shù)切除，部分研究者認(rèn)為對(duì)于SPN可以盡可能采取動(dòng)態(tài)觀察[12]。本研究結(jié)果顯示，SPN中惡性的比例為68.35%，以腺癌為主,與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[13-14]。如此高的惡性比例提醒我們，針對(duì)典型的SPN處理需更為積極，必要時(shí)及時(shí)進(jìn)行手術(shù)治療。

本研究根據(jù)結(jié)節(jié)直徑的不同將SPN患者分為直徑≤0.8 cm組(11例)、0.8～1.5 cm組(28例)和1.5～3.0 cm組40例。良性組結(jié)節(jié)直徑≤0.8 cm患者比例高于惡性組，結(jié)節(jié)直徑為1.5～3.0 cm患者比例低于惡性組。此外本研究結(jié)果顯示，良性組和惡性組患者性別、年齡構(gòu)成比比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而惡性組有吸煙史和腫瘤家族史患者比例高于良性組，表明肺癌的發(fā)生不僅與環(huán)境和吸煙史有關(guān)，也與遺傳基因的傾向性和家族聚集性有關(guān)。因此在鑒別患者SPN良惡性時(shí)，患者的吸煙史及腫瘤家族史也是需要納入考慮的重要因素。

CEA是胚胎發(fā)育過程中產(chǎn)生的多糖蛋白復(fù)合物抗原，是一種廣譜的腫瘤標(biāo)志物[15]，其在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者中的表達(dá)增加，血清CEA水平也是評(píng)判NSCLC患者預(yù)后的獨(dú)立因素[8]。CYFRA21-1是一種上皮腫瘤標(biāo)志物，與包括肺癌在內(nèi)的多種常見的上皮惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16]。本研究中對(duì)照組、良性組及惡性組受試者血清和EBC中CEA及Cyfra21-1水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物對(duì)于SPN良惡性的鑒別價(jià)值有限，積極尋找新的腫瘤標(biāo)記物迫在眉睫。

MiRNA廣泛存在于真核生物中，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大約50%的miRNA在基因組上位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)上而發(fā)揮類似抑癌基因或癌基因的作用[17]。既往研究表明miR-21具有致癌基因的作用，在肺癌細(xì)胞系H3255和H441中敲除miR-21可以增強(qiáng)細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，NSCLC患者腫瘤組織及血清中miR-21表達(dá)增加[8]。本研究亦發(fā)現(xiàn)惡性組患者血清及EBC中miR-21水平高于良性組及對(duì)照組，而良性組與對(duì)照組患者血清及EBC中miR-21水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-486定位于人類染色體的8p11.21區(qū)，既往研究對(duì)miR-486在肺癌的不同研究中積累的數(shù)據(jù)存在爭(zhēng)議，有研究發(fā)現(xiàn)miR-486可能通過靶向抑制癌基因ARHGAP5從而發(fā)揮抑癌因子的作用[18]。Solomides等[19]及Peng等[20]發(fā)現(xiàn)miR-486在肺癌組織中的表達(dá)水平降低。Zhu等[21]亦發(fā)現(xiàn) miR-486在NSCLC組織中呈低表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)惡性組受試者血清及EBC中miR-486水平低于良性組及對(duì)照組，而良性組與對(duì)照組受試者血清及EBC中miR-486水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Li等[10]的研究結(jié)果卻顯示miR-486在NSCLC患者血漿中的表達(dá)水平升高。由于本研究樣本量較小，因此miR-486在肺癌患者中的表達(dá)及作用機(jī)制還需更多的研究來證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示，不同年齡、性別及病理類型組SPN患者血清和EBC中miR-21及miR-486水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，吸煙組患者血清及EBC中miR-21水平均高于不吸煙組，血清及EBC中miR-486水平均低于不吸煙組，且0.8 cm～1.5 cm組和1.5 cm～3.0 cm組患者血清及EBC中miR-21水平均升高，miR-486水平均降低，可能是因?yàn)榧{入的人群中吸煙SPN患者惡性比例明顯增高，而當(dāng)直徑大于0.8 cm時(shí)，SPN的惡性比例亦明顯增高。本研究證實(shí)惡性組患者血清及EBC中miR-21水平明顯升高，miR-486水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述結(jié)果相一致。

對(duì)比痰液、血液等傳統(tǒng)檢測(cè)手段，EBC具有無創(chuàng)、簡(jiǎn)便易行及可重復(fù)性高等特點(diǎn)。目前EBC中已檢測(cè)到100多種反映呼吸系統(tǒng)疾病的生物標(biāo)志物，其中miRNA由于結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易被降解且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)等優(yōu)點(diǎn)，已成為近年來腫瘤疾病研究的熱點(diǎn)[7]。本研究中，SPN患者血清與EBC中miR-21水平呈直線正相關(guān)；血清與EBC中miR-486水平呈直線正相關(guān)；血清及EBC中miR-21、miR-486診斷惡性SPN時(shí)AUC均>0.7，其敏感度較高，具有較好的診斷價(jià)值，同時(shí)EBC中miR-21診斷惡性SPN時(shí)AUC為0.775，敏感性為83.3%，特異性為64.0%，敏感性明顯超過血清，EBC中 miR-486診斷惡性SPN時(shí)AUC為0.881，敏感性為80.0%，特異性為85.2%，均超過血清，考慮體液循環(huán)中miRNA可能是由組織細(xì)胞釋放而來[22]，因此，EBC中miR-21、miR-486的檢測(cè)有潛力作為一種無創(chuàng)方法用于SPN患者的臨床診斷。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-21與NSCLC的鉑類耐藥[23]和表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)的獲得性耐藥[24]有關(guān),miR-486水平的變化則與肺癌患者復(fù)發(fā)密切相關(guān)[10]，由于本試驗(yàn)納入受試者數(shù)量尚少，且未能對(duì)肺癌患者進(jìn)行追蹤隨訪，未能明確肺癌患者EBC及血清中miR-21、miR-486的表達(dá)與EGFR突變患者療效、預(yù)后及術(shù)后復(fù)發(fā)等之間的關(guān)系，需要進(jìn)一步探討。

綜上，EBC和血清中miR-21及miR-486檢測(cè)對(duì)SPN患者良惡性評(píng)估具有較高的臨床價(jià)值，有助于肺癌的早期診斷和發(fā)病機(jī)制的研究。采用EBC這種高效、簡(jiǎn)便、快速、無創(chuàng)的手段檢測(cè)miRNA，可以作為判斷SPN良惡性、篩查腫瘤高危人群的一種新途徑。