新疆動(dòng)物源糞腸球菌的耐藥性分析與耐藥基因檢測(cè)

陳萬(wàn)昭 陳月月 易海波 秦 蕾 徐琦琦 吳慧敏 夏利寧*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆霍城縣職業(yè)技術(shù)學(xué)校，新疆 霍城 835200；3.新疆昭蘇縣喀夏加爾鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，新疆 昭蘇 835618)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)為革蘭氏陽(yáng)性菌，在自然界中廣泛存在，是人和部分動(dòng)物腸道中的常在菌群之一，也是條件致病菌[1]。糞腸球菌可能會(huì)引發(fā)包括泌尿系統(tǒng)感染、感染性心內(nèi)膜炎、腦膜炎和菌血癥等多種嚴(yán)重疾病[2]。近年來(lái)，隨著腸球菌對(duì)抗菌藥物耐藥性的增加，導(dǎo)致腸球菌感染治療失敗的病例屢見(jiàn)不鮮[3]，糞腸球菌在人類(lèi)臨床腸球菌感染分離株中占有重要比例[2]，亦成為全球范圍流行的第三大院內(nèi)感染病原菌[4]。糞腸球菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，具有顯著的基因組可塑性，利用質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和插入序列高效獲取和轉(zhuǎn)移可移動(dòng)抗性元件[3]，所以它可作為腸道中其他致病菌耐藥基因的“蓄水池”，促進(jìn)耐藥性的傳播[5]。

耐藥糞腸球菌的傳播不僅危害人類(lèi)健康，還影響?zhàn)B殖場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益，一旦爆發(fā)會(huì)降低動(dòng)物的生產(chǎn)性能，大幅增加養(yǎng)殖場(chǎng)的用藥成本。目前關(guān)于我國(guó)動(dòng)物源腸球菌耐藥性的報(bào)道大多針對(duì)一種或兩種動(dòng)物，多種動(dòng)物源報(bào)道較少，新疆動(dòng)物源腸球菌耐藥性的報(bào)道僅局限于新疆北部地區(qū)與阿克蘇地區(qū)的豬源糞腸球菌[6-7]、西北部地區(qū)(伊犁和塔城等地)的動(dòng)物原奶、手工乳酪中分離出的屎腸球菌[8]，從藥敏結(jié)果看耐藥情況較為嚴(yán)重，而糞腸球菌在新疆多種動(dòng)物腸道中的分布情況及耐藥基因攜帶情況尚不明確。因此，本研究以新疆9個(gè)縣區(qū)分離的雞源、豬源、牛源、羊源、鴿源和駱駝源糞腸球菌為研究對(duì)象，進(jìn)行耐藥性調(diào)查以及相關(guān)耐藥基因檢測(cè)，為了解新疆多種動(dòng)物源糞腸球菌的耐藥現(xiàn)狀及耐藥基因攜帶情況，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為解析糞腸球菌的多重耐藥機(jī)制提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

2015年在石河子地區(qū)采集羊源肛拭子樣品110份。2016年在烏魯木齊市米東區(qū)采集雞源肛拭子42份。2019年在昌吉地區(qū)采集豬源肛拭子90份，在阿勒泰福海縣采集駱駝源肛拭子49份，在伊犁察布查爾錫伯自治縣采集牛源肛拭子135份，在五家渠采集牛源肛拭子18份，在和田墨玉縣采集鴿源肛拭子100份。2020年在阿勒泰布爾津縣采集駱駝源肛拭子20份。采集4個(gè)年份的樣品共計(jì)564份。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控糞腸球菌(ATCC29212)與金黃色葡萄球(ATCC29213)購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2主要試劑和培養(yǎng)基

腦浸出液(BHI)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；MH肉湯、腸球菌選擇培養(yǎng)基(膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂)購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；尿道菌群定位顯色培養(yǎng)基購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉；1×TE緩沖液購(gòu)自生工生物(上海)有限公司；2×TaqPCR Master Mix，D2 000 DNA Maker購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌分離鑒定

用滅菌棉簽沾取動(dòng)物肛門(mén)內(nèi)新鮮糞便，放入裝有1 mL MH肉湯的EP管中。吸取10 μL MH肉湯中的樣品至1 mL 6.5%氯化鈉BHI肉湯中，過(guò)夜培養(yǎng)后將增菌液劃線接種于腸球菌選擇培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)16～20 h后，挑取白色圓滑、凸起、大小適中且菌落周?chē)@黑色的單一菌落，置于1 mL BHI肉湯，過(guò)夜培養(yǎng)后將增菌液劃線接種于尿道菌群定位顯色培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)16～20 h后挑取大小合適的藍(lán)綠色單菌落于1 mL BHI肉湯，42 ℃培養(yǎng)16～20 h，初步鑒定為腸球菌。通過(guò)PCR方法對(duì)糞腸球菌持家基因進(jìn)行擴(kuò)增[9]，采用煮沸裂解法提取分離株總DNA作為PCR模板，提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控糞腸球菌(ATCC29212)的總DNA作為PCR陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)加核酸染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將目的片段進(jìn)行膠回收并送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，相似性>96.0%的結(jié)果判定該菌株為糞腸球菌。

1.2.2菌株保存

確定為糞腸球菌的菌株接種在BHI肉湯隔夜培養(yǎng)后，加入滅菌甘油，制成20.0%甘油菌，-20 ℃冰箱保存。

1.2.3藥物敏感性試驗(yàn)

根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的動(dòng)物源細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)瓊脂稀釋法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)操作[10]，對(duì)分離的糞腸球菌進(jìn)行11種抗菌藥物(恩諾沙星、阿米卡星、慶大霉素、利福平、氟苯尼考、多西環(huán)素、四環(huán)素、紅霉素、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺和氨芐西林)的最小抑菌濃度測(cè)定。

1.2.4耐藥基因的檢測(cè)

根據(jù)所選藥物相對(duì)應(yīng)的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。參考文獻(xiàn)[11-19]已有序列合成引物(表1)，引物由生工生物(上海)有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，將目的片段進(jìn)行膠回收并送生工生物(上海)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)后確定基因型。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。單因素分析采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌的分離鑒定

由表2可知，共采集4個(gè)年份不同動(dòng)物的樣品共計(jì)564份，經(jīng)糞腸球菌持家基因擴(kuò)增分離鑒定(圖1為部分結(jié)果)得到242株糞腸球菌，分離率為42.9%(242/564)。雞源糞腸球菌的分離率(95.2%，40/42)顯著高于其他動(dòng)物源糞腸球菌(P<0.05)，豬源糞腸球菌分離率為61.1%(55/90)，牛源糞腸球菌(35.9%，55/153)、羊源糞腸球菌(34.5%，38/110)、鴿源糞腸球菌(34.0%，34/100)與駱駝源糞腸球菌(29.0%，20/69)的分離率差異不顯著(P>0.05)。

表2 動(dòng)物源糞腸球菌的分離率Table 2 Isolation rate of E. faecalis from animal

2.2 糞腸球藥敏試驗(yàn)分析

分離的242株糞腸球菌對(duì)紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素和利福平的耐藥率最高，均大于80.0%，對(duì)萬(wàn)古霉素和氨芐西林高度敏感，無(wú)耐藥菌株檢出。此外，檢出10株利奈唑胺耐藥菌。

表3為6種動(dòng)物源糞腸球菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥率。鴿源糞腸球菌、雞源糞腸球菌、牛源糞腸球菌、駱駝源糞腸球?qū)Χ髦Z沙星耐藥率在20.0%～41.2%，顯著高于豬源糞腸球菌(5.5%)與羊源糞腸球菌(0)(P<0.05)；鴿源糞腸球菌、豬源糞腸球菌與牛源糞腸球菌對(duì)阿米卡星的耐藥率均大于80.0%，顯著高于羊源糞腸球菌(7.9%)、雞源糞腸球菌(27.5%)與駱駝源糞腸球菌(25.0%)(P<0.05)；牛源糞腸球菌對(duì)慶大霉素的耐藥率為96.4%，顯著高于其他源糞腸球菌(P<0.05)，其中羊源糞腸球菌的耐藥率為7.9%，顯著低于其他源糞腸球菌(P<0.05)；豬源糞腸球菌、牛源糞腸球菌、雞源糞腸球菌、駱駝源糞腸球菌對(duì)紅霉素的耐藥率均大于90.0%，顯著高于羊源糞腸球菌(42.1%)與鴿源糞腸球菌(52.9%)；四環(huán)素的耐藥嚴(yán)重程度從高到低依次為豬源糞腸球菌(100.0%)、牛源糞腸球菌(96.4%)、雞源糞腸球菌(92.5%)、駱駝源糞腸球菌(80.0%)、鴿源糞腸球菌(67.6%)、羊源糞腸球菌(34.2%)；豬源糞腸球菌、牛源糞腸球菌、雞源糞腸球菌、駱駝源糞腸球菌對(duì)多西環(huán)素的耐藥率均大于80.0%，顯著高于羊源糞腸球菌(47.4%)與鴿源糞腸球菌(55.9%)(P<0.05)；羊源糞腸球菌(0)與雞源糞腸球菌(10.0%)對(duì)氟苯尼考的耐藥率顯著低于其他源糞腸球菌(P<0.05)。利福平的耐藥嚴(yán)重程度從高到低依次為鴿源糞腸球菌(100.0%)、牛源糞腸球菌(92.7%)、豬源糞腸球菌(87.3%)、駱駝源糞腸球菌(85.0%)、雞源糞腸球菌(72.5%)、羊源糞腸球菌(52.6%)。通過(guò)上述分析不同動(dòng)物源糞腸球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥嚴(yán)重程度從高到低依次為牛源、豬源、鴿源、雞源、駱駝源和羊源。

2.3 糞腸球菌多藥耐藥性分析

242株動(dòng)物源糞腸球菌菌株多藥耐藥在0～9耐有分布，3耐及3耐以上占84.7%(205/242)，以5耐和6耐為主，占53.7%(130/242)。豬源與駱駝源糞腸球菌多藥耐藥以5耐為主，分別占58.2%(32/55)和45.0%(9/20)；雞源糞腸球菌以5耐和6耐為主，占70.0%(28/40)；牛源糞腸球菌以6耐為主，占56.4%(31/55)；羊源糞腸球菌多藥耐藥以0～4耐為主，占97.4%(37/38)；鴿源糞腸球菌以2耐和7耐為主，占44.1%(15/34)(表4)。

豬源糞腸球菌共有14種耐藥譜型，在3～9耐有分布，以ERY-TET-DOX-RFP-AMK為主，占比為43.6%(24/55)。羊源糞腸球菌共12種耐藥譜型，在1～5耐有分布，以ERY-TET-DOX-RFP主，占比為18.4%(7/38)。駱駝源糞腸球菌共10種耐藥譜型，在1耐與3～7耐有分布，以TET-GEN-ERY-DOX-RFP為主，占比為40.0%(8/20)。牛源糞腸球菌共15種耐藥譜型，在2耐與4～9耐有分布，以AMK-TET-GEN-DOX-RFP-ERY為主，占比為43.6%(24/55)。雞源糞腸球菌共16種耐藥譜型，在1～8耐有分布，以TET-DOX-GEN-ERY-RFP為主，占比為20.0%(8/40)。鴿源糞腸球菌共16種耐藥譜型，在2～9耐有分布，以AMK-RFP與AMK-TET-RFP-ERY-DOX-GEN-ENR為主，各占14.7%(5/34)。

2.4 糞腸球菌耐藥基因分析

242株動(dòng)物源糞腸球菌除cfr和poxtA基因未檢出外，其他8種耐藥基因均有檢出，tetM基因(78.1%)檢出率最高，aph(3′)-Ⅲ、aac(6′)/aph(2″)和ermB基因的檢出率也高達(dá)70.0%以上。

由表5可知不同動(dòng)物源糞腸球菌中耐藥基因檢出結(jié)果，豬源糞腸球菌耐藥基因攜帶率最高，ermB(100.0%)基因攜帶率顯著高于其他動(dòng)物源糞腸球菌(P<0.05)。豬源糞腸球菌檢出8種耐藥基因，ermA基因(5.5%)僅在豬源糞腸球菌中檢出。豬源、雞源、牛源和駱駝源糞腸球菌tetM基因的攜帶率均大于80.0%，顯著高于鴿源(55.9%)與羊源(26.3%)糞腸球菌(P<0.05)。aac(6′)/aph(2″)基因的攜帶率從高到低依次為牛源(100.0%)、豬源(96.3%)、駱駝源(80.0%)、雞源(75.0%)、鴿源(38.2%)、羊源(28.9%)。羊源、鴿源糞腸球菌對(duì)aph(3′)-Ⅲ基因的攜帶率顯著低于其他源糞腸球菌(P<0.05)。

3 討 論

糞腸球菌作為腸球菌屬中臨床分離率最高的菌種[20]，耐藥機(jī)制復(fù)雜，易產(chǎn)生耐藥性，成為耐藥基因的貯存庫(kù)，獲得性交叉耐藥等問(wèn)題給獸醫(yī)及人醫(yī)臨床帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)[21]。本研究以新疆9個(gè)縣區(qū)分離的6種動(dòng)物源糞腸球菌為研究對(duì)象，分析不同動(dòng)物源糞腸球菌的耐藥特點(diǎn)及耐藥基因攜帶情況，對(duì)于臨床用藥具有指導(dǎo)意義。

本研究中新疆9個(gè)縣區(qū)糞腸球菌的整體分離率為42.9%，略高于魏蓮花等[22]報(bào)道的中國(guó)西部地區(qū)人醫(yī)臨床糞腸球菌與李延山等[23]報(bào)道的東北地區(qū)不同動(dòng)物源糞腸球菌的分離率。不同動(dòng)物源以雞源糞腸球菌分離率最高，達(dá)95.2%，高于李金磊等[24]報(bào)道的河南省部分地區(qū)雞源糞腸球菌分離率(55.6%)。本研究中豬源糞腸分離率為61.1%，與王舒豐等[7]報(bào)道的阿克蘇地區(qū)豬源糞腸球分離率基本一致。牛源、鴿源、駱駝源和羊源糞腸球菌的分離率差別不大，都在30.0%左右。結(jié)果顯示，糞腸球菌作為腸道共生菌在不同動(dòng)物中具有較高分離率，但在不同動(dòng)物體內(nèi)的比例具有一定差異性。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，不同動(dòng)物源糞腸球菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素和紅霉素的高耐藥率與姚曉慧等[25]報(bào)道的糞腸球菌的耐藥結(jié)果基本一致，分析高耐藥率產(chǎn)生的原因，可能是由于四環(huán)素類(lèi)與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的一些抗菌藥物屬于農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的飼料藥物添加劑，從而導(dǎo)致菌株對(duì)其耐藥嚴(yán)重；此外，利福平、慶大霉素和阿米卡星，這3種藥物的耐藥率也偏高，其原因可能是這幾種藥物的性?xún)r(jià)比高，長(zhǎng)期不規(guī)范使用導(dǎo)致耐藥菌株的大量出現(xiàn)。豬源糞腸球菌對(duì)恩諾沙星的耐藥率(5.5%)相較于其他幾種常用藥物耐藥率較低。新疆不同動(dòng)物源糞腸球菌對(duì)氟苯尼考(16.1%)與氨芐西林(0)的耐藥率總體偏低，提示該藥物可作為治療不同動(dòng)物細(xì)菌性疾病的備選藥物。未檢出耐萬(wàn)古霉素腸球菌(Vancomycin-resistantEnterococcus，VRE)。值得注意的是，檢出10株利奈唑胺耐藥菌株，其原因可能是與酰胺醇類(lèi)藥物交叉耐藥所致，例如氟苯尼考。雖然不同動(dòng)物源糞腸球菌對(duì)氟苯尼考耐藥率較低，但也應(yīng)嚴(yán)格控制該藥物的使用，通過(guò)聯(lián)合用藥或輪換用藥減少氟苯尼考耐藥菌株的出現(xiàn)，從而避免利奈唑胺耐藥菌株的爆發(fā)。

不同動(dòng)物源糞腸球菌菌株多藥耐藥集中在5耐和6耐，耐藥譜型以ERY-TET-DOX-RFP-AMK-GEN為主。不同動(dòng)物源糞腸球菌的耐藥譜型差別較大，其原因可能是，菌株來(lái)源于不同地區(qū)不同動(dòng)物，用藥習(xí)慣存在差異。牛源、豬源和駱駝源糞腸球菌耐藥率高，耐藥情況最為嚴(yán)重，其原因可能是因?yàn)檫@3種動(dòng)物飼養(yǎng)周期長(zhǎng)，使用抗菌藥物幾率更高，導(dǎo)致分離菌株耐藥嚴(yán)重。鴿源與雞源糞腸球菌耐藥譜最廣，耐藥率較高，其原因可能是養(yǎng)殖戶(hù)缺乏規(guī)范用藥意識(shí)，不合理使用甚至濫用藥物，導(dǎo)致多耐菌株和高耐菌株的出現(xiàn)。羊源糞腸球菌對(duì)被檢藥物的耐藥率整體偏低，對(duì)多種藥物敏感性良好，其原因可能是養(yǎng)殖場(chǎng)用藥合理，采樣的羊群為一月齡胡羊，多數(shù)未使用抗菌藥物。不同養(yǎng)殖場(chǎng)可根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果與耐藥譜型，在目前的用藥模式上合理選用具有較高敏感性的抗菌藥物，在提高治療效果降低經(jīng)濟(jì)成本的同時(shí)，也可緩解交叉耐藥情況的產(chǎn)生。

本研究耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，新疆動(dòng)物源糞腸球菌耐藥基因攜帶率高，對(duì)被檢測(cè)的5大類(lèi)耐藥基因均有檢出。豬源糞腸球菌對(duì)被檢耐藥基因的攜帶率最高，檢出的種類(lèi)也最多，其次為牛源糞腸球菌，其原因可能是樣品采集的豬場(chǎng)和牛場(chǎng)飼養(yǎng)動(dòng)物密集，攜帶多種耐藥基因的糞腸球菌易通過(guò)糞便、污水等進(jìn)行傳播。羊源耐藥基因攜帶率最低與藥敏試驗(yàn)結(jié)果相符。tetM(78.1%)、ermB(71.5%)基因的攜帶率與Molechan等[26]報(bào)道的南非雞源腸球菌一致，但aac(6′)/aph(2″)(73.6%)、aph(3′)-Ⅲ(74.0%)基因的攜帶率卻顯著高于其報(bào)道，略低于國(guó)內(nèi)吳安琪等[27]的報(bào)道。其原因可能是對(duì)于氨基糖苷類(lèi)藥物國(guó)內(nèi)用藥習(xí)慣與國(guó)外存在差異，相關(guān)部門(mén)應(yīng)加大監(jiān)察力度，規(guī)范該類(lèi)藥物合理使用。氟苯尼考的耐藥率為16.1%，與酰胺醇類(lèi)耐藥基因fexA檢出率(16.9%)基本一致。雖然噁唑烷酮類(lèi)多藥耐藥基因cfr與poxtA基因未檢出，但是optrA基因檢出率高達(dá)9.1%，除羊源未檢出外，其他動(dòng)物源均有檢出。少數(shù)攜帶該基因的菌株對(duì)利奈唑胺沒(méi)有表現(xiàn)出耐藥，但為中介值，結(jié)果印證Osei等[28]報(bào)道的藥敏試驗(yàn)中介的菌株也可能擴(kuò)增出相應(yīng)耐藥基因的結(jié)論。optrA基因不僅介導(dǎo)對(duì)酰胺醇類(lèi)抗菌藥物和利奈唑胺的耐藥，還可介導(dǎo)對(duì)2014年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的新一代噁唑烷酮類(lèi)藥物—泰地唑利的耐藥，該藥被批準(zhǔn)用于臨床治療耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)和耐甲氧西林的凝固酶陰性的葡萄球菌(Methicillin-resistant coagulase negativestaphylococci，MRCoNS)等多重耐藥菌引起的感染[14]。因此，應(yīng)該注意對(duì)該基因的持續(xù)監(jiān)測(cè)，避免交叉耐藥危害人類(lèi)健康。

綜上所述，糞腸球菌在新疆9個(gè)縣區(qū)的6種動(dòng)物糞樣均中具有較高的檢出率，且分離到的糞腸球菌對(duì)四環(huán)素、紅霉素、多西環(huán)素和利福平的耐藥率高，養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)減少這4種藥物的使用，可根據(jù)藥敏結(jié)果選用恩諾沙星、氟苯尼考和氨芐西林等敏感性高的藥物來(lái)提高療效。豬、牛和駱駝，飼養(yǎng)周期長(zhǎng)的動(dòng)物，耐藥嚴(yán)重，耐藥基因攜帶率高，應(yīng)嚴(yán)格控制抗菌藥物的使用，合理輪換用藥。雞、鴿在飼養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)注意用藥的規(guī)范化，避免濫用藥物。在除羊外的5種動(dòng)物中，均檢出噁唑烷酮類(lèi)耐藥基因optrA，提示應(yīng)該注意酰胺醇類(lèi)藥物的使用與相關(guān)耐藥基因的持續(xù)監(jiān)測(cè)，實(shí)驗(yàn)室與臨床結(jié)合，避免交叉耐藥的產(chǎn)生，保護(hù)公共衛(wèi)生安全。