miR-137 靶向調(diào)控Wnt5a 表達對宮頸癌細胞生長的影響

高淼 劉莉 關阿娜 王俊霞

（內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,內(nèi)蒙古 包頭 014030）

宮頸癌是全世界女性中最常見的婦科惡性腫瘤之一，也是導致全世界女性腫瘤相關死亡的常見惡性腫瘤〔1〕。雖然宮頸癌的篩查和早期診斷技術有所提高，但由于感染、性生活過早和人口老齡化等多種因素導致宮頸癌的發(fā)病率仍高居不下，同時宮頸癌的長期預后并未得到改善，因此宮頸癌新的治療手段仍需不斷探索〔2〕。微小RNA（miRNA）是小型非編碼RNA 家族，其表達失調(diào)可改變多個細胞和生物學過程，從而通過影響腫瘤生物學的多個方面來促進人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔3〕。研究報道在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的miRNA 中，miR-137 依據(jù)不同的癌癥類型既表現(xiàn)出致癌作用，又表現(xiàn)出腫瘤抑制作用〔4，5〕，而在宮頸癌中miR-137 通過與GREM1 結合抑制細胞侵襲、遷移和上皮-間質轉化過程〔6〕，miRNA 通過調(diào)控各種靶基因而發(fā)揮不同的作用〔7〕，而本文發(fā)現(xiàn)無翅和整合位點生長因子（Wnt）5a 是miR-137 的靶基因之一，Wnt5a 是調(diào)控腫瘤惡性增殖的經(jīng)典信號通路Wnt/β-catenin 的重要成員之一〔8〕，其高表達促進腫瘤的惡性增殖〔9〕，因此本文研究miR-137 靶向Wnt5a 抑制宮頸癌生長的作用并對其作用機制進行了初步的探討，為miR-137 作為宮頸癌治療的潛在靶點提供了新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料 宮頸癌細胞HeLa、C33A、Caski 和永生化宮頸上皮細胞H8（ATCC，美國）；DMEM-高糖培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基、RPMI1640 培養(yǎng)基、DMEM-F12 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS，Gibco，美國）；反轉錄試劑盒逆轉錄試劑盒（Fermentas，美國）；RNA 提取試劑盒和qPCR 試劑盒（北京天根生化，中國）；miR-137、Wnt5a、內(nèi)參U6 和GAPDH 引物（上海生工，中國）；miR-137 mimic、過表達Wnt5a 質粒、pGLO-Wnt5a-wt（野生型）和pGLO-Wnt5a-mut（突變型，上海吉凱，中國）；雙熒光素酶報道基因試劑盒和蛋白裂解液（上海碧云天，中國）；CCK8 試劑（北京東仁，中國）；EdU 增殖實驗試劑盒（廣州奧博，中國）；Wnt5a 和β-catenin 抗體（Abcam，英國）。

1.2 細胞培養(yǎng) 宮頸癌細胞和永生化宮頸上皮細胞快速復蘇后重懸至含有10%FBS 的基礎培養(yǎng)基中，HeLa 細胞培養(yǎng)基為DMEM-高糖、C33A 細胞培養(yǎng)基為MEM、Caski 細胞培養(yǎng)基為RPMI1640，H8 細胞培養(yǎng)基為DMEM-F12。細胞融合度為90%時，胰酶消化后傳代，取生長狀態(tài)較好的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 方法

1.3.1 qPCR 收集細胞，加入Trizol 裂解液，采用RNA 提取試劑盒和反轉錄試劑盒提取細胞總RNA并逆轉錄為cDNA。以cDNA 為模板，采用7 500 qPCR 儀進行擴增，反應條件為95℃預變性5 s，95℃變性5 s、65℃退火30 s 共40 個循環(huán)。檢測各樣品的循環(huán)閾值（Ct），以U6 為內(nèi)參計算miR-137相對表達量，GAPDH 為內(nèi)參計算Wnt5a mRNA 相對表達量，計算公式為2-ΔΔCt。miR-137 引物序列正義鏈:5＇-TTATTGCTTAAGAATACGCGTAG-3＇，反義鏈:5＇-TGGTGTCGTGGAGTCG-3＇。U6 引物序列正義鏈:5＇-GCTTCGGCACATATACTAAAAT-3＇，反義鏈:5＇-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3＇。Wnt5a 引物序列正義鏈:5＇-ATTCTTGGTGGTCGCTAGGTA-3＇，反義鏈:5＇-CGCCTTCTCCGATGTACTGC-3＇。GAPDH 引物序列正義鏈:5＇-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3＇，反義鏈:5＇-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3＇。

1.3.2 miR-137 靶向調(diào)控Wnt5a 的驗證 TargetScan7.1 軟件（http://www.targetscan.org/）預測miR-137 的靶基因。以3 000 個HeLa 細胞/孔接種到96 孔板中，分為Wnt5a-wt+NC 組、Wnt5a-wt+miR-137 mimic 組、Wnt5a-mut+NC 組和Wnt5a-mut+miR-137 mimic 組，細胞貼壁12 h 時采用脂質體2000 將各組質粒轉至細胞中。收集轉染48 h 的各組細胞，采用雙熒光素酶報道基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.3.3 細胞分組與轉染 選取miR-137 表達最低的宮頸癌細胞，以2×105個接種至6 孔板中，分為NC 組、miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a（過表達Wnt5a 質粒）組。細胞貼壁12 h 時采用脂質體2000 將各組質粒轉至細胞中，6 h 換液。

1.3.4 CCK-8 實驗 選取miR-137 表達最低的宮頸癌細胞，以2 000 個接種至96 孔板中，分為NC組、miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a組，每組設置6 個復孔。按上述方法進行細胞轉染。轉染48 h 時加入10 μl CCK8 試劑，培養(yǎng)箱中孵育1 h。采用全波長掃描儀檢測OD 值（450 nm）。細胞增殖率=實驗孔OD 值/對照孔OD 值×100%。

1.3.5 平板克隆實驗 選取miR-137 表達最低的宮頸癌細胞，以400 個接種至6 孔板中，分為NC組、miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a組，每組設置3 個復孔。按上述方法進行細胞轉染。細胞克隆團肉眼可見時終止培養(yǎng)，去掉培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3 次，甲醇固定，吉姆薩染色后計數(shù)。

1.3.6 EdU 實驗 選取miR-137 表達最低的宮頸癌細胞，以2 000 個接種至24 孔板中，分為NC 組、miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組，每組設置3 個復孔。按上述方法進行細胞轉染。轉染48 h 后，去掉培養(yǎng)基，PBS 洗3 次，甲醛固定，采用EdU 試劑盒染色后計算EdU 陽性細胞率。

1.3.7 Western 印跡檢測蛋白表達 收集轉染48 h的各組細胞，加入蛋白裂解液，裂解后以超高速低溫離心，獲得全蛋白上清液，加入上樣緩沖液煮沸變性后，采用凝膠電泳分離蛋白，轉膜，8%的脫脂牛奶封閉聚偏氟乙烯（PVDF）膜，4℃一抗孵育過夜，室溫二抗孵育1 h，電化學發(fā)光法（ECL）曝光。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0 軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結果

2.1 宮頸癌細胞系中miR-137 和Wnt5a 的表達 miR-137 在宮頸癌細胞中的表達均顯著高于永生化宮頸上皮細胞H8，在HeLa 細胞中表達最高（P＜0.05），選擇其進行后續(xù)實驗。Wnt5a 在宮頸癌細胞中的表達均顯著低于永生化宮頸上皮細胞H8（P＜0.05）。見表1。

表1 miR-137 和Wnt5a 在宮頸癌細胞系中的表達(,n=3)

表1 miR-137 和Wnt5a 在宮頸癌細胞系中的表達(,n=3)

與H8 組比較:1）P＜0.05

2.2 miR-137 對Wnt5a 的靶向調(diào)控作用 TargetScan7.1 軟件在線預測顯示W(wǎng)nt5a 啟動子區(qū)與miR-137 具有結合位點，見圖1。雙熒光素酶實驗顯示:與Wnt5a-wt+NC 共轉染組熒元素酶活性（1.00±0.02）相比，Wnt5a-wt+miR-137 顯著降低（0.42±0.11，t=8.985，P＜0.05）；而Wnt5a-mut+NC 組熒光素酶活性（0.98 ±0.02）與Wnt5a-mut +miR-137（0.96±0.05）比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.653，P=0.549）。與NC 組Wnt5a mRNA 表 達（1.00 ±0.02）相比，miR-137 mimic 組（0.29±0.04）和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組（0.48±0.03）均顯著降低，且miR-137 mimic 組顯著低于miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組（均P＜0.05）。表明miR-137 靶向負調(diào)控Wnt5a。

圖1 Wnt5a 啟動子區(qū)與miR-137 結合位點

2.3 CCK-8 實驗 與NC 組相比，miR-137 mimic組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細胞增殖活性顯著降低（P＜0.05）。而與miR-137 mimic 組相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細胞增殖活性顯著增加（P＜0.05），見表2。表明Wnt5a 減弱miR-137 對細胞增殖活性的抑制作用。

表2 miR-137 靶向Wnt5a 對宮頸癌細胞生長的影響(,n=3)

表2 miR-137 靶向Wnt5a 對宮頸癌細胞生長的影響(,n=3)

與NC 組比較:1）P＜0.05；與miR-137 mimic 組比較:2）P＜0.05

2.4 平板克隆實驗 與NC 組相比，miR-137 mimic組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細胞平板克隆形成能力顯著降低（P＜0.05）。而與miR-137 mimic組相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細胞平板克隆形成顯著增加（P＜0.05），見表2，圖2。表明Wnt5a減弱miR-137 對細胞平板克隆形成能力的抑制作用。

圖2 miR-137 調(diào)控Wnt5a 抑制HeLa 細胞克隆形成能力(吉姆薩染色,×100)

2.5 EdU 實驗 與NC 組相比，miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細胞Edu 陽性細胞率顯著降低（P＜0.05）。而與miR-137 mimic 組相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細胞Edu 陽性細胞率顯著增加（P＜0.05），見表2，圖3。表明Wnt5a 減弱miR-137 對細胞增殖能力的抑制作用。

圖3 免疫熒光染色觀察miR-137 調(diào)控Wnt5a 降低HeLa 細胞EdU 陽性細胞率(×200)

2.6 miR-137 調(diào)控Wnt5a 對wnt/β-catenin 信號通路的影響 與NC 組相比，miR-137 mimic 組和miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細胞中Wnt5a 和β-catenin蛋白表達顯著降低（P＜0.05），而與miR-137 mimic組相比，miR-137 mimic+oe-Wnt5a 組細胞中wnt5a和β-catenin 蛋白表達顯著增加（P＜0.05），見表2，圖4。表明Wnt5a 減弱miR-137 對細胞Wnt/β-catenin 信號通路的抑制作用。

圖4 miR-137 靶向調(diào)控Wnt5a 抑制wnt/β-catenin 信號通路的活化

3 討論

宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多步驟過程，由宮頸炎癥發(fā)展為宮頸上皮內(nèi)瘤變，最終進展為宮頸癌，其中人乳頭瘤病毒是導致初始宮頸癌變的主要因素，除此慢性宮頸炎、多次分娩和吸煙等均是宮頸癌的高危因素，但是宮頸癌發(fā)病的確切機制仍不清楚〔10〕。目前宮頸癌的治療常用手段包括手術、化療和放射療法，但是這些治療策略對于晚期的宮頸癌患者的治療療效有限，但是宮頸癌的早期常見癥狀為不規(guī)則陰道流血，常常被患者忽視，導致大多數(shù)患者確診時已處于腫瘤晚期，因此宮頸癌患者的5 年生存率仍然很低〔2〕。隨著分子生物學技術的研究進展，分子靶向藥物已經(jīng)成為抗腫瘤治療的研究熱點，研究報道表皮生長因子受體（EGFR）特異性單克隆抗體和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抑制劑等分子靶向藥物在宮頸癌治療的臨床試驗中取得了顯著療效，表明分子靶向藥物治療宮頸癌有較好的應用前景〔11〕。

miRNA 是保守非編碼RNA 的重要一大類，長度只有20～22 個核苷酸，miRNA 的異常表達會影響包括細胞增殖、細胞死亡、血管生成、侵襲和遷移等生物學行為〔3〕。miRNA 的失調(diào)是宮頸癌發(fā)病進展的常見驅動力，越來越多異常的miRNA 在宮頸癌中被發(fā)現(xiàn)〔12〕。miR-137 是宮頸癌中新近發(fā)現(xiàn)的miRNA 之一，Miao 等〔6〕報道m(xù)iR-137 在宮頸癌組織和細胞系中表達降低，過表達miR-137 抑制宮頸癌細胞的增殖、克隆形成能力、侵襲和轉移及裸鼠的成瘤能力，其作用機制是通過與GREM1 結合抑制轉化生長因子（TGF）-β/ smad 途徑的激活。miRNA通過與靶基因mRNA 的3＇-UTR 發(fā)生堿基配對，導致mRNA 的穩(wěn)定化并促進mRNA 的降解，每個miRNA 的靶基因存在數(shù)個至數(shù)百個〔7〕，報道m(xù)iR-137在宮頸癌中通過靶向GREM1 發(fā)揮抑癌作用〔6〕，在前列腺癌中通過靶向TRIM24 抑制腫瘤細胞的增殖能力〔13〕。

Wnt5a 在人類腫瘤中為癌基因，屬于分泌性糖蛋白Wnt 家族中的亞型，Wnt5a 在宮頸癌中表達增加，促進宮頸癌的增殖〔14〕，本研究發(fā)現(xiàn)miR-137 在宮頸癌細胞系中表達降低，wnt5a 在宮頸癌細胞系中表達增加，與已有的研究報道一致〔6，14〕。研究顯示W(wǎng)nt5a 既可激活依賴β-catenin 經(jīng)典Wnt 信號途徑，又可激活不依賴β-catenin 非經(jīng)典Wnt 信號途徑的關鍵因子〔8〕，Wnt/β-catenin 信號通路是調(diào)控惡性腫瘤增殖的重要調(diào)控途徑，且宮頸癌中Wnt/β-catenin 處于高度激活狀態(tài)〔15〕，本研究結果表明在宮頸癌中miR-137 靶向Wnt5a 可能通過降低Wnt/βcatenin 信號途徑的活化抑制宮頸癌細胞的生長。

綜上，宮頸癌細胞系中miR-137 表達降低，Wnt5a 表達增加，miR-137 靶向Wnt5a 抑制宮頸癌細胞的生長，可能通過降低Wnt/β-catenin 信號途徑的活化。