不同作物根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)特征分析

唐 杰 陳知青 郭安南 裘瓊芬

(1 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211；2 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211)

根際是土壤和植物相互作用的主要區(qū)域。根際微生物是受植物影響最大的土壤微生物群體，也被稱為植物的第二基因組，對植物的健康至關(guān)重要[1]。植物根系通過向根際釋放各種根系分泌物，吸引細(xì)菌、真菌、藻類和原生動物[2]等各種微生物在根際的定殖，然后經(jīng)營養(yǎng)選擇與富集作用影響微生物群落的結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能。微生物通過不同的胞外酶能快速利用可溶性的根系分泌物，獲取豐富的有效性碳源及其他營養(yǎng)物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)土壤有機(jī)質(zhì)分解[3]和提高土壤肥力[4]促進(jìn)植物生長。此外，根際存在著能防止病原菌定殖的生防細(xì)菌，如熒光假單孢菌(FluorescentPseudomonas)，該菌部分基因型能生產(chǎn)抗生素氰化氫(hydrogen cyanide，HCN)和2，4-二乙?；冱S酚(2，4-diacetylphloroglucinol，Phl)[5]，抑制病原菌的生長，增強農(nóng)作物對生物脅迫的耐受能力[6]。根際微生物在植物養(yǎng)分獲取中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[7]。土壤-根界面附近可溶性宏觀和微量營養(yǎng)素的增加對植物營養(yǎng)吸收有積極的影響。植物根際根瘤菌、促生細(xì)菌等通過增加溶解性磷、微量營養(yǎng)素的溶解度等方式提高營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度[8]，直接或間接地向植物提供可利用的氮、磷和其他營養(yǎng)元素[9]，促進(jìn)植物生長發(fā)育[10]。根際微生物也可能會提高植物從土壤汲取養(yǎng)料的效率來應(yīng)對非生物壓力，影響植物的根系構(gòu)型[11]，進(jìn)而調(diào)控植物的一系列生理與生態(tài)過程。

根際微生物群落組成還受環(huán)境條件[12]、土壤理化性質(zhì)[13]、土壤背景微生物組成[14]和植物發(fā)育階段[15]等多種因素的影響。在對藥用植物根際[16]、草原植物根際[17]和荒漠植物根際[18]的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)，同類型生態(tài)環(huán)境的不同植物根際土中微生物群落組成、數(shù)量和多樣性均存在顯著差異，植物的不同種類或同種類的基因型對根際微生物群落也有顯著影響[1]。然而，植物的種類特征對根際微生物群落影響的潛在機(jī)制尚不清楚，識別植物種類變化對土壤微生物群的影響，將有助于了解和控制土壤微生物群落變化，構(gòu)建有益于植物的健康根際環(huán)境。

基于此，本研究通過Illumina MiSeq測序技術(shù)和磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)分析在同一農(nóng)田種植的不同作物根際微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，探究不同作物的根際土壤敏感微生物，旨在為全面了解植物根系對微生物群落選擇和活動的調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)，為提高作物產(chǎn)量提供新的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

本試驗所選農(nóng)田位于浙江省寧波市鎮(zhèn)海區(qū)(121°63′E，29°90′N)，該農(nóng)田土壤類型為黃棕壤，年均氣溫16.4℃，年均降水量1 488 mm。土壤基礎(chǔ)肥力為：有機(jī)質(zhì)38.82 g·kg-1、全氮1.68 g·kg-1、全磷1.12 g·kg-1、速效磷6.27 mg·kg-1、速效鉀271.36 mg·kg-1。試驗品種：大豆[Glycinemax(L.)Merr.]為浙農(nóng)8號(浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司)，玉米(Zeamays)為浙甜11號(浙江科誠種業(yè)股份有限公司)，四季豆(PhaseolusvulgarisL.)為龍豐2號(杭州科豐種子有限公司)，豇豆[Vignaunguiculata(L.)Walp]為華贛高產(chǎn)80(江西華農(nóng)種業(yè)有限公司)，芋艿[Colocasiaesculenta(L.)Schoot]為奉化大芋艿(浙江寧波奉化芋艿基地)，番薯[Ipomoeabatatas(L.)Lam.]和花生(ArachishypogaeaL.)為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民主栽品種，由上一年種植留種。

1.2 試驗設(shè)計

將大豆、玉米、花生、四季豆、豇豆、番薯和芋艿共7種作物種植在農(nóng)田的不同區(qū)域，每塊區(qū)域面積16 m2，并設(shè)置4個采樣點作為平行。作物根際土樣品采集于2017年7月，大豆、花生、四季豆和豇豆已處于成熟期，玉米處于花粒期，番薯處于盛葉期，芋艿處于結(jié)芋期。將作物從土壤中拔出，抖掉大塊土壤后，用藥勺刮取作物根表土壤作為根際土。2 h內(nèi)將樣品帶回實驗室，每個樣品分成3份，分別用于土壤基因組DNA的提取、PLFA的提取和理化性質(zhì)的測定。DNA提取、PLFA提取土壤樣品冷凍保存于-80℃冰箱，理化性質(zhì)測定的土壤樣品保存于-20℃冰箱。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤理化分析 土壤pH值用AZ8601 pH計(臺灣衡欣)和溶解法測定，每個土壤樣品取5 g，溶解于25 mL蒸餾水中，然后用校準(zhǔn)后的pH計測定土壤浸出液的pH值。土壤氨態(tài)氮含量采用2 mol·L-1KCl浸提-靛酚藍(lán)比色法測定，硝態(tài)氮含量采用酚二磺酸比色法測定[19]。

1.3.2 磷脂脂肪酸(PLFA)測定 根際土壤樣品PLFA的提取[20]：稱取4 g鮮土放入試管，加入3.2 mL檸檬酸緩沖液、8 mL甲醇和4 mL氯仿進(jìn)行2次抽提，然后過SPE柱洗掉中性酯和糖酯，用8 mL甲醇洗脫磷脂。加入十九烷基甲酯作為內(nèi)標(biāo)甲基化后氮氣吹干，加正己烷溶解轉(zhuǎn)移至GC瓶中，定容至60 μL后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)進(jìn)行測定。

依據(jù)生物表征對測定的PLFA進(jìn)行分類[21-23]：脂肪酸18：0 10-methyl表征厭氧細(xì)菌(Anaerobic bacteria)；脂肪酸18：2ω6c和18：1ω9c表征真菌(Fungi)；脂肪酸14：0 iso、15：0 iso、15：0 anteiso、16：0 iso、17：0 iso和17：0 anteiso用來表征革蘭氏陽性菌(gram-positive bacteria,G+)；脂肪酸16：1ω7c和16：1ω5c表征Ⅰ型甲烷氧化菌(type Ⅰ methanotroph,Meth Ⅰ)；脂肪酸18：1ω7c表征Ⅱ型甲烷氧化菌(type Ⅱ methanotroph,Meth Ⅱ)；脂肪酸16：0 10-methyl表征放線菌(Actinomycetes)；脂肪酸16：1ω9c、cy17：0ω7c、cy19：0ω7c、18：1ω7c 10-methyl和17：1ω8c用來表征除甲烷氧化菌外的革蘭氏陰性菌(gram-negative bacteria,G-)；脂肪酸14：0、15：0、16：0、17：0和18：0用來表征其他通用的細(xì)菌(other bacteria)；脂肪酸20：4ω6c、20：5ω3c和22：6ω3c表征原生動物。

1.3.3 DNA的提取 用FastDNA SPIN Kit for Soil 試劑盒(MP Biomedicals，美國)提取根際土壤的總DNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo,美國)測定DNA的濃度和純度。DNA樣品保存于-80℃冰箱。

1.3.4 細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增及Illumina Miseq測序 采用帶標(biāo)簽的細(xì)菌通用引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-G G A C T A C N N G G G T A T C T A AT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)。測定凝膠回收純化(TaKaRa Biotech，日本)后的PCR產(chǎn)物濃度，等量混合不同樣品的PCR產(chǎn)物，用MiSeq雙末端測序平臺(Illumina，美國)進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測序數(shù)據(jù)用FLASH軟件完成二端序列的拼接[24]，用Qiime程序進(jìn)行后續(xù)的分析，剔除嵌合體和質(zhì)控。步驟主要為剪接掉3個以上質(zhì)控分小于20 bp且連續(xù)的堿基，長度大于300 bp的長序列保留，利用usearch算法剔除嵌合體，用UCLUST將高于97%相似性的序列聚類為分類操作單元(operational taxonomic units，OTUs)[25]。以每個OTU里豐度最高的序列作為代表序列，與Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得OTUs的分類信息。刪除古菌、葉綠體、未知序列和在所有樣品中只檢測到一次的序列。隨機(jī)選取每個樣品37 500條序列進(jìn)行后續(xù)分析。使用軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)；使用R包vegan進(jìn)行群落Alpha多樣性分析；采用基于Bray-Curtis距離的非度量多維尺度分析和群落相似性分析比較不同作物根際土壤細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)的差異以及顯著性檢測。利用PLFA數(shù)據(jù)分析根際土壤真菌與細(xì)菌比值以比較不同作物土壤環(huán)境變化。使用指示值法篩選根際土壤敏感細(xì)菌，利用R軟件中的labdsv軟件包篩選指示不同作物根際土壤中的敏感生物綱，選取相關(guān)性高于0.90且具有顯著差異性(P<0.05)的數(shù)據(jù)。采用Origin 2018制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

不同作物根際土壤理化性質(zhì)見表1。試驗農(nóng)田土壤為酸性土壤，不同作物根際土壤pH值變化較大。統(tǒng)計分析表明，不同作物根際土壤的pH值、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的理化性質(zhì)存在差異，番薯根際土壤的pH值最高，而玉米、四季豆和花生根際土壤的pH值顯著低于大豆、番薯和芋艿。芋艿根際土中的銨態(tài)氮含量為32.83 mg·kg-1，顯著高于其他作物。幾種作物的根際土壤中硝態(tài)氮含量在1.41～1.59 mg·kg-1之間，花生和四季豆根際土中的硝態(tài)氮含量顯著高于大豆、豇豆、番薯、芋艿。

表1 不同作物根際土壤理化參數(shù)的差異Table 1 Difference in physical and chemical parameters of different crop rhizosphere soils

2.2 根際土壤PLFA組成

由表2可知，篩選除去豐度低于1%且只存在于個別樣品中的PLFAs后，剩下的25種PLFAs在不同作物根際土中均有一定含量。不同作物根際土中含有PLFAs的總量存在差異，花生根際土中總PLFAs含量最高，達(dá)到30.24 ng·g-1，約為四季豆根際土中總PLFAs含量的2倍，顯著高于其他作物。大豆、玉米、豇豆、番薯和芋艿根際土中的總PLFAs含量則無顯著差異。對不同PLFAs歸類[20]后發(fā)現(xiàn)，花生根際土中表征放線菌、Ⅰ型甲烷氧化菌、Ⅱ型甲烷氧化菌和革蘭氏陰性菌的PLFAs含量均顯著高于其他作物。不同作物根際土中表征革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的PLFAs含量較高；其次是表征真菌的PLFAs；而表征原生動物和厭氧細(xì)菌的PLFAs含量較低。

表2 不同作物根際土中PLFAs含量及各類微生物的組成 Table 2 Total phospholipid fatty acids (PLFAs)and microbial compositions of rhizosphere soils across different crops /(ng·g-1)

將表征革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、Ⅰ型甲烷氧化細(xì)菌、Ⅱ型甲烷氧化細(xì)菌、放線菌、厭氧細(xì)菌和其他通用細(xì)菌的PLFAs含量相加作為細(xì)菌生物量(B)，以表征真菌的PLFAs(18：2ω6c和18：1ω9c)作為真菌生物量(F)，計算不同作物根際土中真菌細(xì)菌比(ratio of fungi and bacterial，F(xiàn)/B)和革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比(ratio of gram positive bacteria and gram negative bacteria，G+/G-)，結(jié)果如圖1所示。根際土中的F/B值在不同作物間存在差異，其中豇豆根際的F/B值顯著高于其他作物，芋艿根際的F/B值顯著低于除大豆外其他作物，大豆、玉米、花生、四季豆和番薯根際微生物的F/B值無顯著差異。根際土中的G+/G-值在不同作物間存在差異，其中芋艿根際土中的G+/G-值顯著高于玉米、番薯和豇豆，豇豆根際土中的G+/G-值顯著低于大豆。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note:Different lowercase letters in the same column mean significant difference at 0.05 level.The same as following.圖1 不同作物根際土中真菌細(xì)菌比和革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比Fig.1 The ratios of fungi to bacteria and G+ to G-PLFAs under rhizosphere soils of different crops

2.3 根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與組成

采集的28個樣品在97%相似性水平上共獲得32 994 個OTUs(均一化每個樣品37 500條序列)。將每個OTU中的代表性序列與SILVA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以確定植物根際細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和組成。由圖2-A可知，根際微生物群落以變形菌門(Proteobacteria)為主，7種作物平均相對豐度為46.46%。此外含有放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和疣微菌門(Verrucomicrobia)，合計約占總細(xì)菌量的51%。在門水平下，不同作物之間根際土的細(xì)菌群落多樣性和組成無顯著差異。在綱水平(圖2-B)和目水平(圖2-C)對優(yōu)勢細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析顯示，在綱水平下，變形菌門下的α-變形菌綱是大豆、玉米和花生中的最優(yōu)勢菌，在目水平下放線菌門的放線菌目是大豆、玉米和花生中的最優(yōu)勢菌。α-變形菌綱主要包括根瘤菌目(Rhizobiales)、紅螺菌目(Rhodospirillales)、鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)、柄桿菌目(Caulobacterales)和Ellin329，其中根瘤菌目(Rhizobiales)是相對豐度最高的優(yōu)勢菌，在番薯根際土細(xì)菌中占10.65%，在四季豆根際土中占9.32%。β-變形菌綱(Betaproteobacteria)主要是伯克氏菌目(Burkholderiales)和SC-Ⅰ-84。γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)中絕大多數(shù)菌屬于黃單胞菌目(Xanthomonadales)。δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)則主要為粘球菌目(Myxococcales)。除此以外，放線菌門中以放線菌目(Actinomycetales)、蓋勒氏菌目(Gaiellales)和酸微菌目(Acidimicrobiales)為主，其中放線菌目是僅次于根瘤菌目第二主要菌，雖然在番薯根際細(xì)菌中的相對豐度不高(6.61%)，但在大豆根際土細(xì)菌中的相對豐度高達(dá)9.61%。酸桿菌門中含有酸桿菌目(Acidobacteriales)、索利氏菌目(Solibacterales)、Ellin6513和iii1-15。厚壁菌門中以芽孢桿菌目(Bacillales)和梭菌目(Clostridiales)為主。

注：A、B和C分別代表門水平、綱水平和目水平。Note:Phyla(A),class(B)and order (C).圖2 不同作物根際土壤主要細(xì)菌類群的組成和相對豐度Fig.2 The composition and relative abundance of major bacterial taxa in rhizosphere soils

2.4 根際細(xì)菌群落的多樣性和物種豐富度

對Alpha多樣性的分析揭示了不同作物之間群落多樣性的差異，所有樣本的Alpha多樣性如表3所示。ANOVA方差分析顯示代表細(xì)菌群落豐富度的Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)和代表細(xì)菌群落多樣性的Shannon指數(shù)在不同作物根際土中存在差異，7種作物中大豆的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均最高，芋艿最低，大豆的Coverage指數(shù)在7種作物中最低，芋艿最高。其中Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)豐富度估計量度量了樣本中的菌群豐度，Shannon指數(shù)度量了樣本中菌群的多樣性，Coverage指數(shù)反映樣本微生物測序結(jié)果的真實情況，其數(shù)值越高表示樣本中序列被測出的概率越高。芋艿根際土中細(xì)菌群落的Coverage指數(shù)雖然顯著高于其他作物，但Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均為最低，表明其細(xì)菌群落豐度最低；花生、豇豆和芋艿根際細(xì)菌群落中Shannon指數(shù)顯著低于其他作物，表明三者的根際細(xì)菌多樣性較低。大豆根際細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在7種作物中最高，表明其根際菌群的豐富度和多樣性最高。

表3 樣本Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 3 Statistics of microbial Alpha diversity index in the soil samples.

2.5 根際微生物群落的差異性和相似性

基于樣本間Bray-curtis距離，在OTUs和PLFAs水平下采用非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling analysis，NMDS)對不同作物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示，不同作物微生物群落分布在非度量多維尺度上形成顯著聚類。在OTUs和PLFAs水平下群落相似性檢驗分析(analysis of similarities，ANOSIM)均顯示不同作物根際細(xì)菌群落組成存在顯著差異(P<0.001)，表明不同物種的樣本在分類差異的基礎(chǔ)上顯著地聚集到不同的類群中。

圖3 基于細(xì)菌OTUs豐度(A)和PLFAs(B)的非度量多維尺度分析(NMDS)不同作物根際微生物群落分布Fig.3 Non-metric multidimensional scaling analysis(NMDS)of microorganism community composition based on the relative abundance of bacterial OTUs (A)and PLFAs (B)data

將根際土的理化性質(zhì)、PLFAs組成、微生物的相對豐度和多樣性進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，如圖4所示。結(jié)果表明，土壤pH值與γ-變形菌綱、嗜酸桿菌綱(Acidobacteriia)、索利氏菌綱(Solibacteres)及DA052的相對豐度呈負(fù)相關(guān)，與氯酸桿菌綱(Chloracidobacteria)和酸性細(xì)菌-6綱(Acidobacteria-6)的相對豐度呈正相關(guān)。硝態(tài)氮含量與α-變形菌綱相對豐度呈負(fù)相關(guān)，與γ-變形菌綱、嗜酸桿菌綱、索利氏菌綱及DA052相對豐度呈正相關(guān)。銨態(tài)氮含量也與索利氏菌綱相對豐度呈負(fù)相關(guān)，同時與ACE指數(shù)也呈負(fù)相關(guān)，與嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)相對豐度則呈正相關(guān)。

圖4 土壤理化因子與微生物指標(biāo)之間的相關(guān)性分析Fig.4 Correlationships between microbial index and soil physicochemical variables

2.6 根際土壤敏感微生物差異

通過指示值法篩選不同作物根際土壤的敏感細(xì)菌，分析土壤微生物對不同作物根系活動的響應(yīng)情況。為了提高結(jié)果的可靠性，選取指示值大于0.90的種群，共篩選出4個敏感目，8個敏感科，如圖5所示。這些指示物種主要屬于變形菌門(克斯體科、根瘤菌科、黃單胞菌科和腸桿菌種)、芽單胞菌門(N1423WL目)、酸桿菌門(Ellin 6513)、擬桿菌門(噬纖維菌科)、放線菌門(諾卡氏菌科)、綠彎菌門(嗜熱菌科和JG30-KF-AS9目)和疣微菌門(疣微菌科)。利用熱圖顯示指示物種在樣本中的分布特征，各樣本能夠按照作物種類聚類，說明不同作物根際土壤敏感微生物存在明顯的差異。其中指示大豆的物種最多，包括4個細(xì)菌科和1個細(xì)菌目，分別為疣微菌科(Verrucomicrobiales)、嗜纖維菌科(Cytophagaceae)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)、諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)和根瘤菌目；指示玉米的細(xì)菌科1個，即腸桿菌科(Enterobacteriaceae)；指示花生的細(xì)菌目和細(xì)菌科各1個，分別為JG30-KF-AS9和嗜熱菌科(Thermogemmatisporaceae)；指示四季豆的細(xì)菌科1個，即克斯體科(Coxiellaceae)；指示豇豆的細(xì)菌目1個，即Ellin6513；指示番薯的細(xì)菌科1個，即根瘤菌科(Rhizobiaceae)；指示芋艿的細(xì)菌目1個，即N1423WL。

3 討論

作物通過根際從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，同時又將部分代謝產(chǎn)物分泌到土壤中。微生物在根際環(huán)境中起著物質(zhì)傳遞和轉(zhuǎn)化的重要作用。本研究分析了在夏季生長旺盛或成熟的4種豆科作物(花生、大豆、豇豆和四季豆)、1種禾本科作物(玉米)、1種旋花科作物(番薯)及1種天南星科作物(芋艿)的根際微生物群落結(jié)構(gòu)和組成，發(fā)現(xiàn)不同植物物種在同一土壤上生長時，具有特定的微生物群落。變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和厚壁菌門是不同作物根際的優(yōu)勢細(xì)菌門，這與以往在大豆[26]、花生[27]、玉米[28]和四季豆[29]根際土壤等的研究結(jié)果相類似。變形菌門的相對豐度占根際細(xì)菌的40%以上(圖2-A)，這可能與其生長速度較快有關(guān)，營養(yǎng)豐富的環(huán)境適合變形菌門或該門中某類菌群的生長[30]。變形菌在土壤的碳、硫、氮循環(huán)中起著關(guān)鍵作用[31]，不同變形菌綱與土壤氮含量或pH值呈現(xiàn)一定的相關(guān)性(圖4)。α-變形菌綱中的根瘤菌目對植物的生長非常有益，在不同作物根際均有較高豐度(圖2-C)，同時也是大豆根際土中的指示物種(圖5)。根瘤菌目產(chǎn)生的鐵載運體剝奪了病原體從環(huán)境中獲取鐵的能力，從而影響了病原體的存在，最終會提高植物的生長和生產(chǎn)力，同時根瘤菌目還是一種能將不溶性無機(jī)磷轉(zhuǎn)化成可溶性有機(jī)磷的有益菌[32]。除根瘤菌外，放線菌目、伯克氏菌目和芽孢桿菌目是農(nóng)田土壤中的典型有益微生物種群，含有大量植物促生功能菌、病原拮抗菌等，可提高植物獲取營養(yǎng)物質(zhì)的效率，促進(jìn)植物生長，同時抑制土傳病原微生物侵染[33]。放線菌能提高土壤抑病能力，是大豆、玉米和花生土壤中目水平下的最優(yōu)勢菌(圖2-C)，這在前人的研究中也有發(fā)現(xiàn)[34-36]。伯克氏菌能促進(jìn)植物生長[37]，是本研究7種不同作物的根際土中的優(yōu)勢目(圖2-C)。芽孢桿菌目作為厚壁菌門中的優(yōu)勢菌，對外界有害條件的抵抗力強，能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)防止多種作物病害[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌目在不同作物根際的相對豐度存在顯著差異(P<0.05)，其中在花生根際土中最高，達(dá)4.8%。黃文茂等[39]發(fā)現(xiàn)用芽孢桿菌對花生幼苗進(jìn)行灌根處理，可促進(jìn)花生幼苗莖部的伸長及鮮重的增加，根際土壤堿解氮含量、有效磷和速效鉀含量均有不同程度增加。與益生菌相反，黃單胞菌則是常見的植物病原菌，常見于水稻白葉枯病[40]、黃瓜細(xì)菌性斑點病[41]等。本研究中黃單胞菌目在不同作物根際土中相對豐度差異顯著(P<0.05)，番薯根際顯著低于其他作物，僅為3.7%，而在豇豆根際則高達(dá)10.7%。有研究發(fā)現(xiàn)，豇豆對黃單胞桿菌致病菌株的抗性比較差，容易發(fā)生細(xì)菌性斑點病[42]。本研究中，酸桿菌門在不同作物根際土中的相對豐度均在10%以上，花生根際土中最高，達(dá)16%(圖2-A)，這與土壤的pH值呈酸性有關(guān)(表1，圖4)。酸桿菌在土壤細(xì)菌群落中普遍存在，但豐度在不同土壤中變化較大，pH值對土壤中酸桿菌豐度有較強的調(diào)節(jié)作用，在廣泛的土壤和生態(tài)系統(tǒng)類型中，土壤pH值是預(yù)測土壤酸桿菌群落組成變化的良好指標(biāo)[43]；此外，土壤微生物組成結(jié)構(gòu)受多種環(huán)境因子的共同制約[44]，酸桿菌的豐度還與土壤氮含量有關(guān)，銨態(tài)氮含量對酸桿菌的分布有負(fù)向影響[45]，在一定范圍內(nèi)土壤中酸桿菌的豐度會隨銨態(tài)氮含量的增加而降低。在本研究中，芋艿根際有較高的pH值，且銨態(tài)氮含量(32.83 mg·kg-1)遠(yuǎn)高于其他作物，酸桿菌門在芋艿根際土中的相對豐度最低(10.7%)。

本研究中，不同作物對土壤微生物群落的細(xì)菌多樣性(P<0.001)和豐富度(P<0.001)均有顯著影響，花生根際每克土中的PLFAs總量顯著高于其他作物，但是花生土壤的Shannon指數(shù)較低，說明花生根際土中的微生物數(shù)量最多，但多樣性較低?；贠UTs和PLFAs結(jié)果的非度量多維尺度分析均表明不同作物根際微生物結(jié)構(gòu)存在明顯聚類傾向(圖3)?？芍H微生物群落的形成是植物和環(huán)境因素共同選擇的結(jié)果[34]，表明作物種類對根際微生物群落的組成具有重要影響。

注：SO、MA、PE、KB、CP、SP和CO分別代表大豆、玉米、花生、四季豆、豇豆、番薯和芋艿樣本組。Note:Abbreviation in figure as:SO as Soybean,MA as Maize,PE as Peanut,KB as Kidney bean,CP as Cowpea,SP as Sweet potato,CO as Cocoyam.圖5 不同作物根際土壤的12種指示物種相對豐度熱圖Fig.5 Heat map of the relative abundances of the 12 screened indicator taxa for rhizosphere soil samples collected from different crops.

對作物根際土壤敏感微生物的分析進(jìn)一步顯示了不同作物根際微生物之間的差異。本研究中門水平下不同作物根際土的細(xì)菌群落多樣性和組成無顯著差異(圖2-A)，但進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)不同作物中均有不同的敏感微生物(圖5)，且敏感微生物物種在目水平和科水平已達(dá)到很高的指示值。這是由于作物對微生物群落存在選擇作用，如玉米幼苗通過選擇有限的菌屬來建立棲息于根的細(xì)菌群落[46]，而有些微生物對某些植物基因型有特殊的親和力[47-48]，但這些微生物對根際微生物的組成影響較小。此外，本研究發(fā)現(xiàn)敏感微生物的分類和作物的分類也無關(guān)，如變形菌門中的腸桿菌科、克斯體科、根瘤菌科和根瘤菌目分別為玉米、四季豆、芋艿和大豆的根際敏感微生物。Grayston等[49]研究了同屬于禾本科的小麥、黑麥草和匍匐翦股穎在2種不同類型土壤中生長時的根際微生物群落,發(fā)現(xiàn)2種不同類型土壤的微生物群落差異不明顯，但來自不同植物物種的微生物群落顯著聚類。由于不同植物在化合物分泌方面存在差異，釋放的根系分泌物不同導(dǎo)致其具有不同的根際微生物組成[50]，這種差異也存在于同一科的植物根際。

一般認(rèn)為，微生物對有機(jī)碳和有機(jī)氮的利用和轉(zhuǎn)化主要包括真菌和細(xì)菌的優(yōu)勢途徑[51]，真菌生物量(F)、細(xì)菌生物量(B)以及F/B值可以作為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的指標(biāo)。本研究中7種作物的F/B值均低于0.2，表明其根際土中的細(xì)菌含量遠(yuǎn)大于真菌含量。與真菌相比，細(xì)菌更喜歡有營養(yǎng)的環(huán)境[52]。可見本研究農(nóng)田土壤營養(yǎng)較為豐富，屬于高效性的“細(xì)菌型”土壤。本研究中，豇豆根際菌群的F/B值顯著高于其他作物，G+/G-值則明顯低于其他作物。F/B值的增加在一定程度上表明土壤碳吸收能力和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性的改善[53]，G+/G-值高表明土壤中細(xì)菌群落碳的有效性低，革蘭氏陽性菌傾向于利用土壤有機(jī)質(zhì)作為碳源，而革蘭氏陰性菌傾向于將植物凋落物作為碳源[54]。因此，相比于豇豆，其他作物凋落物分解更快，碳的有效性逐漸降低，由于養(yǎng)分的限制，土壤有機(jī)質(zhì)作為碳源的比例增加，革蘭氏陽性菌的比例也隨之升高。芋艿根際土中菌群的F/B值顯著低于其他作物(除與大豆無顯著差異)，但其總PLFAs含量與豇豆無顯著差異。這可能與芋艿根際土中銨態(tài)氮含量顯著高于其他作物有關(guān)，土壤中有豐富的無機(jī)氮源，使細(xì)菌生物量相對增加[55]。此外，根際微生物的分布與植物生長時期相關(guān)[56]，有研究表明，植物會在不同生長階段通過調(diào)整其根系分泌物滲出模式，幫助適應(yīng)特定微生物生長，從而改變微生物群落組成[57]；在甜椒根際土壤中，假單胞菌、芽孢桿菌和伯克霍爾德菌在開花期和結(jié)果期比幼年期增加了數(shù)倍[58]。大豆生長發(fā)育過程中根際土壤變形菌門增加，但酸桿菌門和厚壁菌門呈減少趨勢[59]。因此，本研究中不同作物根際微生物存在差異還與作物所處的生育期有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，同一農(nóng)田種植不同作物會形成顯著不同的根際微生物區(qū)系，表現(xiàn)在微生物含量、真菌細(xì)菌比(F/B)、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌比(G+/G-)、以及細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性等多個方面?；ㄉH土中表征放線菌、革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的PLFAs含量均顯著高于其他作物。芋艿根際土中的G+/G-值在7種作物中最高，且顯著高于玉米、番薯和豇豆。不同作物根際微生物組成在綱水平和目水平存在差異，在門水平差異不顯著，均以變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和厚壁菌門為主。Alpha多樣性和非度量多維尺度分析(NMDS)分析說明不同作物之間群落多樣性及組成存在差異，7種作物中大豆根際菌群的豐富度和多樣性最高。每種作物在科或者目水平均有特有的敏感指示微生物，進(jìn)一步表明根際微生物群落與作物種類存在密切關(guān)系，為根際微生物生態(tài)功能的研究提供了理論基礎(chǔ)。但關(guān)于根際微生物群落和活性隨作物生長的變化規(guī)律以及其在各生長期的主要生態(tài)功能等仍需要進(jìn)一步研究。