m6A修飾調(diào)控的COL6A5對(duì)肺腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

王馨，黃嘉星，潘輝林，馮正富，湯銳明，邱惠思

據(jù)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新診斷肺癌220.02萬(wàn)例，因肺癌死亡的患者有180萬(wàn)例［1］。根據(jù)組織類型可將肺癌分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌病例的85%，其組織學(xué)亞型主要包括肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞癌［2］。據(jù)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)，肺癌死亡患者中約40%為肺腺癌［3］。目前，肺腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確。6型膠原蛋白α5（COL6A5）含有336個(gè)氨基酸組成的三重螺旋結(jié)構(gòu)，側(cè)翼則包括7個(gè)N末端von Willebrand因子A樣結(jié)構(gòu)域和3個(gè)C末端von Willebrand因子A樣結(jié)構(gòu)域［4］。有研究報(bào)道，COL6A5的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)rs13062453、rs1497305和rs77123808與肺癌風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)［5］，但目前關(guān)于COL6A5在肺腺癌中作用的研究尚少見。本研究擬從數(shù)據(jù)庫(kù)、組織標(biāo)本和細(xì)胞層面分析COL6A5在肺腺癌中的表達(dá)模式，探討其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B和肺腺癌細(xì)胞（A549、H1975、H1650、PC9和H1299）均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所。胎牛血清和1640培養(yǎng)基均購(gòu)自Gibco公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PowerUp?SYBR?Green預(yù)混液和COL6A5抗體均購(gòu)自Fermentas公司。RNA extraction kit購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物有限公司。鋅指轉(zhuǎn)錄因子（ZEB1）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白（Snail）、Twist相關(guān)蛋白1（Twist1）、AlkB家族同源蛋白5（ALKBH5）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology。Magna RIP?RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit購(gòu)自Millipore公司。ALKBH5 shRNA質(zhì)粒和COL6A5過表達(dá)質(zhì)粒均購(gòu)自廣州復(fù)能生物有限公司。CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher有限公司，熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀及濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，倒置相差顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Leica公司。

1.2標(biāo)本收集 收集2013年3月—2018年12月于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院胸外科就診的肺腺癌患者27例，其中男16例，女11例，年齡27～91歲，平均（47.90±3.02）歲。所有患者均經(jīng)病理學(xué)確診為肺腺癌，收集患者肺癌組織及配對(duì)的癌旁正常組織，于-196℃液氮中保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.3轉(zhuǎn)染 將H1299細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待其融合度為80%時(shí)，將該細(xì)胞以4×104個(gè)/孔接種至6孔板，置于37℃5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜，次日進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。組分1配制：3μg質(zhì)粒（COL6A5過表達(dá)質(zhì)粒、靶向ALKBH5的各個(gè)shRNAs以及各對(duì)照質(zhì)粒）和5μL p3000與500μL無(wú)血清培養(yǎng)基混合均勻；組分2配制：5μL Lipofectamine 3000加入500μL無(wú)血清培養(yǎng)基混合均勻。將組分1和組分2混合，室溫靜置30 min，將上述混合液加入6孔板中，48 h后用于后續(xù)研究。在轉(zhuǎn)染時(shí)，將過表達(dá)COL6A5分為con組（轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒con）和過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染COL6A5）。敲低ALKBH5分為4組：con組（轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒con）、sh-1#組（轉(zhuǎn)染靶向ALKBH5的shRNA片段1質(zhì)粒）、sh-2#組（轉(zhuǎn)染靶向ALKBH5的shRNA片段2質(zhì)粒）和sh-3#組（轉(zhuǎn)染靶向ALKBH5的shRNA片段3質(zhì)粒）。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)mRNA表達(dá) 按照RNA提取和cDNA合成試劑盒的說明書操作，分別提取目標(biāo)細(xì)胞（H1299、H1975、A549、BEAS-2B、H1650和PC9）和目標(biāo)組織（肺腺癌組織及配對(duì)癌旁組織）RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。SYBR法用于檢測(cè)mRNA表達(dá)，各基因引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系：SYBR Mix 10μL，上、下游引物各0.5μL，模板1μL，雙蒸水8μL。反應(yīng)條件：25℃2 min，95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，60℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Tab.1 Primer lists in this study表1 qPCR引物序列

1.5Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)量 將目標(biāo)細(xì)胞H1299、H1975、A549、BEAS-2B、H1650和PC9以7×104個(gè)/孔接種于6孔板，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞1次，每孔加入60μL含有cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰浴10 min。將細(xì)胞收集至離心管中，14 000×g高速離心10 min，取上清液即為細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品上樣量20μg，蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳（100 V恒壓）分離后，200 mA恒流1.5 h轉(zhuǎn)至PVDF膜上。PVDF膜經(jīng)5%BSA室溫封閉2 h，加入一抗（COL6A5抗體1∶800；E-cadherin抗體1∶1 000；ZEB1抗體1∶1 000；Snail1抗體1∶600；Twist1抗體1∶1 000；ALKBH5抗體1∶500；β-actin抗體1∶5 000）孵育過夜。TBST洗滌3次，每次5 min。分別加入羊抗兔二抗或者羊抗鼠二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min。ECL底物發(fā)光試劑盒增強(qiáng)發(fā)光，X線膠片顯影。蛋白條帶用Image J進(jìn)行灰度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 將1×105個(gè)細(xì)胞用1%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，加入Transwell上室，下室中加入600μL完全培養(yǎng)基；培養(yǎng)24 h后，將小室置于甲醇中固定20 min，棄去小室里面的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦掉小室里面的細(xì)胞及基質(zhì)膠，將小室置于1%結(jié)晶紫中染色10 min，流動(dòng)水沖掉結(jié)晶紫，風(fēng)干；在顯微鏡下隨機(jī)讀取5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)侵襲過小室的細(xì)胞。侵襲能力抑制率=（對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)）/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7RNA甲基化免疫沉淀-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（MeRIPqPCR）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本上是否存在m6A位點(diǎn) 按照Magna RIP?RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit說明書進(jìn)行MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)。將1×106個(gè)H1299細(xì)胞接種至直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用700μL RIP裂解液冰上裂解細(xì)胞10 min，14 000×g離心10 min，取上清液作為細(xì)胞裂解物，用wash buffer重懸磁珠，分為IgG組（加入Normal Rabbit IgG抗體）和m6A組（加入anti-m6A抗體），室溫孵育1 h。將上述磁珠/抗體混合物與細(xì)胞裂解液4℃孵育過夜，wash buffer洗滌3次，蛋白酶K處理上述磁珠沉淀，純化RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照1.4中的方法檢測(cè)COL6A5mRNA的表達(dá)。

1.8生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

1.8.1Oncomine Oncomine（https：//www.oncomine.org/resource/login.html）查詢條件為：“Gene：COL6A5”，“Analysis Type：Cancervs.Normal”，“Cancer Type：Lung Cancer”，“Data Type：mRNA”。探究COL6A5在肺癌中的表達(dá)情況。

1.8.2GEPIA GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）查詢條件為：選 擇“Boxplots”，“gene：COL6A5”，“Datasets Selection：LUAD，點(diǎn)擊add”，點(diǎn)擊“Plot”，即可查詢COL6A5與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1.8.3cBioPortal for Cancer Genomics cBioPortal for Cancer Genomics數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.cbioportal.org/）用于查詢與COL6A5表達(dá)相關(guān)的基因。打開數(shù)據(jù)庫(kù)，“Select Studies for visualization&Analysis：Lung，LUNG ADENOCARCINOMA”，選擇“l(fā)ung adenocarcinoma（TCGA，PanCancer Altas）”，點(diǎn)擊“Query by Gene：mRNA expression；Entre Genes：COL6A5”，點(diǎn)擊“submit Query”，點(diǎn)擊“Co-expression”，即可查看與COL6A5表達(dá)相關(guān)的基因。

1.8.4SRAMP 進(jìn)入SRAMP網(wǎng)站（http：//www.cuilab.cn/sramp），點(diǎn)擊“Prediction”，輸入COL6A5 mRNA序列，點(diǎn)擊“submit”，即可查詢COL6A5轉(zhuǎn)錄本上潛在的m6A位點(diǎn)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COL6A5在肺腺癌中的表達(dá)模式 在線數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，COL6A5在肺癌組織中顯著低表達(dá)，見圖1。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，肺腺癌組織中COL6A5mRNA表達(dá)水平（n=483，0.77±0.09）顯著低于正常組織（n=347，2.61±0.22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.710，P＜0.05）。本研究qPCR結(jié)果亦顯示，肺腺癌組織中COL6A5mRNA表達(dá)水平低于癌旁正常組織（0.97±0.01vs.1.66±0.04，n=27，t=2.220，P＜0.05）。COL6A5mRNA在正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B及肺腺癌細(xì)胞A549、H1299、H1975、H1650和PC9中的表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.14±0.01、0.11±0.00、0.11±0.01、0.13±0.02和0.28±0.06，COL6A5mRNA在A549、H1299、H1975、H1650和PC9中的表達(dá)量顯著低于BEAS-2B（n=3，F(xiàn)=192.197，P＜0.01）。

Fig.1 The online databank Oncomine used to measure COL6A5 expression pattern in several kinds of cancers圖1 在線數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine分析COL6A5在多種腫瘤中的表達(dá)模式分布圖

Fig.2 The correlation between COL6A5 and prognosis of LUAD patients analyzed by TCGA databank圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析COL6A5與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.2 COL6A5在肺腺癌中的表達(dá) TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，237例肺腺癌患者隨訪0.92～604.00個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為55.83個(gè)月。以COL6A5中位表達(dá)量為界，將肺腺癌患者分為高表達(dá)組119例（≥333.578）和低表達(dá)組118例（＜333.578），高表達(dá)組肺腺癌患者累積總生存率高于低表達(dá)組（Log-rankP=0.013），見圖2。

2.3 ALKBH5下調(diào)COL6A5的表達(dá) 在線軟件SRAMP預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，COL6A5轉(zhuǎn)錄本上存在多個(gè)m6A位點(diǎn)（圖3A）。本研究MeRIP-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，m6A組H1299細(xì)胞COL6A5mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于IgG組（39.03±8.63vs.1.00±0.00，t=7.625，P＜0.01）。qPCR結(jié)果顯示，肺腺癌組織中ALKBH5mRNA表達(dá)水平高于癌旁正常組織（3.99±1.33vs.1.66±0.29，t=3.459，P＜0.01）；肺腺癌組織中ALKBH5mRNA與COL6A5mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.599，P＜0.01）。在H1299細(xì)胞中敲低ALKBH5，qPCR結(jié)果顯示，con組、sh-1#組、sh-2#組和sh-3#組ALKBH5mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.00、0.93±0.06、0.22±0.01和0.82±0.07，sh-2#組ALKBH5mRNA表達(dá)水平最低（F=152.400，P＜0.01）；Western blot結(jié)果顯示，con組、sh-1#組、sh-2#組和sh-3#組ALKBH5蛋白條帶灰度值分別為0.334±0.030、0.862±0.005、0.092±0.003和0.434±0.017，sh-2#組對(duì)ALKBH5的沉默率達(dá)72.46%（圖3B）。在H1299細(xì)胞中敲低ALKBH5，qPCR結(jié)果顯示，sh-2#組COL6A5mRNA表達(dá)水平明顯高于con組（10.43±2.06vs.1.00±0.00，t=7.940，P＜0.01）；Western blot結(jié)果顯示，sh-2#組COL6A5蛋白表達(dá)水平高于con組（3.592±0.197vs.0.169±0.001，t=30.100，P＜0.01），見圖3C。

2.4 COL6A5抑制肺腺癌細(xì)胞增殖 通過cBioPortal在線數(shù)據(jù)庫(kù)下載與COL6A5共表達(dá)的基因，KEGG分析發(fā)現(xiàn)COL6A5可能參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、止 血（hemostasis）和細(xì)胞表面相互作用（cell surface interaction）等生命活動(dòng)，見圖4A。在H1299細(xì)胞中過表達(dá)COL6A5，Transwell結(jié)果顯示，COL6A5過表達(dá)組發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的細(xì)胞數(shù)目少于con組（275±24vs.581±37，t=9.629，P＜0.01），見圖4B。COL6A5過表達(dá)組E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，ZEB1、Snail1和Twist1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，見圖4C、表2。

Fig.3 The effect of ALKBH5 on COL6A5 analyzed by bioinformatics combined with experiments圖3 生物信息學(xué)分析結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ALKBH5對(duì)COL6A5的調(diào)控作用

3 討論

挖掘數(shù)據(jù)庫(kù)信息對(duì)探索肺腺癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的研究具有重要作用［6-8］。有研究通過GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)確定了分泌型磷酸化蛋白1（SPP1）在肺腺癌中高表達(dá)，且其表達(dá)量與肺腺癌患者預(yù)后差呈正相關(guān)（P=0.017）［9］。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)8個(gè)B7家族配體和CD28家族受體（B7-CD28家族基因）與肺腺癌患者預(yù)后有關(guān)［10］。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中分析到聚合酶ε（POLE）突變能夠提高肺腺癌患者的總體生存率［11］。但是，與程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）低表達(dá)的POLE突變患者相比，PD-L1高表達(dá)的POLE突變肺腺癌患者總體生存率較高［11］。有研究者從在線數(shù)據(jù)庫(kù)The Human Protein Altas中提取了基因數(shù)據(jù)集，通過一系列生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有絲分裂紡錘體相關(guān)標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)蛋白成員15（KIF15）、有絲分裂檢查點(diǎn)絲氨酸/蘇氨酸激酶（BUB1）、細(xì)胞周期蛋白B2（CCNB2）、細(xì)胞周期依賴性激酶1（CDK1）、驅(qū)動(dòng)蛋白成員4A（KIF4A）、Discs大同源物關(guān)聯(lián)蛋白5（DLGAP5）、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2癌基因（ECT2）和苯胺素（ANLN）可以作為預(yù)測(cè)肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)［12］。研究人員從在線數(shù)據(jù)庫(kù)Oncomine以及后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，序列相似性為83%的家族成員A（FAM83A）在肺腺癌中顯著高表達(dá)，且FAM83A高表達(dá)與肺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及患者預(yù)后有關(guān)［13］。本研究通過Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，COL6A5基因在肺腺癌中低表達(dá)；經(jīng)qPCR驗(yàn)證，COL6A5在肺腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)量均遠(yuǎn)低于癌旁正常組織及正常肺上皮細(xì)胞。

Fig.4 Focusing the effect of COL6A5 on the invasion ability of LUAD cells圖4 COL6A5對(duì)肺腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Tab.2 Comparison of the expression of EMT biomarkers between the two groups表2 COL6A5過表達(dá)組與對(duì)照組EMT標(biāo)志物的表達(dá)比較 （±s）

Tab.2 Comparison of the expression of EMT biomarkers between the two groups表2 COL6A5過表達(dá)組與對(duì)照組EMT標(biāo)志物的表達(dá)比較 （±s）

＊P＜0.05

組別對(duì)照組COL6A5過表達(dá)組t n 3 3 E-cadherin mRNA 1.00±0.00 7.39±1.63 7.423＊蛋白0.132±0.001 1.923±0.218 19.310＊ZEB1 mRNA 1.00±0.00 0.18±0.09 16.820＊蛋白1.097±0.014 0.634±0.005 53.080＊Snail1 mRNA 1.00±0.00 0.20±0.12 12.710＊蛋白0.314±0.008 0.016±0.002 6.190＊Twist1 mRNA 1.00±0.00 0.39±0.03 39.950＊蛋白1.532±0.182 0.849±0.127 49.890＊

目前，關(guān)于COL6A5在腫瘤中的研究較少，且主要集中在突變功能上。有研究報(bào)道，在遺傳性大腸癌中COL6A5可發(fā)生突變，但是否與大腸癌發(fā)生有關(guān)及其如何在大腸癌中發(fā)揮功能尚未明確［14］。有研究者統(tǒng)計(jì)TCGA數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，COL6A5在食管鱗狀細(xì)胞癌中低表達(dá)，且COL6A5低表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)［15］；也有學(xué)者統(tǒng)計(jì)了GSE84846數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)COL6A5與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后有關(guān)［16］；但是上述2個(gè)研究?jī)H從不同數(shù)據(jù)庫(kù)分析信息，未行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到COL6A5可能參與調(diào)控肺腺癌細(xì)胞的EMT表型、止血和細(xì)胞表面相互作用等生命活動(dòng)，并通過Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)COL6A5能夠抑制H1299細(xì)胞發(fā)生侵襲；qPCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)COL6A5可明顯抑制EMT標(biāo)志物，增加上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，提示COL6A5通過調(diào)控H1299細(xì)胞的EMT表型來(lái)抑制其侵襲能力。

近年來(lái)，廣泛存在于真核細(xì)胞的RNA甲基化（m6A修飾）調(diào)控備受關(guān)注。m6A修飾能夠影響mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，最終參與細(xì)胞分化、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)等生命活動(dòng)。在這種修飾系統(tǒng)中，m6A編碼器由核心催化成分甲基 轉(zhuǎn) 移 酶 樣3（METTL3）/甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶 樣14（METTL14）組成，以插入m6A修飾［17］。ALKBH5和脂肪與肥胖相關(guān)蛋白（FTO）被稱為m6A銷碼器，可去除基因轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾［18］。m6A位點(diǎn)由m6A讀碼器（含YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和IGF2BPs）執(zhí)行［19］。本研究通過生物信息學(xué)及實(shí)驗(yàn)證實(shí)，COL6A5轉(zhuǎn)錄本上存在m6A修飾位點(diǎn)，且ALKBH5調(diào)控COL6A5表達(dá)，但是該系統(tǒng)中的讀碼器尚未明確，這將是本課題組下一步研究的內(nèi)容。另外，COL6A5如何調(diào)控細(xì)胞EMT相關(guān)標(biāo)志物，進(jìn)而影響細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，尚有待進(jìn)一步研究。在后續(xù)研究中，本課題組將通過免疫共沉淀聯(lián)合蛋白質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)尋找COL6A5的作用靶標(biāo)，以揭示其抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制。