3-O-C12-HSL通過抑制lncRNA CD48-AS和CD48的表達(dá)而阻礙Mo-DCs成熟

羅燕芬，莊奇真，張軒，陳茶，劉楊，顏星星，肖倩，李有強(qiáng)

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是臨床上難治性肺部感染常見的致病菌［1］。其可通過自身分泌的群體感應(yīng)分子（quorum-sensing molecules，QS）調(diào)節(jié)宿主的免疫功能，進(jìn)而發(fā)生免疫逃逸［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，QS信號分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型絲氨酸內(nèi)酯（N-3-oxododecanoyl-L-homoserine lactone，3-O-C12-HSL）可阻礙單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞（monocytes derived-dendritic cells，Mo-DCs）的成熟，影響CD4+T細(xì)胞極性分化［3-4］。在3-O-C12-HSL阻礙Mo-DCs成熟過程中，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）的表達(dá)譜有明顯變化［5］，且3-O-C12-HSL可通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARγ）拮 抗Mo-DCs表達(dá)lncRNA RP11-367F23.2［6-7］。但lncRNA在3-O-C12-HSL阻礙Mo-DCs成熟過程中發(fā)揮的作用及相關(guān)機(jī)制尚不明確。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，篩選出差異表達(dá)的lncRNA，并對其在3-O-C12-HSL阻礙Mo-DCs成熟過程中的功能進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、Trizol均購自Life公司；二甲基亞砜（DMSO）購自Invitrogen公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購自Axis shield公司；人白細(xì)胞介素（IL）-4和人粒單核細(xì)胞集落刺激因子（hGM-CSF）購自Peprotech公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和3-O-C12-HSL購自Sigma公司；抗人CD14磁珠購自BD公司；PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒（去除gNDA）、SYBR Premix Ex TaqⅡ、Oligo（dT）18 Primer均購自TAKARA公司；NE-PERTM細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒、RNAse CocktailTM酶混合物購自Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1人Mo-DCs的分離、誘導(dǎo)與培養(yǎng) 參照前期研究實(shí)驗(yàn)體系［3］，留取健康人外周血60 mL，與等量PBS混勻后，加入到120 mL的人外周血淋巴細(xì)胞分離液中，密度梯度離心法獲得單個核細(xì)胞。加入抗人CD14免疫磁珠，孵育后使用BD公司的磁力架分選CD14+單核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)鑒定后加入RPMI 1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、終濃度500 U/mL的IL-4、500 U/mL的hGM-CSF）。3 d后半量換液，5 d后收獲不成熟Mo-DCs，檢測Mo-DCs表面CD1a陽性率為（60±6）%［3］。

1.2.2lncRNA芯片檢測 參照前期研究實(shí)驗(yàn)體系［5］，將未成熟的Mo-DCs細(xì)胞分為陰性對照組、LPS陽性對照組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行l(wèi)ncRNA芯片檢測。LPS陽性對照組加入終濃度為100μg/L的LPS，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為100μg/L的LPS和終濃度為40μmol/L的3-O-C12-HSL，陰性對照組加入與實(shí)驗(yàn)組3-O-C12-HSL相等體積的PBS（含0.1%DMSO）。處理24 h后，收集Mo-DCs，提取樣品總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Arraystar公司的lncRNA芯片，利用Arraystar RNA Flash Labeling試劑盒對雙鏈互補(bǔ)DNA進(jìn)行標(biāo)記，Agilent SureHyb進(jìn)行排列雜交。采用Agilent DNA Microarray Scanner掃描芯片并使用Agilent Feature Extraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用歐式距離法進(jìn)行聚類分析。

1.2.3lncRNA驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)分組與處理 lncRNA驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，將未成熟的Mo-DCs細(xì)胞分為5組，其中3-O-C12-HSL濃度參照前期研究實(shí)驗(yàn)體系［4］。（1）陰性對照組：加入含0.1%DMSO的PBS。（2）LPS陽性對照組：加入終濃度為100μg/L的LPS。（3）LPS+C5實(shí)驗(yàn)組：加入終濃度為100μg/L的LPS和5μmol/L的3-O-C12-HSL。（4）LPS+C10實(shí)驗(yàn)組：加入終濃度為100μg/L的LPS和10μmol/L的3-O-C12-HSL。（5）LPS+C25實(shí)驗(yàn)組：加入終濃度為100μg/L的LPS和終濃度為25μmol/L的3-O-C12-HSL。

1.2.4熒光定量PCR（qPCR）檢測 提取細(xì)胞RNA，按照試劑盒說明書去除基因組DNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行qPCR。qPCR反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O 3μL。反應(yīng)條件：50℃120 s；95℃30 s；95℃3 s，60℃30 s，40個循環(huán)；95℃15 s，60℃60 s。所用引物序列見表1。

1.2.5lncRNA生物信息學(xué)分析 采用UCSC網(wǎng)站（http://genome.ucsc.edu/）查找lncRNA CD48-AS和CD48 mRNA序列后，采用GeneDoc軟件分析lncRNA CD48-AS與CD48反義互補(bǔ)區(qū)。另采用多種途徑對lncRNA CD48-AS的蛋白編碼功能進(jìn)行預(yù)測：通過CPC網(wǎng)站（http://cpc.cbi.pku.edu.cn）預(yù)測lncRNA CD48-AS的蛋白編碼能力［8］；通過UCSC數(shù)據(jù)庫［9］（https://genome.ucsc.edu/）獲得lncRNA CD48-AS的比較基因組（phylo CSF）值；若＜0，則提示其為非編碼區(qū)；通過PubMed ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）獲 取lncRNA CD48-AS的開放閱讀框（ORF），對其正義鏈采用基本局部比對搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）分析以檢測是否有同源性蛋白質(zhì)。

Tab.1 The primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.2.6候選lncRNA CD48-AS的poly（A）尾的驗(yàn)證 收集經(jīng)LPS處理后的人Mo-DCs，提取細(xì)胞RNA，去除基因組DNA后，將反轉(zhuǎn)錄體系中的RT Primer Mix更換為Oligo（dT）18Primer反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.7RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（RPA）利用改良RPA實(shí)驗(yàn)原理，即RNase A和RNase T1可消化單鏈RNA，而不消化雙鏈RNA，異丙醇提取消化后產(chǎn)物，產(chǎn)物即為雙鏈RNA。本實(shí)驗(yàn)提取經(jīng)LPS活化成熟的Mo-DCs的RNA，采用焦碳酸二乙酯（Diethyl Pyrocarbonate，DEPC）處理水重懸，加入RNase cocktail酶混合物（RNase A和RNase T1混合物）消化RNA，RNase cocktail酶混合物和RNA體積比為1∶4。37℃消化30 min，加入蛋白酶K去除RNase，異丙醇提取消化后產(chǎn)物，即為雙鏈RNA。針對lncRNA CD48-AS與CD48 mRNA的非互補(bǔ)區(qū)和互補(bǔ)區(qū)設(shè)計(jì)相應(yīng)引物。其中，僅針對lncRNA CD48-AS設(shè)計(jì)primer A，針對lncRNA CD48-AS與CD48 mRNA互補(bǔ)區(qū)設(shè)計(jì)primer B，僅針對CD48 mRNA設(shè)計(jì)primer C。primer A和primer C序列見表1，primer B引物序列上游5′-GCATGCTTCTGGTCAGCCTA-3′，下游5′-GAGCTCTTTTAACTCAAGCGAAAC-3′，產(chǎn)物長度104 bp。采用上述3對引物擴(kuò)增后對目的片段進(jìn)行半定量，并采用2%凝膠對qPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。PCR步驟同1.2.4。

1.2.8lncRNA CD48-AS在人Mo-DCs的胞內(nèi)定位實(shí)驗(yàn) 收集經(jīng)LPS處理活化的人Mo-DCs，嚴(yán)格按照NE-PERTM細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒說明書分別提取胞核與胞質(zhì)內(nèi)RNA。將RNA分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA，對lncRNA CD48-AS進(jìn)行qPCR定量測定。反轉(zhuǎn)錄及qPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同1.2.4。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA芯片結(jié)果 3-O-C12-HSL處理Mo-DCs后lncRNA表達(dá)譜出現(xiàn)了特異性改變，篩選lncRNA表達(dá)譜中差異表達(dá)5倍以上的自然反義lncRNA進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)自然反義lncRNA能夠有效地分層聚類，見圖1。

Fig.1 Hierarchical clustering graph of more than 5 times differently expressed natural antisense lncRNA圖1 5倍以上表達(dá)差異的自然反義lncRNA的分層聚類圖

2.2 lncRNA的篩選及鑒定結(jié)果 從上述差異表達(dá)的自然反義lncRNA中篩選出11條有意義的lncRNA，其中10條為表達(dá)差異較明顯的lncRNA，另1條為本研究中的候選lncRNA ENST00000443928，結(jié)果見表2。與陽性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)較明顯的2條lncRNA分別為ENST00000478167（GeneSymol：RP11-157P1.5，本研究命名為lncRNA 167，上調(diào)56.50倍）和ENST00000415054（GeneSymol：RP1-85F18.6，本 研究命名為lncRNA 054，下調(diào)88.75倍）。而ENST00000443928（GeneSymol：RP11-404F10.2，依據(jù)lncRNA命名規(guī)則，命名為lncRNA CD48-AS）在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)下調(diào)，預(yù)測CD48 mRNA為其自然反義RNA，因CD48在免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，故將其作為候選lncRNA進(jìn)行驗(yàn)證。

驗(yàn)證結(jié)果顯示，與LPS陽性對照組相比，lncDC、lncRNA CD48-AS在不同實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)均有所下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而lncRNA 167在LPS+C5和LPS+C25實(shí)驗(yàn)組中較陰性對照組和LPS陽性對照組均上調(diào)，且陰性對照組與LPS陽性對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2），與該體系的構(gòu)建期望不符。lncRNA 054因表達(dá)量太低，本研究中未展示。

Tab.2 The 11 differentially expressed lncRNA表2 差異表達(dá)的11條lncRNA

2.3 lncRNA CD48-AS生物信息學(xué)分析 基于qPCR驗(yàn)證結(jié)果，本研究選擇lncRNA CD48-AS作為候選lncRNA進(jìn)行后續(xù)研究。UCSC網(wǎng)站顯示其位于1號染色體，為CD48的反義lncRNA，與CD48 mRNA的互補(bǔ)片段為114 bp（圖3A）。cDNA長度為11 056 bp，含有4個外顯子（長度分別為643、145、113、469 bp）和3個內(nèi)含子。CPC網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示，lncRNA CD48-AS的編碼能力評分為-1.19分，其編碼蛋白的可能性極小。通過UCSC數(shù)據(jù)庫獲得lncRNA CD48-AS的phylo CSF值＜0（圖3B），提示其為非編碼區(qū)。通過PubMed ORF finder得知，lncRNA CD48-AS的ORF均小于200 bp，其編碼蛋白質(zhì)的可能性較小，對其正義鏈BLAST結(jié)果顯示這些短肽均無同源性蛋白質(zhì)（圖3C），進(jìn)一步說明該RNA不編碼蛋白質(zhì)。綜上多種途徑驗(yàn)證，lncRNA CD48-AS不編碼蛋白質(zhì)，為非編碼RNA。

2.4 lncRNA CD48-AS的poly（A）尾驗(yàn)證 目前l(fā)ncRNA CD48-AS序列全長尚未完全確定。為此，qPCR驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，RT primer Mix和Oligo（dT）18Primer 2種不同的引物均可擴(kuò)增出lncRNA CD48-AS，且表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4，說明lncRNA CD48-AS末端存在與Oligo（dT）引物結(jié)合的poly（A）尾。

Fig.2 Expression levels of lncRNAs in different treatment groups圖2 不同的lncRNA在不同處理組中的表達(dá)量

2.5 反義靶分子CD48的檢測 因lncRNA CD48-AS序列與CD48的mRNA序列存在114 bp的互補(bǔ)配對，CD48 mRNA可能為lncRNA CD48-AS的反義互補(bǔ)靶分子。通過檢測實(shí)驗(yàn)體系中CD48的mRNA表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，與LPS陽性對照組相比，CD48 mRNA在不同實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)量有所下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示出與lncRNA CD48-AS相同的變化趨勢，見圖5。

2.6 lncRNA CD48-AS與CD48 mRNA形成二聚體 改良RPA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，針對互補(bǔ)區(qū)的引物（primer B）可擴(kuò)增出目的片段，而非互補(bǔ)區(qū)引物（primer A和primer C）未擴(kuò)增出目的片段，提示lncRNA CD48-AS與CD48形成了RNA二聚體而不被RNA酶消化，見圖6。

Fig.3 Bioinformatics analysis of lncRNA CD48-AS圖3 lncRN A CD48-AS的生物信息學(xué)分析

Fig.4 The results of lncRNA CD48-AS amplification with different primers圖4 不同引物擴(kuò)增lncRNA CD48-AS結(jié)果

Fig.5 Expression levels of CD48 in different treatment groups圖5 CD48在不同處理組中的表達(dá)量

2.7 lncRNA CD48-AS在人Mo-DCs的細(xì)胞定位 qPCR結(jié)果顯示，lncRNA CD48-AS在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，但主要表達(dá)在細(xì)胞核中，見圖7。

Fig.7 The expression of lncRNA CD48-AS in nucleus and cytoplasm圖7 細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中l(wèi)ncRNA CD48-AS的表達(dá)量

3 討論

lncRNA是分子鏈長度超過200個核苷酸的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），本身不編碼蛋白質(zhì)，而是以RNA的形式在不同的層面上調(diào)控基因的表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯和表觀遺傳等多方面的調(diào)控［10-11］。調(diào)控的方式包括染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活或干擾等［12］。

前期研究顯示，3-O-C12-HSL阻礙Mo-DCs成熟過程中，lncRNA表達(dá)譜有顯著性的差異表達(dá)，具有5倍以上表達(dá)差異的lncRNA有153條，其中上調(diào)表達(dá)22條，下調(diào)表達(dá)131條［5］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，篩選出在3-O-C12-HSL阻礙Mo-DCs成熟過程中差異表達(dá)的lncRNA CD48-AS，lncRNA CD48-AS的反義互補(bǔ)靶分子CD48 mRNA的差異表達(dá)趨勢與lncRNA CD48-AS一致，這種差異可能是由于lncRNA CD48-AS與CD48 mRNA形成二聚體，減少了RNA酶對CD48 mRNA的降解，增強(qiáng)了CD48 mRNA的穩(wěn)定性，使得CD48表達(dá)上調(diào)。

Mo-DCs的成熟狀態(tài)和功能與眾多基因的表達(dá)水平和細(xì)胞增殖分化密切相關(guān)［13-14］，而lncRNA可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化，還可調(diào)控DC的成熟與功能［15-16］。根據(jù)lncRNA與編碼蛋白基因位置的關(guān)系，將其劃分為5類：內(nèi)含子lncRNA、基因間lncRNA（lincRNA）、雙向lncRNA、反義lncRNA和假基因lncRNA。反義lncRNA的靶基因相對明確，具有較好的保守性和穩(wěn)定性［17］，且在多種疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［18］。本研究前期以lncRNA芯片為基礎(chǔ)篩選出差異較大的3條反義lncRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，同時采用lncDC作為體系培養(yǎng)的陽性對照［16］。本研究結(jié)果顯示，與LPS組相比，lncRNA CD48-AS在3-O-C12-HSL實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)下調(diào)，與lncDC的變化趨勢一致，提示lncRNA CD48-AS在3-O-C12-HSL阻礙Mo-DCs成熟過程中可能發(fā)揮作用。

為闡述lncRNA CD48-AS發(fā)揮作用的機(jī)制，本研究采用多種生物信息學(xué)軟件證實(shí)了lncRNA CD48-AS為反義lncRNA，其與CD48 mRNA有114 bp的互補(bǔ)區(qū)；lncRNA CD48-AS無蛋白編碼功能，且具有poly（A）尾。CD48是淋巴細(xì)胞活化分子家族的成員，參與免疫細(xì)胞的黏附與活化，主要表達(dá)于造血細(xì)胞，但在多種其他活化細(xì)胞中均有高表達(dá)。CD48通過結(jié)合細(xì)胞表面的CD2、細(xì)菌的FimH分子或通過細(xì)胞的內(nèi)部效應(yīng)而起到活化抗原提呈細(xì)胞（APCs）和粒細(xì)胞的作用。CD48還可通過其在APCs上的表達(dá)促進(jìn)T細(xì)胞活化，起到黏附和共刺激的作用［19］。反義RNA可在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平影響mRNA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，CD48的差異表達(dá)趨勢與lncRNA CD48-AS差異表達(dá)趨勢一致，即與LPS組相比，CD48在3-O-C12-HSL組的表達(dá)明顯下調(diào)。有研究報(bào)道，lncRNA可與反義RNA形成RNA二聚體，增加mRNA穩(wěn)定性，使其表達(dá)增加［17］。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用改良RPA實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)了3對針對不同區(qū)域的引物，僅使用lncRNA CD48-AS與CD48互補(bǔ)區(qū)引物時可擴(kuò)增出目的片段，使用非互補(bǔ)區(qū)的引物時均無擴(kuò)增片段，進(jìn)一步證實(shí)了lncRNA CD48-AS與CD48 mRNA形成的二聚體增加了CD48 mRNA的穩(wěn)定性。

lncRNAs表達(dá)在不同細(xì)胞及在細(xì)胞內(nèi)的不同定位決定著其功能及發(fā)揮作用的機(jī)制。在細(xì)胞質(zhì)中，lncRNA可與靶RNAs直接作用，控制RNA的表達(dá)和mRNA的翻譯；還可與信號蛋白相互作用，調(diào)節(jié)信號通路特異性基因的表達(dá)；而細(xì)胞核lncRNA則在表觀遺傳調(diào)控和轉(zhuǎn)錄過程［20］中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CD48-AS在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，但主要表達(dá)在細(xì)胞核中，提示其可能還通過表觀遺傳或轉(zhuǎn)錄過程調(diào)控其他基因的表達(dá)，從而在3-OC12-HSL阻礙Mo-DCs成熟過程中發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究通過篩選并驗(yàn)證lncRNA CD48-AS在實(shí)驗(yàn)體系中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)3-O-C12-HSL抑制了Mo-DCs成熟過程中l(wèi)ncRNA CD48-AS的表達(dá)，并且可能通過抑制lncRNA CD48-AS的表達(dá)使CD48的表達(dá)下調(diào)，從而抑制Mo-DCs的成熟，豐富了lncRNAs在3-O-C12-HSL通過Mo-DCs介導(dǎo)免疫逃逸中的分子機(jī)制。然而，lncRNA CD48-AS的具體功能、作用機(jī)制以及表達(dá)調(diào)控機(jī)制還待進(jìn)一步的研究與驗(yàn)證。