稽留流產(chǎn)絨毛染色體通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)235例結(jié)果分析

張羽，劉琰，李蘭蘭，李麗

稽留流產(chǎn)（missed abortion，MA）指胚胎或胎兒死亡后滯留于宮腔未能及時(shí)排出的一種流產(chǎn)類型［1］。其病因復(fù)雜多樣，包括染色體、內(nèi)分泌、感染、免疫、解剖等因素的影響，且仍有50%病因不明。在不明原因自然流產(chǎn)中，染色體異常可達(dá)50%～85%［2］。本研究回顧性分析我院稽留流產(chǎn)病人絨毛染色體基因拷貝數(shù)檢測(cè)（genomic copy number variations，CNVs）及核型分析結(jié)果，進(jìn)一步明確流產(chǎn)病因，從而更好地做出遺傳學(xué)咨詢、改善妊娠結(jié)局。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2018年8月至2019年8月西北婦女兒童醫(yī)院生殖婦科稽留流產(chǎn)病人235例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。其納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡范圍20～45歲，孕齡7～12周，此次妊娠經(jīng)B超動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)為空孕囊或未見(jiàn)胎心搏動(dòng)或胎心搏動(dòng)消失者診斷為稽留流產(chǎn)，且妊娠期間無(wú)感染，無(wú)放射線、毒物接觸史，無(wú)生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常，無(wú)高血壓、糖尿病等內(nèi)外科合并癥。所有病人簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法稽留流產(chǎn)病人流產(chǎn)后收集絨毛組織10 mg，用生理鹽水沖洗殘留血液、剔除其他組織。采用Qiagen Blood & Tissue（德 國(guó)Qiagen GmbH）進(jìn)行絨毛DNA提取，隨后進(jìn)行文庫(kù)制備（EZGALO），最后采用高通量測(cè)序儀（NextSeq CN 500）進(jìn)行測(cè)序。最后，將所測(cè)結(jié)果與人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配比較。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 絨毛高通量測(cè)序染色體檢測(cè)結(jié)果235例稽留流產(chǎn)病人絨毛染色體檢測(cè)結(jié)果中，有70例（29.79%）結(jié)果正常，165例（70.21%）存在異常現(xiàn)象。其中染色體數(shù)目異常有118例（71.5%），染色體結(jié)構(gòu)異常有47例（24.48%）（表1）。

表1 稽留流產(chǎn)病人235例絨毛染色體檢測(cè)結(jié)果∕%

2.1.1染色體數(shù)目異常結(jié)果在染色體數(shù)目異常中（n=118），以非整倍體為主，其中三體所占比例最高——46.7%（n=77），以16、22、21、15-三體最為高發(fā)。而所有的雙重三體均為21或22-三體合并其他三體（表2）。性染色體非整倍體包含1例三體（47，XN，+X）及7例單體（均為45，X）。嵌合體包含三體嵌合體、單體嵌合體、兩性嵌合體，其中三體嵌合體可見(jiàn)不等數(shù)量的3、17、18、20-三體。在235例病人中，除了1、19-三體未發(fā)現(xiàn)，其余編號(hào)染色體均可見(jiàn)三體存在。

表2 6例染色體雙重三體詳情

2.1.2染色體結(jié)構(gòu)異常結(jié)果47例染色體結(jié)構(gòu)異常的位點(diǎn)不同、拷貝數(shù)大小不等，導(dǎo)致其致病性不同。經(jīng)查詢對(duì)比DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源可得，未知致病性占55.32%（n=26）、多態(tài)性占25.53 %（n=12）與已知致病性19.15%（n=12），其中已知致病詳情見(jiàn)表3。

表3 已知致病性染色體結(jié)構(gòu)異常病人9例詳情

所有未知致病性的異?？截悢?shù)范圍為0.12～3.64 Mb，多態(tài)性為0.28～1.06 Mb，已知致病性為0.24～99.42 Mb。

2.2 染色體異常與病人年齡、妊娠方式及流產(chǎn)次數(shù)的關(guān)系與三體組年齡（32.55±4.65）相比，雙重三 體 組 年 齡（38.67±3.14）明 顯 偏 高（t=4.41，P＜0.05）。而染色體正常組年齡較異常組偏低（P＜0.05），且年齡＜35歲組染色體異常發(fā)生率明顯低于年齡≥35歲組（P＜0.05）；染色體的異常率與病人妊娠方式及既往流產(chǎn)次數(shù)無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 稽留流產(chǎn)235例絨毛染色體異常相關(guān)因素分析

3 討論

稽留流產(chǎn)發(fā)病率高，且病因不明、復(fù)雜多樣［3］，檢測(cè)稽留流產(chǎn)病人染色體異常情況，有助于尋找流產(chǎn)原因，最終緩解病人及其家庭身心壓力［4］。

有數(shù)據(jù)報(bào)道，早期流產(chǎn)中胚胎染色體異常率可達(dá)50%～60%［5-8］。常規(guī)的G帶核型分析被用作檢測(cè)染色體非整倍性和不平衡的金標(biāo)準(zhǔn)，但此方法失敗率較高、易受母體細(xì)胞污染、只能檢測(cè)特定的染色體異常［9］，可造成結(jié)果偏差［10］。而高通量測(cè)序技術(shù)作為第二代測(cè)序的代表，擁有高通量、高精準(zhǔn)、低成本、易操作等優(yōu)勢(shì)［11］，因而應(yīng)用廣泛。并且范寶光等［12］指出，高通量基因測(cè)序技術(shù)能發(fā)現(xiàn)稽留流產(chǎn)絨毛染色體的微缺失或重復(fù)，為檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)異常開(kāi)辟了新的途徑，有望成為稽留流產(chǎn)絨毛染色體檢測(cè)的主要手段。

本研究正是采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)235例稽留流產(chǎn)病人絨毛染色體異常情況及基因拷貝數(shù)，最終可得染色體異常率為70.21%，與Jurkovic D等［2］報(bào)道相近。

染色體異常包括數(shù)目與結(jié)構(gòu)的異常，其中以染色體數(shù)目異常為主［13］。本研究結(jié)果中，染色體數(shù)目異常占71.5%（包括雙重三體及嵌合體），其中非整倍體可達(dá)染色體異常的54.55%。有文獻(xiàn)表明，大多數(shù)非整倍體的發(fā)生是因?yàn)槁涯讣?xì)胞第一次減數(shù)分裂錯(cuò)誤所致［3］。而非整倍體改變中以染色體三體為主，并以16-三體出現(xiàn)頻次最高。與本研究一致：16-三體所占比例最高（33.77%），緊隨其后的有22-三體（19.48%）、21-三體（15.58%）、15-三體（5.19%）。但與大多數(shù)非整倍體發(fā)生原因不同的是，16-三體的發(fā)生可能與父系第一次減數(shù)分裂未分離關(guān)系更加密切［14］。雖然16-三體在早期流產(chǎn)中所占比例極高，但并不能完全說(shuō)明16-三體是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要因素。因其他染色體的異?？赡軙?huì)直接導(dǎo)致胚胎不著床而降低檢出率，或其異常染色體并不致死，可持續(xù)至孕中、晚期。此外，本研究所出現(xiàn)的77例三體中，除了1、19號(hào)染色體未發(fā)現(xiàn)三體外，其余編號(hào)染色體均存在染色體三體現(xiàn)象［15］，且大部分文獻(xiàn)均未見(jiàn)1-三體報(bào)道［16］。

本研究所有嵌合體占異?？倲?shù)的16.9%，且嵌合類型不一。其中7例單體均為45，X（Turner綜合征），占非整倍體的7.8%。Turner綜合征在新生女嬰中發(fā)病率約達(dá)1∕5 000，臨床病例多見(jiàn)，常表現(xiàn)為身材矮小、性腺發(fā)育不良［17］。由于正常與異常細(xì)胞系比例不定，此結(jié)果不一定反映真實(shí)水平。

染色體結(jié)構(gòu)異常包括重復(fù)、缺失、異位、倒位、插入等，本研究中數(shù)目異常與重復(fù)、缺失、重復(fù)與缺失并存。因高通量測(cè)序技術(shù)準(zhǔn)確率、靈敏度均較高，可檢測(cè)100 kb以上片段大小。此235例樣本中發(fā)現(xiàn)了0.12～99.42 Mb大小不等的異常片段，擁有較高的染色體異常檢出率，增加了診斷的準(zhǔn)確性。如上所述，基因異常的位點(diǎn)及大小不同，導(dǎo)致的致病性亦不同；但未知致病性及多態(tài)性的異常片段相對(duì)較小，易于得到基因補(bǔ)償而無(wú)臨床特殊癥狀表現(xiàn)。

年齡是影響妊娠的一大重要因素，年齡越大、流產(chǎn)率越高［18］。女性隨著年齡的增長(zhǎng)，卵子質(zhì)量會(huì)相應(yīng)下降，且高齡會(huì)增加染色體不分離現(xiàn)象，從而導(dǎo)致非整倍體的發(fā)生。本研究進(jìn)一步證明，染色體異常組病人年齡（32.08±4.52）明顯高于正常組（30.19±3.62），且 年 齡≥35歲 組 染 色 體 異 常 率（83.92%）較正常組（65.92%）偏高。而表2顯示，雙重三體病人的年齡（38.5±3.27）異常偏高，考慮高齡更易導(dǎo)致雙重三體的發(fā)生。而妊娠方式與染色體異常率并無(wú)相關(guān)關(guān)系，這與一項(xiàng)Meta分析結(jié)果相一致［19］。且本研究表明流產(chǎn)次數(shù)與染色體的異常率亦無(wú)明顯必然聯(lián)系。雖在6例雙重三體中，除了1例病人為自然妊娠，其余均為人類輔助生殖技術(shù)助孕，分析其原因可能為樣本數(shù)較小，且病人有不孕史、年齡偏大，因此采取了人類輔助生殖技術(shù)。

綜上所述，早期流產(chǎn)的主要原因仍以胚胎染色體異常為主。高齡可增加胚胎染色體的異常風(fēng)險(xiǎn)，但妊娠方式及既往流產(chǎn)次數(shù)對(duì)胚胎染色體并無(wú)明顯影響。高通量測(cè)序技術(shù)可準(zhǔn)確、快速地檢出染色體異常率及異常情況。