青蒿素對(duì)大鼠自體移植靜脈橋內(nèi)膜增生的影響

黃強(qiáng)信 周念 馮志強(qiáng) 韋懿桐

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院胸心血管外科（南寧530023）

大隱靜脈仍是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）的常用血管橋［1］，然而，移植術(shù)后靜脈橋再狹窄率較高，嚴(yán)重影響手術(shù)遠(yuǎn)期療效［2］。術(shù)后大隱靜脈橋通暢率是CABG 術(shù)后成功的關(guān)鍵，術(shù)后1年靜脈橋通暢率為80% ～90%，術(shù)后10年下降至40% ～50%［3］。因此，如何改善靜脈橋的中遠(yuǎn)期通暢性仍是目前國(guó)際研究熱點(diǎn)。

冠脈搭橋術(shù)后血管橋再狹窄的病理生理基礎(chǔ)依次是早期血小板血栓形成、中期內(nèi)膜增厚以及晚期粥樣硬化征［4］。合理應(yīng)用抗凝藥可防止早期血管橋狹窄，晚期避免冠心病的各類高危因素可延緩粥樣硬化征象的再次出現(xiàn)，然而，術(shù)后中期如何抗平滑肌細(xì)胞增殖及內(nèi)膜增厚的相關(guān)研究則有所欠缺，若能找到有效抗內(nèi)膜增厚的臨床方法，對(duì)抗冠脈搭橋術(shù)后中期血管橋再狹窄將具有積極的作用［5］。因此，血管橋再狹窄主要是血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）發(fā)生表型轉(zhuǎn)化導(dǎo)致增殖及遷移［6-7］。研究表明［8］平滑肌22α（SM22α）蛋白是維持VSMCs 收縮表型所必需的一種重要細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，也是鑒定VSMCs 表型轉(zhuǎn)化極為敏感的特異性標(biāo)志物。近年研究不斷發(fā)現(xiàn)，青蒿素及其衍生物藥理活性廣泛，是一種從黃花蒿中提取的倍半萜內(nèi)酯類過(guò)氧化物類藥物，具有安全、價(jià)格便宜、口服吸收良好等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)心律失常、心肌缺血、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病均有良好的改善作用［9-11］。其中，青蒿素可通過(guò)抑制VSMCs 表型從收縮表型向去分化表型轉(zhuǎn)變，具有改善動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的藥理作用［12-13］，然而，在靜脈橋是否有影響仍是未知。本研究擬通過(guò)大鼠自體靜脈移植模型，探討其對(duì)移植后靜脈橋內(nèi)膜增生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料青蒿素（meilunbio MB6836），兔抗SM22α多克隆抗體（Abcam 公司，ab14106），山羊抗小鼠IgG-HRP、RIPA 蛋白裂解液和BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天公司）。內(nèi)參β-Actin（康成生物公司），免疫組化試劑盒（博士德公司），HE 染色試劑盒（南京建成生物技術(shù)有限公司），雙目雙人顯微鏡（新天醫(yī)療器械公司）及顯微外科器械一套（寧波手術(shù)器械廠），Alpha View 成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Simple 公司）。健康雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量240 ～280 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物模型的建立術(shù)前常規(guī)禁食，使用10%水合氯醛按300 mg/kg 腹腔注射麻醉，肝素鈉（200 U/kg）尾靜脈注射達(dá)肝素化。取頸部正中切口約2.5 cm，常規(guī)備皮、消毒及切開皮膚，逐層分離，暴露右頸外靜脈，8/0 結(jié)扎其屬支，離取0.8 ～1.0 cm 遠(yuǎn)心端主干，肝素鈉鹽水沖管腔及浸泡其中備用。于右側(cè)氣管旁、胸鎖乳突肌下充分游離頸總動(dòng)脈至分叉處，長(zhǎng)約1.0 ～1.2 cm，盡量避免損傷氣管旁小動(dòng)脈分支及迷走神經(jīng)，罌粟堿稀釋液噴灑動(dòng)脈表面。頸總動(dòng)脈兩端用無(wú)損傷血管夾阻斷血流，中間離斷，切除動(dòng)脈約0.5 cm，肝素鈉鹽水沖洗管腔并清除血凝塊。利用“cuff”管套管技術(shù)將切下頸外靜脈吻合于頸總動(dòng)脈，建立自體靜脈移植的模型。術(shù)后當(dāng)天青霉素400 KU/kg 肌肉注射，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物模型分組及處理按電腦隨機(jī)數(shù)法分成青蒿素治療實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各分為靜脈移植術(shù)后2 周和4 周時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8 只。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別在術(shù)前1 d 至取材時(shí)間給予青蒿素100 mg/（kg·d）、等體積生理鹽水灌胃。因麻醉過(guò)量、切口感染、腸梗阻、其他原因而死亡或血管閉塞的大鼠不列入后續(xù)研究。

1.4 靜脈橋標(biāo)本的采集及處理在術(shù)后2 周和4周沿原切口找到靜脈橋，充分分離并取下靜脈橋，肝素鈉鹽水沖洗干凈，一部分用4%多聚甲醛液固定，備行HE 染色與免疫組織化學(xué)檢測(cè)，另一部分保存于液氮罐備行Western bolt 檢測(cè)。

1.5 病理形態(tài)學(xué)及免疫組化染色血管橋標(biāo)本用4%多聚甲醛液固定后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成蠟塊，切片用常規(guī)蘇木精-伊紅染色（HE染色），采用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）測(cè)量血管中段橫截面新生內(nèi)膜厚度，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5 處不連續(xù)的位置測(cè)量，計(jì)算平均厚度。石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%過(guò)氧化氫室溫孵育5 min，微波爐抗原修復(fù)，5%～10%正常山羊血清封閉，滴加一抗兔抗SM22α 多克隆抗體（工作濃度1∶100），4 ℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37 ℃孵育15 min。滴加SABC 復(fù)合物37 ℃孵育15 min。DAB 顯色，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封閉固定后行光鏡檢查，光鏡下平滑肌胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)淡黃至棕黃色顆粒為SM22α 陽(yáng)性細(xì)胞，散在淡棕黃色為弱陽(yáng)性，無(wú)棕黃色為陰性。

1.6 靜脈橋組織SM22α蛋白表達(dá)的測(cè)定取靜脈橋血管組織約5 mg，加入RIPA 蛋白裂解液60 μL和PMSF1 μL 進(jìn)行總蛋白的提取，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣本蛋白的濃度。蛋白于12%SDS-聚丙酰胺凝膠電泳90 min，濕法電轉(zhuǎn)50 min 轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PDVF）膜后，剪出目的條帶，6%脫脂奶封閉1.5 h，加兔抗SM22α 多克隆抗體（1∶1 000）進(jìn)行抗體結(jié)合，4 ℃過(guò)夜，TBST 洗膜后加山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶1 000）室溫下孵育1 h，TBST 洗膜后滴加ECL 發(fā)光混合液在Alpha View 成像系統(tǒng)中顯影。以β-Actin（1∶1 000）為內(nèi)參抗體。圖像用成像系統(tǒng)中的Multiplex Band Analysis 軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析；以SM22α 蛋白與β-Actin 蛋白條帶的灰度積分比值來(lái)代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量來(lái)分析結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型建立及靜脈橋通暢情況32 只SD大鼠手術(shù)均成功，均符合實(shí)驗(yàn)要求，術(shù)中、術(shù)后見(jiàn)靜脈橋充盈良好。術(shù)后2 周、4 周靜脈橋血管均不同程度的膨脹增粗及小血管增生。剪斷靜脈橋遠(yuǎn)端動(dòng)脈，可見(jiàn)血液噴出，證實(shí)靜脈橋通暢。

2.2 組織形態(tài)學(xué)改變HE 染色結(jié)果示，光鏡下術(shù)后2 周內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂及平滑肌細(xì)胞增生明顯，4 周比較明顯，經(jīng)青蒿素治療2 周和4 周后新生內(nèi)膜與同期對(duì)照組相比：內(nèi)膜相對(duì)完整，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞明顯減少，內(nèi)膜的厚度與同期相比明顯顯著減少。差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1 和表1）。

圖1 兩組血管內(nèi)膜增厚情況（HE 染色，×200）Fig.1 Intimal hyperplasia in two groups（HE stained，×200）

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組內(nèi)膜增生厚度的比較Tab.1 Comparion of intima thickness between treatment group and control group ±s

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組內(nèi)膜增生厚度的比較Tab.1 Comparion of intima thickness between treatment group and control group ±s

注：與同期對(duì)照組新生內(nèi)膜厚度比較，aP＜0.01

組別數(shù)量（只）平均內(nèi)膜厚度（μm）實(shí)驗(yàn)組2 周對(duì)照組2 周實(shí)驗(yàn)組4 周對(duì)照組4 周8 8 8 8 20.79±1.88a 35.23±2.66 37.06±2.22a 46.23±2.54

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果鏡下可見(jiàn)靜脈橋組織平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，即SM22α 蛋白表達(dá)陽(yáng)性，其他區(qū)域無(wú)棕黃色或呈稀疏淡棕色，即SM22α 蛋白表達(dá)陰性或弱陽(yáng)性（圖2）。結(jié)果顯示，經(jīng)青蒿素治療后2 周和4 周靜脈橋組織中SM22α蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與同期對(duì)照組相比，對(duì)照組下降顯著［（59.20±5.76）vs.（26.12±3.72），P＜0.01；（35.63 ± 4.36）vs.（10.38 ± 2.98），P＜0.01］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 SM22α 蛋白在靜脈橋的表達(dá)變化（免疫組化，×200）Fig.2 Changes of SM22α protein expression in graft veins（Immunohistochemistry，×200）

2.4 Western blot 結(jié)果用Western blot 方法檢測(cè)移植靜脈橋組織中SM22α 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，經(jīng)青蒿素治療后2 周和4 周靜脈橋組織中SM22α 蛋白含量（SM22α/β-Actin）與同期對(duì)照組相比，對(duì)照組下降顯著［（0.58±0.1）vs.（0.39±0.06），P＜0.01；（0.42 ± 0.06）vs.（0.21 ± 0.05），P＜0.01］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3。

圖3 SM22α 蛋白在靜脈橋組織的相對(duì)表達(dá)量變化情況Fig.3 The relative expression of SM22α protein in graft veins

3 討論

靜脈橋血管再狹窄的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多因子共同參與的結(jié)果，包括早期的內(nèi)皮損傷、血栓形成、再內(nèi)皮化、靜脈橋血管的動(dòng)脈化，中期的內(nèi)膜增生以及晚期的粥樣硬化及斑塊破裂等［14-15］。研究表明［4，16］，在手術(shù)創(chuàng)傷、移植靜脈缺血及再灌注性損傷、靜脈血流動(dòng)力學(xué)改變等諸多因素的刺激下，移植血管打破正常生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，血管壁細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控失衡，促進(jìn)血管內(nèi)膜重塑，新生內(nèi)膜發(fā)生增生、增厚最終導(dǎo)致了再狹窄，而血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移是其中的關(guān)鍵病理過(guò)程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在自體靜脈移植術(shù)后2 周，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均出現(xiàn)平滑肌細(xì)胞大量增殖并且向內(nèi)膜下遷移及內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂至新生內(nèi)膜增厚，術(shù)后4 周更為顯著；但實(shí)驗(yàn)組與同期對(duì)照組相比，新生內(nèi)膜厚度明顯減少。這說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)組靜脈橋再狹窄的程度輕。

VSMCs 在成人血管中表現(xiàn)為成熟的分化表型（收縮表型），常常表達(dá)一組獨(dú)特的收縮功能蛋白為主如SM22α、平滑肌肌動(dòng)蛋白α（α 平滑?。⑵交〖∏虻鞍字劓湥⊿MMHC）、鈣調(diào)節(jié)蛋白（calponin）等，表現(xiàn)為極低的增殖遷移、低成活性［17］。其中，SM22α 蛋白是一種收縮型VSMCs 標(biāo)志物，參與收縮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，過(guò)表達(dá)SM22α 可干擾PDGF-BB 誘導(dǎo)的Ras-Raf-1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物的形成，阻斷MEK1/2-ERK1/2 增殖信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活；進(jìn)而抑制VSMCs 增殖、遷移和內(nèi)膜增生［18-20］。然而，SM22α-/-Apo E-/-小鼠的VSMCs 增殖遷移能力增加，動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展更快［20］。因此，SM22α表達(dá)異常與平滑肌細(xì)胞異常增殖與遷移密切相關(guān)。近年的研究表明［12］，青蒿素可以抑制血管平滑肌的SM22α 表達(dá)下調(diào)，從而抑制VSMCs 表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而達(dá)到抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和去分化的作用，從而減緩Apo E-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，自體靜脈移植術(shù)后靜脈橋組織的平滑肌細(xì)胞的胞質(zhì)有SM22α 表達(dá)。并且移植術(shù)后2 周后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組靜脈橋內(nèi)膜增生明顯減少的同時(shí)，組織中SM22α 蛋白表達(dá)也在抑制下調(diào)。這表明，SM22α 可能參與了靜脈橋內(nèi)膜增生的發(fā)生與發(fā)展這一復(fù)雜病理生理過(guò)程，而青蒿素能夠抑制血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用，從而抑制平滑肌細(xì)胞異常增殖和（或）遷移，進(jìn)而減輕靜脈橋狹窄的發(fā)生，可能是產(chǎn)生這一效果的原因。具體的機(jī)制有待深入研究。

總之，本研究表明，青蒿素能抑制靜脈橋SM22α的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而減輕新生內(nèi)膜厚度，對(duì)靜脈橋狹窄的發(fā)生與發(fā)展有比較好的防治前景，但此實(shí)驗(yàn)樣本量相對(duì)比較少，亦未進(jìn)行細(xì)胞及其機(jī)制的探討，仍需進(jìn)一步深入研究。