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    海島棉抗枯萎病性狀與 SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

    2022-01-01 08:37:42陸小雙張夢潔韓萬里龍遺磊劉鵬飛陳全家曲延英鄧曉娟
    新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:海島棉感病枯萎病

    陸小雙,張夢潔,韓萬里,龍遺磊,劉鵬飛,陳全家,曲延英,鄧曉娟

    (新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,烏魯木齊 830052)

    0 引 言

    【研究意義】棉花枯萎病病原菌為尖鐮孢萎蔫?;?Fusariumoxysporum.f.sp.Vasinfectum(Atk.) Snyder and Hansen),屬于土傳維管束病害,該病菌在土壤中存活年限長,一般在苗期或現(xiàn)蕾期出現(xiàn)發(fā)病高峰,該病的發(fā)生受多種因素的影響,防治起來困難[1-2]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】2014~2018年5年間我國棉花枯萎病的平均發(fā)病面積為36.42×104hm2·次,造成19.70%的產(chǎn)量損失[3]。施用生物有機(jī)肥能夠降低棉花枯萎病的發(fā)病率,增產(chǎn)約3.1%~10.8%,但增加栽培成本[4]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】輪作倒茬的方式雖然可以有效抑制棉花枯萎病的發(fā)生,但也受耕地資源限制[5]。棉花抗病新品種的選擇和培育是最為有效的解決途徑之一[6]。傳統(tǒng)大田育種方法不僅周期較長,傳統(tǒng)的病圃鑒定耗時(shí)耗力且準(zhǔn)確性較差[7],分子標(biāo)記技術(shù)的成熟與發(fā)展為棉花抗病品種選育提供了新的技術(shù)支持[8]。【擬解決的關(guān)鍵問題】鑒定204份海島棉種質(zhì)資源,分析獲得的海島棉抗病基因SSR分子標(biāo)記,篩選獲得關(guān)聯(lián)的海島棉抗枯萎病分子標(biāo)記,為棉花分子標(biāo)記輔助育種提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    供試材料為以 204 份海島棉材料構(gòu)成的自然群體,由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

    菌種為尖孢鐮刀菌七號生理小種,由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。表1

    表1 204份海島棉材料來源Table 1 The origin regions of 204 sea island cotton accessions

    在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花培養(yǎng)室室內(nèi)鑒定棉花枯萎病抗性。將棉花材料種在直徑約為10 cm的營養(yǎng)缽里,每缽種1個(gè)材料,每缽播種5粒種子,3次重復(fù),掛牌標(biāo)記。采用一般肥水管理。

    在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理系棉花病害研究室制備馬鈴薯液體培養(yǎng)基。將挑取枯萎病菌單菌落接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中,25℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)1周以上,用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)菌液濃度達(dá)到1×107個(gè)/cm2時(shí)備用。

    1.2 方 法

    1.2.1 海島棉資源群體枯萎病抗性的室內(nèi)鑒定

    待棉花幼苗2片子葉展平時(shí),用滅過菌的剪刀將營養(yǎng)缽底部剪掉1 cm左右,然后放在含有枯萎病菌的培養(yǎng)皿中沾取菌液后,放回原處。在接種3周后開始調(diào)查和統(tǒng)計(jì)室內(nèi)病情,待病情穩(wěn)定后調(diào)查發(fā)病率。

    棉花枯萎病株分級標(biāo)準(zhǔn)采用國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[9]。表2

    表2 棉花枯萎病級劃分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The classification standard of cotton Fusarium wilt

    采用病情指數(shù)來鑒定棉花株系的枯萎病抗性,參考有關(guān)資料,將鑒定材料分為免疫(I)、高抗(HR)、抗病(R)、耐病(T)和感病(S)5個(gè)等級[10]。表3

    表3 棉花材料抗病性劃分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Criteria for disease resistance of cotton materials

    1.2.2 SSR分子標(biāo)記開發(fā)、鑒定和評價(jià)

    利用黃啟秀等[11]報(bào)道的5個(gè)海島棉抗枯萎病基因,通過primer5.0設(shè)計(jì)SSR分子標(biāo)記40對。以4個(gè)抗病材料和3個(gè)感病材料(抗病材料為06-146、埃棉2號、DJ-07-136和Pimas-7,感病材料為新海14號、海92-3和埃及棉424)對SSR引物進(jìn)行初步篩選。獲得的特異條帶在海島棉資源群體中分析,驗(yàn)證分子標(biāo)記的適用性。

    以棉花幼苗真葉期葉片為材料,用改進(jìn)的 CTAB 法提取DNA[12]。所用 SSR引物由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)程序:95℃ 預(yù)變性 5 min; 30 個(gè)循環(huán)( 94℃ 變性 30 s,58℃ 退火溫度 45 s,延伸30 s); 72℃ 延伸 10 min;4℃ 保存。使用濃度為 8% 的聚丙烯酰胺凝膠電泳對 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離,待跑完電泳以后,銀染依據(jù)郭大龍等[13]方法照相保存。表4

    表4 SSR引物及基因來源Table 4 SSR primers and gene sources

    2 結(jié)果與分析

    2.1 群體室內(nèi)抗病性鑒定結(jié)果

    研究表明,204份海島棉資源材料中,高抗材料(HR)2份(中國新疆和內(nèi)地各1份),占所測定棉花材料的0.98%;抗病材料(R)34份(中國內(nèi)地11份,蘇聯(lián)10份,中國新疆7份,美國2份,未知4份),占所測定棉花材料的16.67%;耐病材料(T)107份(中國新疆29份,前蘇聯(lián)26份,中國內(nèi)地22份,埃及10份,美國8份,未知12份),占所測定棉花材料的52.45%;感病材料(S) 61份(中國內(nèi)地18份,中國新疆10份,前蘇聯(lián)9份,美國5份,埃及5份,阿爾巴尼亞2份,未知12份),占所測定棉花材料的29.90%;無免疫材料。表5

    表5 海島棉材料的室內(nèi)鑒定結(jié)果Table 5 Indoor identification results of island cotton materials

    2.2 分子標(biāo)記篩選

    研究表明,共有6對引物與抗病性具有多態(tài)性。CHS-04和CHS-05重復(fù)性較強(qiáng)。引物CHS-04擴(kuò)增下抗病品種06-146、DJ-07-136、埃棉2號和Pimas-7擴(kuò)增出一條特意差異帶,條帶大約為1 350 bp,而感病品種新海14號和埃及棉424未能擴(kuò)增出這條帶,而是400 bp的帶。引物CHS-05擴(kuò)增下感病品種新海14號、海92-3和埃及棉424擴(kuò)增出兩條差異帶,大小約為400 bp 和 630 bp,而抗病材料DJ-07-136擴(kuò)增出一條帶,約為630 bp,06-146、Pimas-7和埃棉2號均未能擴(kuò)增出這兩條帶。圖1,表6

    注:A:CHS-04 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M:D2000 Maker;1:新海14號;2:06-146;3:埃棉2號;4:DJ-07-136;5:Pimas-7;6:海92-3;7:埃及棉424 B:CHS-05 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M:D2000 Maker;a:新海14號;b:06-146;c:埃棉2號;d:DJ-07-136;e:Pimas-7;f:海92-3;g:埃及棉424

    表6 引物篩選PCR擴(kuò)增電泳Table 6 primer screening PCR amplification electrophoresis results

    續(xù)表6 引物篩選PCR擴(kuò)增電泳Table 6 primer screening PCR amplification electrophoresis results

    2.3 抗病性分子標(biāo)記與枯萎病抗性關(guān)聯(lián)鑒定

    研究表明,引物CHS-04擴(kuò)增抗病條帶與抗病材料一致率為1;與感病材料一致率較低,為0.67。引物CHS-05擴(kuò)增感病條帶與感病材料一致率達(dá)到1;與抗病材料一致率較低,為0.875。表7

    表7 抗病材料普遍條帶與材料抗性的一致率Table 7 Consistent rate of common strips and resistance of resistant materials

    2.4 抗病關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記的評價(jià)

    研究表明,引物CHS-04擴(kuò)增條帶與群體材料一致率介于41.67%~52.94%,平均值為46.67%。引物CHS-05擴(kuò)增條帶與群體材料一致率介于30.39%~54.68%,平均值為35.78%。圖2,圖3,表8

    注:M:D2000Maker;1:蘇K202;2:新海35號;3:吐77-104;4:躍61;5:孔雀200;6:吉1;7:NMGB-16;8:司-6002;9:巴1248;10:雞爪海島棉長;11:躍51;12:90199;13:云南4號;14:海92-2;15:巴3119;16:9078依;17:軍海1號;18:墨-1413;19:阿101;20:吉2;21:新海34號;22:新海27號;23:910u;24:7059;25:長絨;26:5917;27:吐82-6-17;28:吉扎31;29:NMGB-2;30:新海36號;31:海島棉3;32:K366;33:NMGB-10;34:C-6019;35:7051;36:H3549,下同

    圖3 引物CHS-05擴(kuò)增部分群體材料PCR產(chǎn)物電泳Fig.3 PCR product electrophoresis of primers CHS-05 amplified parts of the population material

    表8 引物CHS-04、CHS-05擴(kuò)增部分群體材料PCR條帶一致率Table 8 PCR band consistency rate of primers CHS-04 and CHS-05 amplified parts of the population materials

    3 討 論

    3.1 類黃酮代謝途徑與棉花枯萎病抗病基因的關(guān)聯(lián)

    目前已知的類黃酮化合物結(jié)構(gòu)有6 000多種,當(dāng)存在微生物侵染時(shí),類黃酮作為植保素在植物體內(nèi)積累以保護(hù)植物,可以阻止植株真菌孢子發(fā)芽[14]。查爾酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是類黃酮合成途徑中的第1個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)酶,催化生成的查爾酮是多種類黃酮代謝途徑的前體,CHS超基因家族起源古老,而查爾酮合成酶是CHS基因家族的核心酶[15]。CHS基因涉及植物的花色、育性和逆境反應(yīng)等多種功能[16]。趙學(xué)榮等[17]從苦蕎中克隆獲得FtCHS1基因側(cè)翼序列PFtCHS1,4℃處理后苦蕎葉子中FtCHS1基因的表達(dá)量在24 h內(nèi)呈現(xiàn)“緩慢下降-急劇上升-驟然下降”的變化,PFtCHS1可響應(yīng)低溫脅迫。馬立功等[18]從向日葵耐病品種龍食葵2號中克隆出HaCHS,研究發(fā)現(xiàn)在低溫、創(chuàng)傷和JA誘導(dǎo)后HaCHS基因表達(dá)量顯著提高,推測HaCHS可能在植物逆境脅迫應(yīng)答中起作用。王爽[19]以抗病品種灰皮支黑豆和感病品種williams82為材料,用大豆胞囊線蟲3號生理小種進(jìn)行侵染脅迫,試驗(yàn)顯示抗病品種灰皮支黑豆中CHS5、CHS7、CHS8、CHS9基因5dpi時(shí)均明顯上調(diào)表達(dá),初步說明CHS基因在抗病品種抗性機(jī)制中的重要作用。黃啟秀[11]研究顯示,接種病菌后的CHS基因在海島棉枯萎病抗病材料中表達(dá)活躍,CHS基因在海島棉抗枯萎病中起著作用。

    3.2 SSR分子標(biāo)記技術(shù)在棉花抗病基因開發(fā)中的應(yīng)用

    SSR( Simple sequence repeat) 即簡單序列重復(fù),又稱微衛(wèi)星DNA,指的是一般1~6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位串聯(lián)組成的簡短序列[20]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)因其對模板DNA要求低,過程簡單,基因組覆蓋范圍廣,再現(xiàn)性好等諸多特點(diǎn)而應(yīng)用廣泛[21]。甄瑞等[22]以高抗黃萎病海島棉與高感黃萎病陸地棉品系的F2群體為材料,采用SSR分子標(biāo)記篩選得到海島棉黃萎病抗性基因連鎖分子標(biāo)記BNL3255208,位于第5號染色體的短臂上。杜威世等[23]以高抗黃萎病海島棉與高感黃萎病陸地棉品系的F2單株群體作為材料,利用SSR分子標(biāo)記檢測到1個(gè)黃萎病抗性的QTL位點(diǎn),位于SSR標(biāo)記位點(diǎn)BNL1414和BNL3556之間。陳勛基等[24]以高抗枯萎病陸地棉與海島棉感病品系的F2∶3群體為材料,利用SSR標(biāo)記構(gòu)建連鎖圖譜,共檢測到4個(gè)與棉花枯萎病相關(guān)QTL效應(yīng),分別位于3、15、23和26連鎖群上。朱永軍等[25]以高感枯萎病海島棉品種新海21號與高抗枯萎病海島棉品系HK237構(gòu)建的P1、P2、F1、F2、F2:3、BC1為材料,利用BSA法對2000對SSR引物進(jìn)行篩選并進(jìn)行遺傳連鎖分析,篩選得到分子標(biāo)價(jià)NAU3240與抗枯萎病基因位點(diǎn)之間緊密連鎖,兩者之間的遺傳距離為19 cm,該標(biāo)記位于棉花D11(Chr.21)染色體區(qū)域。試驗(yàn)采用傳統(tǒng)方法設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記引物,所獲得的與海島棉枯萎病抗病基因相關(guān)聯(lián)SSR分子標(biāo)記是否與前人研究相同,還需對其所處基因連鎖群進(jìn)行進(jìn)一步定位比較后才能確定。

    4 結(jié) 論

    使用由海島棉枯萎病抗病相關(guān)基因設(shè)計(jì)出的40對SSR引物,對204份海島棉種質(zhì)資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增,有2對引物擴(kuò)增出特異條帶,均來源于類黃酮代謝途徑CHS基因。引物CHS-04和CHS-05擴(kuò)增條帶與群體抗病性的高一致率,2對引物可以作為海島棉枯萎病抗性的分子標(biāo)記鑒定指標(biāo)。

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