反芻動物瘤胃甲烷產(chǎn)生的營養(yǎng)調(diào)控

王胤晨，袁 揚，張錦華，何光中，韓 勇，周文章

（1.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽550000；2.西南大學(xué)榮昌校區(qū)，榮昌462460）

全球大氣中最主要的溫室氣體有CO2、CH4、N2O。近幾個世紀(jì)以來，隨著工業(yè)、農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，溫室氣體濃度都顯著的提高。CH4是大氣中重要的微量有機溫室氣體。當(dāng)前CH4是人類生活中產(chǎn)生的僅次于CO2的第二大溫室氣體。CH4對氣候變暖的影響是所有影響全球氣候變暖因素的15%～20%，其增溫潛勢是CO2的62倍。2005年大氣中CH4的濃度為1774ppb，比1998年增加11 ppb，每年大約有5～5.5億噸CH4進(jìn)入大氣，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過大氣反應(yīng)和土壤微生物可以利用消耗的總和［1］。其中，反芻動物年產(chǎn)CH4約7.7×107t，占大氣中的CH4總量的25%，而且每年還以1%的速度遞增［2］。反芻動物CH4氣體的排放不僅造成環(huán)境污染，而且引起能量的損失。隨著各國對溫室氣體排放的重視，調(diào)控反芻動物瘤胃功能減少CH4排放，使更多的能量和碳源轉(zhuǎn)化為可供動物利用的揮發(fā)性脂肪酸，降低瘤胃發(fā)酵的能量損失，提高飼料利用率，這對緩解全球氣候變暖具有重要的現(xiàn)實意義。

1 瘤胃甲烷的形成

瘤胃微生物發(fā)酵中，產(chǎn)甲烷菌利用瘤胃細(xì)菌、真菌、原蟲降解底物所產(chǎn)生的物質(zhì)生成甲烷，其中瘤胃甲烷主要來自于瘤胃中的H2和CO2的反應(yīng)。Thauer等研究報道產(chǎn)甲烷菌是目前已知的唯一一類以甲烷為代謝終產(chǎn)物的微生物，是產(chǎn)甲烷菌獲得能量的唯一途徑［3］。瘤胃內(nèi) H2分壓過高時，瘤胃有益菌的活性和生長受到抑制，產(chǎn)甲烷菌的存在能消耗H2，保持瘤胃內(nèi)低水平的H2分壓，這對維持瘤胃微生態(tài)的平衡具有重要意義。

現(xiàn)有的研究表明甲烷的生物合成機制有四種途徑［4］：第一，CO2－H2還原合成甲烷；第二，甲酸氧化途徑；第三，乙酸異化途徑；第四，甲醇不成比例的分化途徑。其中，瘤胃甲烷的合成大部分來自第一種途徑，占瘤胃甲烷總產(chǎn)量的82%，其它三種途徑產(chǎn)甲烷量較少，占瘤胃甲烷總產(chǎn)量的18%。

雖然甲烷只能由產(chǎn)甲烷菌合成，但瘤胃甲烷的產(chǎn)量與甲烷菌數(shù)量卻沒有一定的比例關(guān)系，瘤胃產(chǎn)甲烷菌與其他微生物在代謝上緊密關(guān)聯(lián)，甚至附著于其他微生物［5］。瘤胃中許多產(chǎn)甲烷菌附著于瘤胃原蟲上，利用其發(fā)酵產(chǎn)物H2生成甲烷；瘤胃厭氧真菌能降解植物纖維產(chǎn)生乙酸、甲酸、H2、CO2、乳酸和少量乙醇，其中大部分產(chǎn)物都能被產(chǎn)甲烷菌利用；瘤胃纖維降解細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)時，能提高纖維降解率和甲烷產(chǎn)量。綜上所述，瘤胃內(nèi)甲烷的合成是依靠產(chǎn)甲烷菌和其他微生物之間的復(fù)雜關(guān)系相互作用形成的，是一個極為復(fù)雜的過程。

2 產(chǎn)甲烷菌與瘤胃微生物之間的關(guān)系

反芻動物的瘤胃內(nèi)棲息著各種復(fù)雜、多樣、非致病的微生物，包括瘤胃細(xì)菌、厭氧真菌、原蟲和古菌，還有少數(shù)噬菌體。瘤胃微生物之間處在一種相互制約、相互依賴的動態(tài)平衡中。瘤胃微生物種群多樣、關(guān)系復(fù)雜，但是都可以分為產(chǎn)氫和耗氫微生物兩大類。產(chǎn)氫微生物主要有瘤胃纖維降解菌、厭氧真菌和原蟲；耗氫微生物在瘤胃內(nèi)的主要代表是產(chǎn)甲烷菌，能利用H2進(jìn)行代謝生長，產(chǎn)生CH4。瘤胃中如果H2累積，還原型煙酰胺腺嘌呤核苷酸（DADH）的氧化作用受到抑制，乳酸等還原性發(fā)酵產(chǎn)物積累，進(jìn)而阻礙粗飼料的消化和有益微生物的生長繁殖。產(chǎn)甲烷菌被抑制后，會出現(xiàn)H2的積累［6］。如何保證CH4產(chǎn)量減少的同時，H2不會累積，是調(diào)控甲烷生成時需考慮的重要因素。

2.1 產(chǎn)甲烷菌與纖維降解菌

反芻動物瘤胃纖維降解菌在降解日糧中的纖維素和半纖維素時會產(chǎn)生大量的H2，這些H2被產(chǎn)甲烷菌利用，同時降低了還原性核苷酸的累積，提高纖維降解菌的能量利用率和纖維消化率。有研究發(fā)現(xiàn)，許多反芻動物的纖維降解菌的數(shù)量和甲烷菌的數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，這說明纖維降解菌和產(chǎn)甲烷菌之間因為種間氫傳遞而存在著某種相互促進(jìn)的共生關(guān)系［7］。Wolin等通過白色瘤胃球菌純培養(yǎng)和與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)，白色瘤胃球菌純培養(yǎng)時產(chǎn)生乙醇、乙酸、H2和CO2，有少量的甲酸，但是共培養(yǎng)時不產(chǎn)生乙醇，并且乙酸的含量增加［8］。纖維降解菌與產(chǎn)甲烷菌單獨培養(yǎng)時，通過NADH的重新氧化降低瘤胃氫分壓；而當(dāng)他們共同培養(yǎng)時，在一些酶的催化作用下，NADH氧化產(chǎn)生H2，用于甲烷的合成。通過這一系列反應(yīng)，使氫分壓降低，氫的總產(chǎn)量和乙酸的產(chǎn)量增加，同時兩種微生物的ATP產(chǎn)量增加、纖維素酶產(chǎn)量增加，而纖維素分解加快。黃色瘤胃球菌與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)時，琥珀酸含量降低，而乙酸產(chǎn)量大大提高［9］。但并不是所有的纖維降解菌降解植物纖維時都會產(chǎn)生H2，因此提高此類纖維降解菌在瘤胃細(xì)菌中的比例，在不影響粗飼料消化的前提下，可以對其進(jìn)行深入研究。

2.2 產(chǎn)甲烷菌與厭氧真菌

瘤胃厭氧真菌降解粗纖維后，主要產(chǎn)物有甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、H2和CO2。產(chǎn)甲烷菌與瘤胃厭氧真菌存在種間氫轉(zhuǎn)移作用，他能提高厭氧真菌纖維素酶與半纖維素酶等的酶活，促進(jìn)厭氧真菌對纖維和半纖維素的降解［10］。真菌與產(chǎn)甲烷菌體外共同培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵轉(zhuǎn)向乙酸型，乳酸和乙醇的產(chǎn)量減少，而H2和甲酸卻非常少，但是乙酸的濃度取決于共培養(yǎng)時產(chǎn)甲烷菌的種類，同時各種纖維降解酶的活性顯著提高，纖維降解率顯著增加［11］。更早的研究表明，瘤胃真菌和產(chǎn)甲烷菌共同培養(yǎng)能明顯地提高植物纖維降解酶的活性，并認(rèn)為產(chǎn)甲烷菌促進(jìn)了分解纖維真菌的活性，改變發(fā)酵產(chǎn)物，產(chǎn)生更多的乙酸、CH4和CO2［12］。在瘤胃中共培養(yǎng)效應(yīng)可能起很大的作用，甲酸、乳酸、和乙醇能夠抑制厭氧真菌的纖維素降解，乳酸大量積累往往會影響原蟲的代謝，而引起酸中毒，共培養(yǎng)時，由于甲酸和乳酸被產(chǎn)甲烷菌利用生成乙酸和CH4，從而使附著在底物上的真菌數(shù)也相應(yīng)增多，對底物的降解率相應(yīng)增高。因此，共培養(yǎng)避免了這些發(fā)酵產(chǎn)物可能引起的副作用。盡管在瘤胃中可能有更復(fù)雜的關(guān)系，但是怎樣在厭氧真菌降解纖維素和CH4產(chǎn)量上找到一個平衡，在提高纖維降解率的同時降低CH4產(chǎn)量。對于真菌降解纖維素的效率和CH4產(chǎn)量的關(guān)系，還有待進(jìn)一步研究。

2.3 產(chǎn)甲烷菌與原蟲

產(chǎn)甲烷菌和瘤胃原蟲之間是兼性共生關(guān)系，它們的結(jié)合方式主要有兩種：內(nèi)共生和外共生。瘤胃原蟲的細(xì)胞膜內(nèi)壁結(jié)合有多重脫氫酶，能催化底物脫氫，產(chǎn)生的氫分子則附著在原蟲上，然而氫分子會抑制原蟲的增殖，但寄生的產(chǎn)甲烷菌能利用這些氫分子合成CH4。其中，瘤胃10%～20%的產(chǎn)甲烷菌附著在纖毛蟲表面，寄生在原蟲胞液里面的產(chǎn)甲烷菌比表面上的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量要多得多。并且有學(xué)者研究報道，并不是所有的瘤胃纖毛蟲表面都有附著產(chǎn)甲烷菌［13］，因此推測細(xì)胞外黏附甲烷菌在瘤胃纖毛蟲的產(chǎn)CH4過程中并不是特別重要，而內(nèi)共生產(chǎn)甲烷菌則可能起著關(guān)鍵的作用。但兩者在功能上是否一樣尚無定論。

迄今為止，有關(guān)纖毛蟲對CH4合成的作用仍存在爭議，部分學(xué)者認(rèn)為纖毛蟲可促進(jìn)瘤胃CH4的合成。Newbold等報道，產(chǎn)甲烷菌與原蟲共生而產(chǎn)生的CH4量占瘤胃總CH4產(chǎn)量的9%～25%［14］。Schonhsen等通過把出生不久的小牛隨機分成兩組，一組使其含蟲，另一組不含蟲，體外培養(yǎng)結(jié)果表明，含蟲組的CH4產(chǎn)量比不含蟲組高34%；在動物體內(nèi)試驗時，含蟲組的CH4產(chǎn)量比不含蟲組高30%，結(jié)果說明纖毛蟲對瘤胃CH4的合成有一定的作用［15］。Dohme等體外連續(xù)培養(yǎng)試驗表明，去原蟲可以顯著降低CH4產(chǎn)量，但甲烷菌數(shù)量不變，說明去原蟲引起的CH4產(chǎn)量降低可能與甲烷菌活力的變化有關(guān)［16］。以上各位學(xué)者研究表明，去原蟲可能是瘤胃降低CH4產(chǎn)量，提高生產(chǎn)性能的一種途徑。人們也在不斷尋找去原蟲技術(shù)，但現(xiàn)在還沒有能應(yīng)用到實際生產(chǎn)當(dāng)中的，可能是去原蟲技術(shù)對動物本身或瘤胃內(nèi)其他微生物有害。

但另有研究表明，纖毛蟲對瘤胃CH4的作用不明顯。Krumhliz等通過將3只剛出生的綿羊與其他羊進(jìn)行隔離飼養(yǎng)到成年，使其不含纖毛蟲，然后接種纖毛蟲，分別測定接種前后瘤胃液產(chǎn)CH4活力，發(fā)現(xiàn)其活力差距不明顯，分別為每毫升每分鐘產(chǎn)16.8nmol和16.3nmolMachmuller等體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，去原蟲不能減少CH4產(chǎn)量，他們認(rèn)為瘤胃液中纖毛蟲和產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的減少并不意味著有效地降低了瘤胃的CH4產(chǎn)量，通過降低產(chǎn)甲烷菌活力及改變瘤胃產(chǎn)甲烷菌組成等途徑可能會降低CH4產(chǎn)量［18］。

3 瘤胃內(nèi)甲烷的營養(yǎng)調(diào)控

3.1 鹵代物及其衍生物

鹵化物及其類似化合物是反芻動物體內(nèi)CH4生成的有效抑制劑，如三氯乙烷、三氯乙炔、溴氯甲烷等，均對產(chǎn)甲烷菌有毒害抑制作用，可抑制20%～80%的CH4產(chǎn)生。水合氯醛在瘤胃中轉(zhuǎn)化成氯仿，氯仿可以降低CH4的生成，但是水合氯醛損壞肝臟、長期飼喂會引起動物中毒，甚至死亡，所以不運用于實際生產(chǎn)中。另外鹵化物抑制CH4排放的效果非常短暫。各種產(chǎn)甲烷菌對鹵化物的敏感性各不相同，2－溴乙烷磺酸鈉（BES）抑制CH4生成的效果較明顯，但在動物實驗發(fā)現(xiàn)其抑制效果短暫，可能是產(chǎn)甲烷菌對BES產(chǎn)生了適應(yīng)性［19］。

3.2 微生物調(diào)控

3.2.1 去原蟲 原蟲在瘤胃纖維發(fā)酵中發(fā)揮重要的作用，瘤胃中50%左右的纖維降解活性來自原蟲。大量研究表明有10%～20%的產(chǎn)甲烷菌寄生在原蟲表面，其CH4產(chǎn)量占到瘤胃液總CH4產(chǎn)量的9%～25%、甚至37%。因此去除原蟲可間接減少甲烷菌數(shù)量，進(jìn)而降低反芻動物的CH4排放。

添加含飽和脂肪酸的保護性脂肪可減少排放，亞麻油和椰子油是目前研究較多的去原蟲植物油。張春梅等體外培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，添加亞麻油能顯著降低CH4的產(chǎn)量，并且可以使瘤胃發(fā)酵模式向丙酸類型轉(zhuǎn)變［20］。McGinn等研究表明，肉牛日糧中添加400g／d的葵花籽油可使排放減少22%，總能的損失減少了21%［21］。Mao等試驗表明，添加大豆油使湖羊CH4產(chǎn)量降低13.9%，產(chǎn)甲烷菌數(shù)量顯著降低，原蟲數(shù)量略有下降［22］。Hu等通過體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，茶皂素對原蟲具有抑制作用，其中添加0.4mg／ml茶皂素處理組的原蟲數(shù)比對照組減少16.39%，CH4產(chǎn)量下降15.79%，微生物蛋白比對照組增加12.12%，改善瘤胃發(fā)酵的作用［23］。

3.2.2 增加乙酸生成菌 乙酸菌是存在于瘤胃內(nèi)的耗氫菌之一，可同產(chǎn)甲烷菌競爭H2，改變H2和CO2的利用方式，生成乙酸。因此，提高乙酸菌對H2的利用是減少CH4生成的另一種方式。但是在瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌與乙酸菌共存時，產(chǎn)甲烷菌對H2的利用處于競爭優(yōu)勢地位，主要原因是只有較高的氫閾值才能滿足乙酸生成需要。體外培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)瘤胃液中添加乙酸菌時，CH4產(chǎn)量降低［24］。增加乙酸菌在瘤胃內(nèi)的數(shù)量是調(diào)控瘤胃發(fā)酵的可行途徑，但由于人類分離得到的乙酸菌數(shù)量有限，還需進(jìn)一步研究影響乙酸菌活性的因素和提高瘤胃內(nèi)乙酸產(chǎn)量的方法。目前有效的方法是研究出高H2親和性的特異乙酸菌，可在瘤胃內(nèi)與產(chǎn)甲烷菌有效競爭，或在產(chǎn)甲烷菌受抑制的條件下添加乙酸生成菌，從而降低 CH4產(chǎn)量［25］。

3.2.3 甲烷氧化菌 甲烷氧化菌（Brevicillus parabrevis）以甲烷為唯一的碳源和能源，瘤胃內(nèi)積聚的CH4是由CH4生成和氧化之差形成的。學(xué)者們已從瘤胃中分離到甲烷氧化菌，但目前有關(guān)瘤胃甲烷氧化菌對CH4抑制效果的報道非常少。Nelson等試驗表明甲烷氧化菌作為益生素應(yīng)用于體內(nèi)和體外試驗中，分別使 CH4產(chǎn)量減少5.9%和18.2%［26］。Kajikawa等研究發(fā)現(xiàn)，氧氣、溴乙烷磺酸鹽和鉬酸鹽可以抑制CH4氧化，瘤胃內(nèi)的CH4氧化反應(yīng)嚴(yán)格厭氧，并且與硫酸鹽的還原反應(yīng)偶聯(lián)［27］。提高CH4在瘤胃內(nèi)的氧化，可能是降低CH4產(chǎn)量的另一種途徑，但其在瘤胃內(nèi)的重要性、體內(nèi)的應(yīng)用效果、日糧的影響及應(yīng)用的加量效應(yīng)還需進(jìn)一步研究。

3.3 飼料添加劑的調(diào)控

3.3.1 離子載體 離子載體是一類土壤微生物產(chǎn)生的聚醚類抗生素，離子載體降低CH4的產(chǎn)量機理可能是改變發(fā)酵類型，由乙酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變成丙酸型發(fā)酵，或通過抑制H2的產(chǎn)生而降低CH4的產(chǎn)量。莫能菌素是廣泛應(yīng)用于調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵的離子載體。Van Nevel等研究表明，莫能菌素能降低動物體內(nèi)25%的CH4產(chǎn)量［28］。Gaun等研究發(fā)現(xiàn)莫能菌素應(yīng)用于肉牛時，飼喂低纖維飼料的牛CH4產(chǎn)量減少27%，而飼喂高纖維飼料的牛CH4產(chǎn)量減少30%［29］。但是莫能菌素對CH4生成的抑制效果不持久，連續(xù)使用效果不佳。并且由于離子載體是一類抗生素，在畜產(chǎn)品中殘留對人體健康造成嚴(yán)重威脅，越來越多的消費者反對其在日糧中的使用。

3.3.2 電子受體 甲醇和其他醇類及乙酸，都能作為電子供體合成甲烷，減少產(chǎn)甲烷菌對H2的利用，轉(zhuǎn)移H2可減少CH4的產(chǎn)量。富馬酸、蘋果酸、延胡索酸等二羧酸作為丙酸合成的前體物，可充當(dāng)H2的受體與產(chǎn)甲烷菌競爭H2，生成丙酸，從而減少生成CH4的H2。Asanuma等體外試驗研究表明添加富馬酸和延胡索酸能增加丙酸的產(chǎn)量，減少CH4的產(chǎn)量［30］。Bayaru等報道，飼糧中添加2%延胡索酸，單位進(jìn)食量的CH4排放量降低22%［31］。Li等通過體外培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)在含有亞麻油的底物中添加蘋果酸和延胡索酸不但能降低CH4產(chǎn)量，而且cis9、trans11－共軛亞油酸的濃度明顯升高［32］。雖然二羧酸能有效改變H2的利用途徑，同時生成丙酸而降低CH4產(chǎn)量，但反芻動物二羧酸的添加會導(dǎo)致瘤胃pH降低，并且飼糧也影響動物的適口性。為了防止瘤胃發(fā)酵受到影響可以添加這些酸的鈉鹽，或制備成膠囊［33］。富馬酸二鈉鹽可以有效維持瘤胃pH值，同時促進(jìn)瘤胃體外發(fā)酵和山羊體內(nèi)發(fā)酵［34］。Wallace等利用包被的富馬酸產(chǎn)品降低CH4產(chǎn)量而不影響瘤胃發(fā)酵，體外培養(yǎng)時，包被在氫化植物油中的富馬酸能抑制CH4的生成，同時不影響瘤胃pH值。體內(nèi)試驗進(jìn)一步證實包被的富馬酸能降低CH4產(chǎn)量，提高動物生產(chǎn)性能、增加活體增重及飼料轉(zhuǎn)化率［35］。

3.3.3 植物提取物 關(guān)于植物的提取物調(diào)控反芻動物瘤胃發(fā)酵及降低CH4排放是目前廣大學(xué)者研究的熱點。大量體內(nèi)試驗和體外試驗表明植物提取物會影響瘤胃CH4的生成。

反芻動物日糧中添加未皂化的脂肪能間接或直接的抑制CH4生成，間接作用包括降低不飽和脂肪酸雙鍵、降低飼料攝入量、抑制原蟲及增加丙酸產(chǎn)量；直接作用及脂肪酸對產(chǎn)甲烷菌的抑制作用。Mcginn等研究發(fā)現(xiàn)牛日糧中添加向日葵油能降低乙酸濃度提高丙酸濃度，降低乙酸與丙酸的比例［21］。并且油脂對瘤胃CH4生成的抑制作用與飼料組成有關(guān)，Machmueller研究發(fā)現(xiàn)，與粗料相比，在精料中添加椰子油對CH4排放的抑制效果更好［36］。植物提取物包括皂角苷、單寧、精油等對瘤胃CH4產(chǎn)生有顯著的抑制作用［37］。皂苷主要通過對原蟲的抑制作用來調(diào)控反芻動物CH4的產(chǎn)量。單寧對產(chǎn)甲烷菌具有抑制作用及對瘤胃纖維降解具有促進(jìn)作用，故富含縮合單寧的植物能降低綿羊和牛瘤胃CH4生成，日糧中添加縮合單寧能減少山羊CH4的排放［38］。Hu等體外培養(yǎng)使用高劑量的茶皂苷使原蟲數(shù)量下降79%，CH4產(chǎn)量下降26%［23］。

一直以來，科研工作者們一直在不斷的探索尋找能有效降低瘤胃CH4生成的方法。到目前為止，已有較大的研究進(jìn)展，根據(jù)CH4的合成機理，發(fā)現(xiàn)通過很多途徑能抑制并降低CH4的排放，但同時很多研究結(jié)果也多少存在局限性，因而無法應(yīng)用到實際生產(chǎn)當(dāng)中。如甲烷鹵化物可以直接抑制CH4生成，但是由于其生物安全性差或抑制時間較短，不適合在生產(chǎn)實際中使用；乙酸生成菌能與產(chǎn)甲烷菌競爭氫離子，使CH4產(chǎn)量降低，但是由于學(xué)者們分離得到的乙酸生成菌數(shù)量和對其認(rèn)識有限等原因，此方法也無法用于實際操作；去除原蟲可以降低CH4產(chǎn)量，通過減少與原蟲共生的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量來實現(xiàn)，但目前的去原蟲技術(shù)，常常存在對其他瘤胃微生物或動物本身有害，至今還沒有一種能應(yīng)用于實際生產(chǎn)的去原蟲技術(shù)；離子載體型抗生素也能降低CH4的合成，但因其在體內(nèi)殘留問題，在生產(chǎn)當(dāng)中也遭到質(zhì)疑。因此，需要對產(chǎn)甲烷菌和其他微生物的關(guān)系以及CH4的合成機理更加深入的研究了解，利用瘤胃基因組技術(shù)和新的“組學(xué)”技術(shù)，不斷地開發(fā)研究降低瘤胃CH4排放的新方法。

［1］ IPCC（Intergovernmental Panel on Climate Change），Climate Change 2007.The Scientific Basis.Cambridge University Press，Cambridge，UK.2007.

［2］ Wuebbles D J，Hayho E K.Atmospheric methane and global change［J］.Earth Sci Rev，2002，57：177－210.

［3］ Thauer R K.Biochemistry of methanogenesis：a tribute to Marjory Stephenson.1998Mariory Stephenson Prize Lecture［J］.Microbiology，1998，144：2377－2406.

［4］ 喬生民，喬軍毅，譚支良.反芻動物瘤胃甲烷生成機制及調(diào)控措施研究［J］.中國草食動物科學(xué).2014，34（1）：44－48.

［5］ Zhu W Y，Mao S Y，Liu J X，et al.Diversity of methanogens and their interactions with other microorganisms in methanogenesis in the rumen［C］.Plenary Paper，Proceedings of the 7th International Symposium on the Nutrition of Herbivores，2007，pp，125－139.

［6］ 閔航，陳美慈，趙宇華，等.厭氧微生物學(xué)［M］.2006，浙江大學(xué)出版社.

［7］ Morvan B，Bonnemoy F，F(xiàn)onty G，et al.Quantitative determination of H2－utilizing acetogenic and sulfate－reducing bacteria and methanogenic archaea from digestive tract of Different Mammals［J］.Current Microbiology，1996，32（3）：129－133.

［8］ Wo1in M J，Miller T L，Stewart C S.Microbe－microbe interactions［C］.The Rumen Microbial Ecosystem，1997，PP，467－491.

［9］ 馮仰廉.反芻動物營養(yǎng)學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2004.

［10］ Cheng Y F，Edwards J E，Allison G G，et al.Diversity and activity of enriched ruminal Cultures of anaerobic fungi and methanogens grown together on lignocelluloses in consecutive batch culture［J］.Bioresource Technology，2009，100（20）：4821－4828.

［11］ Nakashimada Y，Marwoto B，Kashiwamura T.Enhanced 2，3－butanediol Production by addition of acetic acid in Paenibacillus Polymyxa［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，90（6）：661－664.

［12］ Wood T M，Wilson C A，McCrae S I，Joblin K N.A highly active extracellular cellulase from the aerobic rumen fungus Neocallimastix frontalis［J］.FEMS Microbiology Letters 1986，34（1）：37－40.

［13］ Ushida K，Jouany J.Methane production associated with rumen－ciliated protozoa and its effect on protozoan activity［J］.Letters in Applied Microbiology，1996，23（2）：129－132 .

［14］ Newbold C J，Lassalas B，Jouany J P.The importance of methanogens associated with ciliate protozoa in ruminal methane production in vitro［J］.Letters in Applied Microbiology，1995，21：230－234.

［15］ Schonhusen U，Zitnan R，Jentsch W，et al.Effects of protozoa on methane production in rumen and hindgut of calves aroud time of weaning［J］.Archives of Animal Nutrition，2003，57（4）：279－295.

［16］ Dohme F，Machmuller A，Estermann B L，et al.The role of the rumen ciliate protozoa for methane suppression caused by coconut oil［J］.Letters in Applied Microbiology，1999，29：187－192.

［17］ Krumholz L R，F(xiàn)orsberg C W，Veira D M.Association of methanogenic bacteria with rumen protozoa［J］.Canadian journal of microbiology，1983，29：676－680.

［18］ Machmuller A，Soliva C R，Kreuzer M.Effect of coconut oil and defaunation treatment on methanogenesis in sheep［J］.Reproduction Nutrition Development，2003，43（1）：41－55.

［19］ Ungerfeld E M，Rust S R，Boone D R，et al.Effects of several inhibitors on pure cultures of ruminal methanogens［J］.Journal of applied microbiology，2004，97（3）：520－526.

［20］ 張春梅，施傳信，易賢武，等.添加亞麻酸及植物油對體外瘤胃發(fā)酵和甲烷生成的影響［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，29（2）：193－198.

［21］ MeGinn S M，Beauchemin K A，Coates T，et al.Methane emissions from beef cattle：Effects of monensin，sunfiower oil，enzymes，yeast and fumaric acid［J］.Journal of Animal Science，2004，82（11）：3346－3356.

［22］ Mao H L，Wan J K，Zhou Y Y，et al.Effect of addition of tea saponins and soybean oil on methaneproduction，fermentation and microbial population in the rumen of growing lambs［J］.Livestock science，2010，129：56－62.

［23］ Hu W L，Guo Y Q，Liu J X，et al.Tea saponins affect in vitro fermentation and methanogenesis in faunated and defaunated rumen fluid［J］.J Zhejiang Univ Sci，2005，6（8）：787－792.

［24］ Lopez S，McIntosh F M，Wallace R J，et al.Effect of adding acetogenic bacteria on methane production by mixed rumen microorganisms［J］.Animal Feed Science and Technology，1999，78（1）：1－9.

［25］ Joblin K N.Ruminal acetogens and their potential to lower ruminant methane emissions［J］.Crop and Pasture Science，1999，50（8）：1307－1314.

［26］ Nelson N，Valdes C，Hillman K，et al.Effect of methaneoxidising bacterium isolated from the gut of piglets on methane production in Rusitec［J］.Reproduction Nutrition Development，2000，40：212.

［27］ Kajikawa H，Valdes C，Hillman K，et al.Methane oxidation and its coupled electron‐sink reactions in ruminal fluid［J］.Letters in applied microbiology，2003，36（6）：354－357.

［28］ Van Nevel C，Demeyer D.17Feed additives and other interventions for decreasing methane emissions［J］.Biotechnology in animal feeds and animal feeding，2008：329.

［29］ Guan H，Wittenberg K M，Ominski K H，et al.Efficacy of ionophores in cattle diets for mitigation of enteric methane［J］.Journal of Animal Science，2006，84（7）：1896－1906.

［30］ Asanuma N，Iwamoto M，Hino T.Effect of the addition of fumarate on methane Production by ruminal microorganisms in vitro［J］.J Dai Sci，1999，82（4）：780－787.

［31］ Bayaru E，Kamada T，Andoh S，et al.Effect of fumaric acid on methane production，rumen fermentation and digestibility of cattle fed roughage alone［J］.The Japanese journal of zootechnical science，2001，72（2）：139－146.

［32］ Li X Z，Long R J，Yan C G et al.Rumen microbial responses in fermentation characteristics and production of CLA and methane to linoleic acid in associated with malateor fumarate［J］.AnimalFeed Science and Technology，2010 155：132－139.

［33］ Carro M D，Ranilla M J.Influence of different concentrations of disodium fumarate on methane production and fermentation of concentrate feeds by rumen micro－organisms in vitro［J］.British Journal of Nutrition，2003，90（3）：617－623.

［34］ Mao S Y，Zhang G，Zhu W Y.Effect of disodium fumarate on ruminal metabolism and rumen bacterial communiries in goat as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16Sribosomal DNA［J］.Animal Feed Science and Technology，2008，140：293－306.

［35］ Wallace R J，Wood T A，Rowe A，et al.Encapsulated fumaric acid as a means of decreasing ruminal methane emission［J］.International Congress Series，2006，1293：148－151.

［36］ Machmueller A，Dohme F，Soliva C R，et al.Diet composition affects the level of ruminal methane suppression by medium－chain fatty acids［J］.Aust J Agric Res，2001，52（7）：713－722.

［37］ Kamra D N，Agarwal N，Chaudhary L C.Inhibition of ruminal methanogenesis by tropical plants containing secondary compounds［J］.Int Cong Ser，2006，1293：156－163.

［38］ Puchala R，Min B R，Goetsch A L，et al.The effect of a condensed tannin－containing forage on methane emission by goats［J］.Journal of Animal Science，2005，83（1）：182－186.