重組人紅細(xì)胞生成素對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬線粒體凋亡途徑相關(guān)調(diào)控因子的影響及作用機(jī)制

史志勤，卞紅磊，魏艷靜，尹曉琳，張 榮，梁文杰，劉瑞春，王維平，于江華

?

·論著·

重組人紅細(xì)胞生成素對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬線粒體凋亡途徑相關(guān)調(diào)控因子的影響及作用機(jī)制

史志勤，卞紅磊，魏艷靜，尹曉琳，張 榮，梁文杰，劉瑞春，王維平，于江華

目的 觀察重組人紅細(xì)胞生成素(rHuEPO)對(duì)戊四氮(PTZ)點(diǎn)燃的癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)的成年雄性(SD)大鼠海馬神經(jīng)元磷酸化蛋白激酶B(p-PKB/p-Akt)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和X-連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)表達(dá)的影響，并進(jìn)一步探討rHuEPO作用的可能機(jī)制。方法 于2010年3月，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康清潔級(jí)成年SD大鼠。采用PTZ點(diǎn)燃大鼠SE模型，將大鼠隨機(jī)分為B組(PTZ+0.9%氯化鈉溶液)、C組(PTZ+rHuEPO)、D組(PTZ+LY294002+rHuEPO)、E組(PTZ+二甲基亞砜+rHuEPO)，同時(shí)另選取不進(jìn)行SE制模的SD大鼠作為A組(0.9%氯化鈉溶液)，檢測(cè)大鼠行為學(xué)和腦電圖的改變；用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測(cè)海馬神經(jīng)元的凋亡情況；免疫組織化學(xué)法觀察p-Akt、Bax、XIAP的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)各組大鼠海馬Bax信使RNA(BaxmRNA)的表達(dá)；Western blot方法檢測(cè)各組大鼠海馬蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、XIAP蛋白的表達(dá)。結(jié)果 與B組比較，C組p-Akt、XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和p-Akt、XIAP蛋白表達(dá)水平均增多，Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及BaxmRNA表達(dá)水平均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與C組比較，D組p-Akt、XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和p-Akt、XIAP蛋白表達(dá)水平均減少，Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及BaxmRNA表達(dá)水平均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 rHuEPO可以提高p-Akt、XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)水平，降低Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及BaxmRNA表達(dá)水平，減少海馬神經(jīng)元的凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；加入磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002后，海馬p-Akt、XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及蛋白表達(dá)減少、Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及BaxmRNA表達(dá)增加，海馬神經(jīng)元的凋亡增加，減弱了rHuEPO的保護(hù)作用。因此，PI3K/Akt信號(hào)通路是rHuEPO發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的通路之一，其作用機(jī)制可能是rHuEPO活化PI3K/Akt后，提高p-Akt蛋白及線粒體凋亡途徑相關(guān)調(diào)控因子X(jué)IAP的表達(dá)，下調(diào)了Bax的表達(dá)，從而介導(dǎo)線粒體凋亡途經(jīng)，發(fā)揮抗凋亡、促存活的神經(jīng)保護(hù)作用。

癲癇持續(xù)狀態(tài)；重組人紅細(xì)胞生成素；磷酸肌醇3-激酶類；蛋白激酶類；Bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)；X連鎖凋亡抑制蛋白質(zhì)

史志勤，卞紅磊，魏艷靜，等.重組人紅細(xì)胞生成素對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬線粒體凋亡途徑相關(guān)調(diào)控因子的影響及作用機(jī)制[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(19)：2310-2316.[www.chinagp.net]

Shi ZQ,Bian HL,Wei YJ,et al.Effects and possible mechanism of rHuEPO for the regulatory factors of the mitochondrial-dependent apoptotic pathway in the hippocampus region of statural epilepticus rats[J].Chinese General Practice，2015，18(19)：2310-2316.

Kondratyev等[1]、Covolan等[2]研究證實(shí)，壞死和凋亡是癲癇所致神經(jīng)元死亡的兩種主要形式。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)揭示，線粒體依賴途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依賴途徑、死亡受體依賴途徑是凋亡發(fā)生時(shí)的重要路徑,其中較為主要的是線粒體依賴途徑。Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白、凋亡抑制蛋白家族(IAPs)都是重要的線粒體依賴凋亡途徑的相關(guān)調(diào)控因子。促凋亡成員Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Bad等，和抗凋亡成員Bcl-2、Bcl-xl等都是Bcl-2蛋白家族中非常重要的成員。IAPs家族包括X-連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibtor of apoptosis protein,XIAP)、Survivin、Hiap-1、Livin等。近些年在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究中，促紅細(xì)胞生成素(EPO)的保護(hù)機(jī)制正在逐漸被挖掘，已得到充分肯定的是它的抗凋亡功能。但EPO在癲癇中是怎樣發(fā)揮保護(hù)作用的知之甚少，因此本研究使用戊四氮(pentylenetetrazol,PTZ)點(diǎn)燃成年雄性(Sprague-Dawley,SD)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)模型用以研究重組人紅細(xì)胞生成素(recombinant human EPO，rHuEPO)的抗凋亡作用，并通過(guò)抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase，PI3K)/ 蛋白激酶B(Akt)途徑探討rHuEPO可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 于2010年3月，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康清潔級(jí)成年SD大鼠。實(shí)驗(yàn)起始體質(zhì)量為(220±20)g，環(huán)境溫度為22～25 ℃，12 h光亮/黑暗條件，各組動(dòng)物混合飼養(yǎng)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及器材 PTZ、LY294002(美國(guó)Sigma公司)；rHuEPO(濟(jì)脈欣華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司)；原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)ROCHE公司)；二甲基亞砜(DMSO)、兔抗Akt多克隆抗體、兔抗p-Akt(Thr-308)多克隆抗體、兔抗Bax多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；兔抗XIAP多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；BCA蛋白定量試劑盒(Novagen公司)；TRIzol試劑(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑(Promega公司)，引物(上海生工生物技術(shù)有限公司)。病理圖像分析儀系統(tǒng)(Olympus顯微鏡，病理圖像分析軟件由北京航空航天大學(xué)圖像中心制造)；腦電圖機(jī)(日本Neu-rofax 7314F)；立體定向儀(日本Narishige SR-6N)；PCR儀(Eppendorf)；Western blot遠(yuǎn)紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(Odyssey)；凝膠掃描分析系統(tǒng)(Syngene公司)。

1.3 方法

1.3.1 SE模型制備及實(shí)驗(yàn)分組 健康成年SD大鼠228只，參照文獻(xiàn)[3]的方法建立動(dòng)物模型：PTZ 20 mg/kg大鼠腹腔注射，然后每10 min注射10 mg/kg，直至達(dá)到足夠強(qiáng)度和SE。大鼠驚厥的行為表現(xiàn)采用Racine 6級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅳ、Ⅴ級(jí)發(fā)作即為全身性驚厥大發(fā)作，持續(xù)30 min及以上者為SE。制模過(guò)程中因長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的強(qiáng)直驚厥而死亡或不符合模型要求的大鼠，予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充。篩選補(bǔ)充后獲得合格動(dòng)物140只，隨機(jī)分為4組：B組(PTZ+0.9%氯化鈉溶液)、C組(PTZ+rHuEPO)、D組(PTZ+LY294002+rHuEPO)、E組(PTZ+DMSO+rHuEPO)，每組動(dòng)物35只。同時(shí)另選取35只不進(jìn)行SE制模的健康成年SD大鼠作為A組(0.9%氯化鈉溶液)。

1.3.2 給藥情況 B組：腹腔注射PTZ點(diǎn)燃SE發(fā)作后30 min腹腔注射0.9%氯化鈉溶液；C組：腹腔注射PTZ點(diǎn)燃SE發(fā)作后30 min腹腔注射rHuEPO 5 000 U/kg[4]；D組：LY294002溶于DMSO中，濃度為10 μg/5 μl,給藥體積5 μl，腹腔注射PTZ點(diǎn)燃SE發(fā)作后10 min腦室注射給予5 μl LY294002，SE發(fā)作后30 min腹腔注射rHuEPO 5 000 U/kg；E組：腹腔注射PTZ點(diǎn)燃SE發(fā)作后10 min腦室注射給予5 μl DMSO，SE發(fā)作后30 min腹腔注射rHuEPO 5 000 U/kg；A組：腹腔注射相同體積、次數(shù)的0.9%氯化鈉溶液。

1.3.3 大鼠側(cè)腦室立體定位及注射給藥 根據(jù)George Paxions的圖譜定位，即坐標(biāo)為矢狀縫旁開(kāi)1.5 mm，硬腦膜下3.8 mm，前囟后0.8 mm。PTZ點(diǎn)燃SE發(fā)作后10 min，E組注射5 μl DMSO，D組注射LY294002 5 μl,注射完畢后均留針5 min,拔針緩慢，而后觀察動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)。

1.3.4 大鼠行為學(xué)觀察及腦電圖(EEG)描記

1.3.4.1 大鼠癲癇發(fā)作情況 于腹腔注射藥物后觀察2 h，記錄各組大鼠癲癇發(fā)作情況。

1.3.4.2 EEG描記 每組大鼠選取5只進(jìn)行EEG描記。用10%水合氯醛35 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，然后固定于立體定位儀上，暴露顱骨。采取左右皮質(zhì)，左右海馬4個(gè)電極建立8個(gè)導(dǎo)聯(lián)。皮質(zhì)電極：前囟中點(diǎn)向前2 mm，中線旁開(kāi)2 mm，深2 mm；海馬電極：前囟中點(diǎn)向后3.8 mm，中線旁開(kāi)2.4 mm，深3.8 mm。牙鉆鉆孔，插入電極，用立體定位儀上的電極夾固定，鼻尖為參考電極。設(shè)定紙速30 mm/s,靈敏度20 μV/mm，時(shí)間常數(shù)0.1，濾波15 Hz。待大鼠清醒后開(kāi)始根據(jù)不同的分組進(jìn)行相應(yīng)的EEG描記。

1.3.5 海馬組織學(xué)觀察

1.3.5.1 標(biāo)本制作 每組大鼠選取10只進(jìn)行標(biāo)本制作。大鼠在SE后24 h用10%水合氯醛麻醉，開(kāi)胸后主動(dòng)脈插管,連接自制灌注系統(tǒng)，將右心耳剪開(kāi)后，作為灌注液的流出口。用0.9%氯化鈉溶液約500 ml和4%多聚甲醛500 ml先后灌流固定，開(kāi)顱后取出腦組織，在乳頭體與視交叉處分別垂直橫斷腦組織，把含有海馬的中段腦組織(含腦室注射部位在內(nèi))放置于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃ 24 h。常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋。冠狀位連續(xù)切片,直至切出海馬組織，每片的厚度約為5 μm，分別進(jìn)行原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)染色和免疫組化染色。

1.3.5.2 海馬組織病理學(xué)觀察 (1)TUNEL染色：使用原位凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，將海馬區(qū)凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每一標(biāo)本取3張切片，每張切片在海馬區(qū)取10個(gè)位置不同的視野，將3張切片的平均值作為該標(biāo)本的結(jié)果，將該組10例樣本均值作為該組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(2)免疫組化染色：采用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)法。在切片中分別加p-Akt(Thr-308)、Bax、XIAP等一抗，4 ℃過(guò)夜，然后依次加入生物素標(biāo)記的二抗、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木精復(fù)染。用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。檢測(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元p-Akt、Bax、XIAP蛋白表達(dá)。每一標(biāo)本取3張切片,每張切片在海馬區(qū)隨機(jī)取10個(gè)位置不重復(fù)的視野，分別計(jì)數(shù)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(以斷面上有細(xì)胞核者為準(zhǔn))，取3張切片的均值作為該標(biāo)本結(jié)果，以該組10例樣本均值作為該組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6 RT-PCR檢測(cè) 每組大鼠各取10只，迅速分離海馬，TRIzol提取海馬總RNA，測(cè)定其濃度及純度。每個(gè)樣品取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再各取1 μl cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列，Bax上游：5′-CATCTCCTTCATCCTTGCTG-3′，下游：5′-CCAGCCACAAAGATGGTCACT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為500 bp；β-actin上游：5′-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3′,下游:5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度為375 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)條件為：Bax 95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，59 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸1 min，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min。取RT-PCR產(chǎn)物5 μl行瓊脂糖凝膠電泳，UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描定量電泳條帶的灰度，以Bax/β-actin表示產(chǎn)物的相對(duì)含量，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。半定量結(jié)果重復(fù)分析5次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.7 Western blot檢測(cè) 每組大鼠各取10只，迅速剝離海馬，提取總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白95～98 ℃變性5 min，以非連續(xù)的Tris-SDS聚丙烯酰凝膠垂直平板電泳電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入多克隆兔抗Akt、p-Akt抗體(1∶300，封閉液稀釋)，多克隆兔抗XIAP抗體(1∶200，封閉液稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。四聚丙烯(烷基)苯磺酸鹽(TPBS)漂洗5次×5 min，加入羊抗兔IgG熒光抗體(1∶3 000)室溫孵育1 h，TPBS漂洗4次×10 min，PBS漂洗1次×10 min，熒光掃描成像系統(tǒng)掃描并測(cè)定目標(biāo)帶單位密度，與β-actin(1∶800)單位密度值相比后行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果重復(fù)分析5次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠癲癇發(fā)作情況 接受PTZ注射的大鼠共228只，86只應(yīng)用30 mg/kg、88只應(yīng)用40 mg/kg、54只應(yīng)用50 mg/kg即開(kāi)始出現(xiàn)驚厥，主要表現(xiàn)為肌陣攣。大鼠SE持續(xù)時(shí)間大約為30 min以上。制模過(guò)程中84只因長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的強(qiáng)直驚厥而死亡，死亡率為31.9%，4只不符合模型要求，均予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充。

2.2 EEG變化情況 A組大鼠腦電圖以α、β波為主，散在θ波，無(wú)異常放電表現(xiàn)；B組大鼠陣發(fā)出現(xiàn)大量高幅尖波、棘波、棘慢復(fù)合波、尖慢復(fù)合波；C、D、E組大鼠癇性放電明顯受到抑制，棘波、尖波、棘-慢復(fù)合波、尖-慢復(fù)合波等癇性發(fā)作減少或波幅降低；C、E組較D組癲癇樣放電明顯減少。

2.3 TUNEL染色結(jié)果 光鏡下胞核呈棕黃色表現(xiàn)者為T(mén)UNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。A組可以見(jiàn)到少量的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，其余4組海馬區(qū)亦均有不同程度的凋亡細(xì)胞分布。其中B、C、D、E組凋亡細(xì)胞數(shù)與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C、D、E組凋亡細(xì)胞數(shù)與B組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組凋亡細(xì)胞數(shù)與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而E組凋亡細(xì)胞數(shù)與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；E組凋亡細(xì)胞數(shù)與D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

2.4 免疫組化染色結(jié)果 海馬區(qū)p-Akt、Bax、XIAP蛋白的表達(dá)，即陽(yáng)性細(xì)胞為有棕黃色著色的神經(jīng)元，除了胞核和胞膜有少量陽(yáng)性信號(hào)外，陽(yáng)性信號(hào)主要位于胞質(zhì)中(見(jiàn)圖1、2)。A組神經(jīng)元核膜周圍的胞質(zhì)中，偶然可以見(jiàn)到棕黃色散在顆粒分布；其中B、C、D、E組p-Akt、Bax、XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且有陽(yáng)性信號(hào)也開(kāi)始出現(xiàn)在胞核中；C、D、E組p-Akt、Bax、XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與B組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組p-Akt、Bax、XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而E組p-Akt、Bax、XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；E組p-Akt、Bax、XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

Table 1 Comparison of the number of cells with positive p-Akt,Bax and XIAP and the number of apoptotic cells in the hippocampal area among the five groups

組別只數(shù)凋亡細(xì)胞p-AktBaxXIAPA組10723±1052141±1201932±1601394±151B組102672±353a2657±246a3654±175a1887±265aC組101659±112ab5481±508ab2391±076ab3473±392abD組102108±267abc3307±487abc2932±166abc2517±202abcE組101747±186abd5235±463abd2419±076abd3129±279abdF值1919587822562950P值<001<005<005<005

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05；p-Akt=磷酸化蛋白激酶B；Bax=Bcl-2相關(guān)X蛋白，XIAP=X-連鎖凋亡抑制蛋白

注：A、B、C、D、E分別為A、B、C、D、E組

圖1 5組大鼠海馬區(qū)Bax陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)情況(SP×400)

Figure 1 Expression of the cells with positive Bax in the hippocampal area of the five groups

圖2 5組大鼠海馬區(qū)XIAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(SP×400)

2.5 RT-PCR測(cè)定結(jié)果 大鼠海馬Bax信使RNA(BaxmRNA)表達(dá)情況，A組BaxmRNA有微弱表達(dá)；B、C、D、E組BaxmRNA表達(dá)水平與A組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C、D、E組BaxmRNA表達(dá)水平與B組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組BaxmRNA表達(dá)水平與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而E組BaxmRNA表達(dá)水平與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；E組BaxmRNA表達(dá)水平與D組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

2.6 Western blot結(jié)果 采用Western blot檢測(cè)大鼠海馬組織p-Akt、Akt及XIAP蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，B、C、D、E組p-Akt、XIAP蛋白表達(dá)水平與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C、D、E組p-Akt、XIAP蛋白表達(dá)水平與B組比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組p-Akt、XIAP蛋白表達(dá)水平與C組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而E組p-Akt、XIAP蛋白表達(dá)水平與C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；E組p-Akt、XIAP蛋白表達(dá)水平與D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5組Akt蛋白表達(dá)水平間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見(jiàn)表2)。

Table 2 Comparison of expression levels of BaxmRNA,p-Akt,Akt and XIAP in the hippocampal area among the five groups

組別只數(shù)BaxmRNAp-Akt/β-actinAkt/β-actinXIAP/β-actinA組10035±006040±006104±005036±005B組10088±003a053±004a098±006047±004aC組10050±003ab077±003ab102±005074±003abD組10065±005abc064±001abc100±004058±003abcE組10051±002abd076±003abd101±001071±003abdF值175315700021835P值<001<005>005<005

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05；與D組比較，dP<0.05；BaxmRNA=Bax信使RNA，Akt=蛋白激酶B

3 討論

PTZ是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑中的一種，無(wú)神經(jīng)毒性等副作用，引起的行為及神經(jīng)病理的改變與人類極為相似[5]，本實(shí)驗(yàn)制作的SE模型也采用PTZ點(diǎn)燃的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所呈現(xiàn)出的成功率和發(fā)作形式與國(guó)外的報(bào)道基本相同[6]。

EPO根本無(wú)法透過(guò)血-腦脊液屏障(BBB)是以前一些研究者的觀點(diǎn)，他們認(rèn)為EPO是一種巨大的糖蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很難產(chǎn)生效果[7]。但是現(xiàn)在的許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，EPO是可以透過(guò)BBB的，它是通過(guò)一種特殊的可飽和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)此功能[8-9]。EPO和它的特異性受體在神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均有一定數(shù)量的表達(dá)。EPO是否能通過(guò)BBB也是本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)之初重點(diǎn)考慮的問(wèn)題之一。

有許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EPO是通過(guò)對(duì)PI3K和酪氨酸激酶2(jauns kinase 2,Jak 2)的激活來(lái)引發(fā)Akt的磷酸化,當(dāng)PI3K的85 kd的調(diào)節(jié)亞單位與EPO受體結(jié)合后，110 kd的催化亞單位激活,引起Akt的磷酸化。激活后的Akt通過(guò)對(duì)底物中的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)它的抗凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用[10]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路是一條經(jīng)典的通路，PI3K和Akt是該通路的中心環(huán)節(jié)。該通路在細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、凋亡、分化、血管形成等方面起著重要作用。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，其產(chǎn)物可直接或間接激活A(yù)kt，PI3K途徑通過(guò)激活A(yù)kt來(lái)實(shí)現(xiàn)抵抗凋亡、促進(jìn)神經(jīng)元存活的作用。凋亡蛋白Caspase-9Ser196和BadSer136是被Akt磷酸化的多種分子中的較為重要的成員,Akt主要也是通過(guò)此機(jī)制對(duì)它們誘導(dǎo)凋亡的作用來(lái)進(jìn)行調(diào)控，從而發(fā)揮作用[11]。對(duì)PI3K進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的量化測(cè)量是有一定難度的，因此許多研究，通過(guò)構(gòu)建PI3K某些亞基缺失、基因敲除的動(dòng)物模型或者其抑制劑LY294002和wortmannin來(lái)觀察PI3K的效能。雖然LY294002和wortmannin都是靶向PI3K的催化亞基p110的選擇性、高競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，LY294002比wortmannin更加穩(wěn)定，可信度更高[12]。所以本研究中也將LY294002應(yīng)用其中，這樣就能進(jìn)一步驗(yàn)證rHuEPO是否通過(guò)PI3K/Akt途徑實(shí)現(xiàn)抵抗神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用。

EPO在缺血低氧性腦損傷[13]、脊髓損傷[14]、閉合性腦創(chuàng)傷[15]等不同的體內(nèi)外神經(jīng)損傷模型中都具有抗神經(jīng)元凋亡的作用，但在PTZ點(diǎn)燃的大鼠SE中是否有抗凋亡作用，以及是否通過(guò)了較為主要的PI3K/Akt通路還知之甚少，鑒于此，本研究建立PTZ點(diǎn)燃SE大鼠模型，觀察大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡和p-Akt表達(dá)的變化及rHuEPO的影響，以及應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002，用以觀察rHuEPO是否通過(guò)PI3K/Akt途徑發(fā)揮抗凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，PTZ致SE大鼠EEG中，呈現(xiàn)出癲癇樣放電的表現(xiàn)。海馬神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的出現(xiàn)，使海馬神經(jīng)元內(nèi)p-Akt的表達(dá)升高；使用rHuEPO可明顯降低癲癇樣放電的發(fā)生、減少神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量、p-Akt在海馬神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)也被明顯提升，充分顯示了rHuEPO抵抗凋亡的效用。rHuEPO使用前給予LY294002對(duì)PI3K進(jìn)行干預(yù)，p-Akt的表達(dá)呈現(xiàn)減少的狀態(tài)，海馬神經(jīng)元的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞增加，更加有力地說(shuō)明rHuEPO能夠激活重要的PI3K/Akt路徑，這與Akt的活性被其提高密切相關(guān)，從而發(fā)揮抵抗凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元存活的保護(hù)作用。與Kilic等[16]在局灶性腦缺血的研究中所呈現(xiàn)的結(jié)果相一致。

Bax大多數(shù)存在于胞質(zhì)中，當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)傳達(dá)到細(xì)胞后,Bax的N末端在結(jié)構(gòu)上發(fā)生突變現(xiàn)象，這樣使得它無(wú)法定位于線粒體外膜,從而失去其凋亡調(diào)控功能。Bax從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體膜上從而啟動(dòng)了線粒體介導(dǎo)的凋亡路徑[17]。在哺乳動(dòng)物身上被克隆出來(lái)的IAPs家族成員中，XIAP是最早被發(fā)現(xiàn)的，抗凋亡能力最強(qiáng)的成員之一[18-19]。Dan等[20]研究發(fā)現(xiàn)，Akt可以磷酸化XIAP的Ser87位點(diǎn)，Akt磷酸化XIAP后，一方面可以保護(hù)XIAP不被泛素化和降解，另一方面XIAP的自動(dòng)泛素化也可以被Akt抑制，這樣就能增強(qiáng)XIAP的穩(wěn)定性和它的細(xì)胞內(nèi)水平，從而達(dá)到幫助細(xì)胞生存，抵制凋亡發(fā)生的功效。在線粒體凋亡途徑中,IAPs有3種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制凋亡的作用，分別為：直接與pro-Caspase-9作用干擾其加工過(guò)程；IAPs的CARD區(qū)與Apaf-1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻斷Caspase活化；直接抑制活化的Caspase[21]，通過(guò)以上方式來(lái)調(diào)節(jié)Bax/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑[22-23]。因此Bax、XIAP都是線粒體凋亡途徑的重要相關(guān)調(diào)控因子。所以，本研究把Bax、XIAP作為重要的觀察指標(biāo)，借以來(lái)了解大鼠海馬Bax及XIAP表達(dá)的變化以及rHuEPO對(duì)它們的影響，更深入地去研究rHuEPO對(duì)線粒體相關(guān)調(diào)控因子Bax和XIAP進(jìn)行調(diào)控所顯現(xiàn)的抵抗神經(jīng)元凋亡的作用是否通過(guò)了PI3K/Akt途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，在PTZ點(diǎn)燃SE后激活了海馬神經(jīng)元中促凋亡蛋白Bax、BaxmRNA的表達(dá)以及抗凋亡蛋白XIAP的表達(dá)，給予rHuEPO干預(yù)后，Bax及BaxmRNA的表達(dá)下降，XIAP蛋白的表達(dá)增加。提示rHuEPO對(duì)Bax以及XIAP的表達(dá)有一定的調(diào)控作用。

因?yàn)?EPO 也能夠通過(guò)其他的信號(hào)路徑來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能，因此該實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002更深入地去研究rHuEPO對(duì)Bax和XIAP進(jìn)行調(diào)控所顯現(xiàn)的抵抗神經(jīng)元凋亡的作用是否通過(guò)了PI3K/Akt途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為加入LY294002后，海馬神經(jīng)元內(nèi)Bax及BaxmRNA的表達(dá)明顯增加，XIAP蛋白的表達(dá)明顯下降。這些都更有力地驗(yàn)證了rHuEPO通過(guò)PI3K/Akt途徑對(duì)線粒體凋亡途經(jīng)的相關(guān)調(diào)控因子進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而介導(dǎo)線粒體凋亡途經(jīng)，發(fā)揮抗凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。rHuEPO對(duì)Bax和XIAP進(jìn)行調(diào)控所顯現(xiàn)的抵抗神經(jīng)元凋亡的作用通過(guò)了PI3K/Akt途徑，介入到線粒體凋亡途徑中來(lái)才得以實(shí)現(xiàn)的。

而且，在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)B組與D組進(jìn)行比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，揭示rHuEPO在給予LY294002干預(yù)后，仍有部分保護(hù)作用，這其中的機(jī)制也許是EPO通過(guò)PI3K/Akt途徑之外的其他途徑，如JAK/ STAT[24]信號(hào)途徑、NF-κB[25]途徑、PKC途徑來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，同時(shí)Akt活化后是通過(guò)Akt-IIK-NFκB-XIAP途徑還是通過(guò)直接磷酸化XIAP的Ser87位點(diǎn)，又或是通過(guò)Caspase-9和第二個(gè)線粒體源性caspase激活劑(second mitochondrial derived activator of caspase,Smac/DIABLO)在XIAP顯現(xiàn)效能時(shí)起到了重要的調(diào)整作用，這些問(wèn)題在本實(shí)驗(yàn)中尚未闡述。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的“cross-talk(交談)”效應(yīng)紛繁復(fù)雜，這就需要進(jìn)一步的擴(kuò)大樣本量，尋求多位點(diǎn)觀察，以便掌握其更精細(xì)的調(diào)控機(jī)制，這些都需要在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究中逐步完善，以期為神經(jīng)系統(tǒng)乃至各個(gè)系統(tǒng)的臨床應(yīng)用提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]Kondratyev A,Gale K.Temporal and spatial patterns of DNA fragmentation following focally or systemically-evoked status epilepticus in rats[J].Neurosci Lett,2001,310(1):13-16.

[2]Covolan L,Smith RL,Mello LE.Ultrastructural identification of dentate granule cell death from pilocarpine-induced seizures[J].Epilepsy Res,2000,41(1):9-21.

[3]Motte JE,da Silva Fernandes MJ,Marescaux C,et al.Effects of pentylenetetrazol induced status epilepticus on c-Fos and HSP72 immunoreactivity in the immature rat brain [J].Brain Res Mol Brain Res,1997,50(1/2):79-84.

[4]Nadam J,Navarro F,Sanchez P,et al.Neuroprotective effects of erythropoietin in the rat hippocampus after pilocarpine-induced status epilepticus [J].Neurobiol Dis,2007,25(2):412-426.

[5]Qu H,Eloqayli H,Sonnewald U.Pentylenetetrazole affects metabolism of astrocytes in culture [J].J Neurosci Res,2005,79(1/2):48-54.

[6]Biggan SL,Beninger RJ,Cockhill J,et al.Quisqualate lesions of rat NBM:selective effects on working memory in a double Y-maze[J].Brain Res Bull,1991,26(4):613-616

[7]Meng XD,Chen JP.Neuroprotective role of erythropoietin in central nervous system hypoxia/ischemia[J].Chinese Journal of Neuroscience，2003,19(1)：63-67.(in Chinese) 孟憲棟，陳俊拋.促紅細(xì)胞生成素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺氧/缺血時(shí)的保護(hù)作用[J].中國(guó)神經(jīng)科學(xué)雜志，2003,19(1)：63-67.

[8]Brines ML,Ghezzi P,Keenan S,et al.Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(19):10526-10531.

[9]Siren AL,Knerlich F,Poser W,et al.Erythropoietin and erythropoietin receptor in human ischemic/hypoxic brain[J].Acta Neuropathol,2001,101(3):271-276.

[10]Sun ZK,Chen SD.Erythropoietin and neuron apoptosis:signal pathway[J].Chinese Pharmacological Bulletin,2006,22(12)：1429-1432.(in Chinese) 孫志坤，陳生弟.促紅細(xì)胞生成素抗神經(jīng)元凋亡的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2006,22(12)：1429-1432.

[11]Datta SR,Dudek H,Tao X,et al.Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery[J].Cell,1997,91(2):231-241.

[12]Harris CJ,Brater DC.Renal effects of cyclooxygenase-2 selective inhibitors[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2001,10(5):603-610.

[13]郁俊德.神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的保護(hù)作用研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2010，18(10)：1392.

[14]Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation:II Motor seizure[J].Electroencephaloqr Clin Neurophysiol,1972,32(3):281-294.

[15]Conrad CD,Lupien SJ,Thanasoulis LC,et al.The effects of type I and type II corticosteroid receptor agonists on exploratory behavior and spatial memory in the Y-maze[J].Brain Res,1997,759(1):76-83.

[16]Kilic E,Kilic U,Soliz J,et al.Brain-derived erythropoietin protects from focal cerebral ischemia by dual activation of ERK-1 /-2 and Akt pathways[J].FASEB J,2005,19(14):2026-2028.

[17]Antonsson B.Bax and other pro-apoptotic Bcl-2 family"killer-proteins" and their victim the mitochondrion[J].Cell Tissue Res,2001,306(3):341-361.

[18]Vaux DL，Silke J.Mammalian mitochondrial IAP binding proteins[J].Biochem Biophys Res Commun，2003，304(3)：499-504.

[19]Salvesen GS,Duckett CS.IAP proteins:blocking the road to death′s door[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2002,3(6):401-410.

[20]Dan HC,Sun M,Kaneko S,et al.Akt phosphorylation and stabilization of X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP) [J].J Biol Chem,2004,279(7):5405-5412.

[21]Deveraux QL,Roy N,Stennicke HR,et al.IAPs block apoptotic events induced by caspase-8 and cytochrome c by direct inhibition of distinct caspase[J].EMBO J,1998,17(8):2215-2223.

[22]Sun C,Cai M,Meadows RP,et al.NMR structure and mutagenesis of the third Bir domain of the inhibitor of apoptosis protein XIAP[J].J Biol Chem,2000,275(43):33777-33781.

[23]Holcik M,Korneluk RG.XIAP,the guardian angel[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2(7):550-556.

[24]Rafiee P,Shi Y,Su J,et al.Erythropoietin protects the infant heart against ischemia-reperfusion injury by triggering multiple signaling pathways[J].Basic Res Cardiol,2005,100(3):187-197.

[25]Xu B,Dong GH,Liu H,et al.Recombinant human erythropoietin pretreatment attenuates myocardial infarct size:a possible mechanism involves heat shock protein 70 and attenuation of nuclear factor-kappa B[J].Ann Clin Lab Sci,2005,35(2):161-168.

(本文編輯：崔沙沙)

·全科醫(yī)生知識(shí)窗·

標(biāo)準(zhǔn)·方案·指南

——《CVD合并糖尿病OAD應(yīng)用專家共識(shí)》解讀

共識(shí)建議，成人具有下列任何一項(xiàng)及以上危險(xiǎn)因素，可被定義為糖尿病高危人群，應(yīng)進(jìn)行糖尿病篩查：有糖調(diào)節(jié)受損史；年齡≥40歲；超重(BMI≥24 kg/m2)或肥胖(BMI≥28 kg/m2)和/或向心性肥胖(男性腰圍≥90 cm,女性腰圍≥85 cm)；2型糖尿病患者的一級(jí)親屬；高血壓〔血壓≥140/90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)〕或正在接受降壓治療；血脂異?；蛘邮苷{(diào)脂治療；動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患者及其他因素等。篩查措施包括空腹血糖(FPG)、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和糖化血紅蛋白(HbA1c)檢測(cè)等。

共識(shí)建議，糖尿病血糖控制可根據(jù)自我血糖監(jiān)測(cè)(SMBG)的結(jié)果和HbA1c綜合判斷。血糖控制目標(biāo)為：HbA1c<7.0%，F(xiàn)PG<7.0 mmol/L，餐后2 h血糖(2 hPG)<10 mmol/L；糖尿病病史較短、預(yù)期壽命較長(zhǎng)、無(wú)并發(fā)癥的患者，在不發(fā)生低血糖的情況下可考慮將HbA1c控制在<6.5%，否則可放寬血糖目標(biāo)值至<7.5%～8.0%；慢性疾病終末期患者的HbA1c可放寬至<8.5%。

共識(shí)列出了目前常見(jiàn)的心內(nèi)科臨床應(yīng)用的各種口服降糖藥物(OAD)包括：雙胍類、磺脲類胰島素促泌劑、格列奈類胰島素促泌劑、α-糖苷酶抑制劑、二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑和噻唑烷二酮類等。除一線用藥外，共識(shí)還推薦了聯(lián)合用藥方案。指出如果起始HbA1c≥9.0%或生活方式干預(yù)聯(lián)合一線OAD單藥治療3個(gè)月不能使血糖達(dá)標(biāo)，需聯(lián)合OAD治療；若兩種OAD聯(lián)合治療3個(gè)月不能使患者血糖達(dá)標(biāo)，可考慮聯(lián)合第3種OAD，或者聯(lián)合胰島素或胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動(dòng)劑治療。共識(shí)強(qiáng)調(diào)，選擇聯(lián)合用藥方案應(yīng)根據(jù)患者的情況。歐洲心臟病學(xué)會(huì)(ESC)/歐洲糖尿病研究學(xué)會(huì)(EASD)糖尿病、糖尿病前期和心血管疾病指南也指出，應(yīng)根據(jù)糖代謝異常的特點(diǎn)選擇降糖藥物。

(摘自《中國(guó)醫(yī)學(xué)論壇報(bào)》)

Effects of rHuEPO on the Regulatory Factors Related With the Apoptosis Pathway of Hippocampal Mitochondria in Rats With Status Epilepticus and the Possible Mechanism

SHIZhi-qin,BIANHong-lei,WEIYan-jing,etal.

HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

Objective To observe the effect of recombinant human erythropoietin(rHuEPO) on the expression levels of p-PKB/p-Akt,Bax and XIAP in hippocampal neurons of male mature SD rats with pentylenetetrazol(PTZ) induced status epilepticus(SE),and to further investigate the possible mechanism.Methods The included male mature rats of clean grade were provided by Laboratory Animal Center of Hebei Province in March 2010.By using the PTZ kindling epileptic rat SE model,the SD rats were divided into four groups:group B(PTZ+0.9% sodium chloride solution),group C (PTZ+rHuEPO)，group D (PTZ+LY294002+rHuEPO)and group E(PTZ+dimethyl sulfoxide+rHuEPO).Meanwhile, we assigned SD rats without SE model building into group A(0.9% sodium chloride solution).The behavioral and EEG changes were detected;TUNEL was used to check the apoptosis status of hippocampal neurons;immunohistochemistry was used to observe the number of cells with positive p-Akt,Bax and XIAP;the RT-PCR method was used to detect the expression level of BaxmRNA in hippocampus;Western blot method was employed to detect the protein expression levels of Akt,p-Akt and XIAP.Results Compared with group B,group C was higher(P<0.05) in the number of cells with positive p-Akt and XIAP,the protein expression levels of p-Akt and XIAP and was lower in the number of cells with positive Bax and the protein expression level of BaxmRNA.Compared with group C,group D was lower in the number of cells with positive p-Akt and XIAP and the protein expression levels of p-Akta and XIAP and was higher(P<0.05) in the number of positive cells with positive Bax and the expression level of BaxmRNA.Conclusion rHuEPO can increase the number of cells with positive p-Akt and XIAP and the protein expression of p-Akt and XIAP.It can also decrease the number of cells with positive Bax and the expression level of BaxmRNA,reduce the apoptosis of hippocampal neurons,and has a neuroprotective effect.When PI3K inhibitor LY294002 is added,the number of cells with positive p-Akt and XIAP and the protein expression of p-Akt and XIAP decrease,the number of cells with positive Bax and the expression of BaxmRNA increase,the apoptosis of hippocampal neurons increases,and the neuroprotective effect of rHuEPO is weakened.Therefore,the signal path of PI3K/Akt may be one of the neuroprotective ways of rHuEPO.The possible mechanism may be that rHuEPO activating the PI3K/Akt increases the expression levels of p-Akt and XIAP,decreases the expression level of Bax,thus mediating the path of mitochondrial apoptosis and playing a neuroprotective role of anti-apoptosis and survival promotion.

Status epilepticus;Recombinant human erythropoietin;Phosphatidylinositol 3-kinases;Protein kinases；Bcl-2-associated X protein；X-linked inhibitor of apoptosis protein

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2007000852)

050000河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)(史志勤，魏艷靜，尹曉琳，張榮)；河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院肛腸科(卞紅磊)；河北省中醫(yī)院(梁文杰)；河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(劉瑞春，王維平,于江華)

于江華，050000河北省石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；E-mail:1668834810@qq.com

R 349.53

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.19.016

2015-03-02；

2015-05-25)