荔枝核的化學(xué)成分及生物活性研究

任嘉佳，楊 興，吳石麗，張志畢，李寶晶，李艷平，何紅平，左愛學(xué)*，董發(fā)武*

荔枝核的化學(xué)成分及生物活性研究

任嘉佳1，楊 興1，吳石麗1，張志畢2，李寶晶1，李艷平1，何紅平1，左愛學(xué)1*，董發(fā)武1*

1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室，云南 昆明 650500 2. 昆明醫(yī)科大學(xué) 云南省干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)重點實驗室&生物醫(yī)學(xué)工程研究中心，云南 昆明 650500

研究荔枝核正丁醇部位的化學(xué)成分及生物活性。利用硅膠、D101大孔樹脂、MCI、ODS、Sephadex LH-20及半制備型高效液相等色譜技術(shù)進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)鑒定化合物結(jié)構(gòu)；采用Griess法測定化合物對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生一氧化氮（NO）的抑制活性；采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）方法測定化合物的體外抗氧化活性。從荔枝核正丁醇部位分離得到15個化合物，分別鑒定為柚皮素-7(2,6-二α--鼠李糖基)-β吡喃葡萄糖苷（1）、litchioside D（2）、異鼠李素-3(2,6-二α--鼠李糖基)-β吡喃葡萄糖苷（3）、山柰酚-3(6啡?；?-β-葡萄糖基-(1→3)-α-鼠李糖-7α-鼠李糖苷（4）、5β葡萄糖苷茉莉酮酸甲酯（5）、5β葡萄糖苷茉莉酮酸丁酯（6）、5β葡萄糖苷茉莉酮酸（7）、松脂素-4β葡萄糖苷（8）、表松脂素-4β葡萄糖苷（9）、pyrafortunoside A（10）、苯乙基蕓香苷（11）、苯甲醇β吡喃葡萄糖苷（12）、methyl-1-(βribofuranosyl)-imidazolin-2-one-4-carboxylate（13）、莽草酸甲酯（14）和莽草酸（15）。體外抗炎活性結(jié)果表明，化合物13能明顯抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO釋放，其半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）為（27.9±2.8）μmol/L；化合物15具有一定的抑制活性，其IC50為（62.4±9.7）μmol/L。體外抗氧化活性結(jié)果表明，化合物4對DPPH自由基具有一定的清除活性，其IC50為（109.8±1.5）μmol/L?；衔?、3～6、9～15為首次從荔枝核中分離得到?；衔?3有較強體外抗炎活性，化合物15有一定的體外抗炎活性?；衔?具有一定的體外抗氧化活性。

荔枝核；苷類；抗炎活性；抗氧化活性；山柰酚-3(6啡酰基)-β-葡萄糖基-(1→3)-α-鼠李糖-7α-鼠李糖苷；表松脂素-4β葡萄糖苷；莽草酸

荔枝核為無患子科（Sapindaceae）荔枝屬植物荔枝Soon的干燥成熟種子，又名荔仁、大荔核、荔核、枝核等，其資源豐富，主產(chǎn)于我國華南和西南等地，以廣東和福建南部、臺灣出產(chǎn)較多[1]。荔枝除了具有較高食用價值和經(jīng)濟價值外，其副產(chǎn)物荔枝核還具有較高的藥用價值。荔枝核為傳統(tǒng)中藥材，歷版《中國藥典》均有記載，其性溫，味甘、微苦，歸肝、腎經(jīng)，有行氣散結(jié)、祛寒止痛等功效，用于治療寒疝腹痛、睪丸腫痛等[2]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，包括化學(xué)成分、藥理活性、臨床應(yīng)用、保健功效等方面。其中，化學(xué)成分研究表明，荔枝核主要含有黃酮類、三萜、木脂素、倍半萜以及碳水化合物等[3-10]?，F(xiàn)代藥理活性研究表明，荔枝核具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、調(diào)血脂等多方面活性[11-14]。為更深入研究并揭示荔枝核的活性成分，為臨床藥用和開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。本實驗對荔枝核正丁醇進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從中分離得到15個化合物，分別鑒定為柚皮素-7(2,6-二α--鼠李糖基)-β吡喃葡萄糖苷[naringenin-7-O-(2′′,6′′-di--α-- rhamnopyranosyl)-β--glucopyranoside，1]、litchioside D（2）、異鼠李素-3(2,6-二α--鼠李糖基)-β吡喃葡萄糖苷[isorhamnetin-3(2,6- diα--rhamnopyranosyl)-βglucopyranoside，3]、山柰酚-3(6啡?；?-β-葡萄糖基-(1→3)-α-鼠李糖-7α-鼠李糖苷[kaempferol-3[(6-caffeoyl)- β-glucopyranosyl(1→3)-α-rhamnopyranoside]-7α- rhamnopyranoside，4]、5β葡萄糖苷茉莉酮酸甲酯（5βglucopyranosyloxyjasmonic methyl ester，5）、5β葡萄糖苷茉莉酮酸丁酯（5βglucopyranosyloxyjasmonic butyl ester，6）、5β葡萄糖苷茉莉酮酸（5βglucopyra- nosyloxyjasmonic acid，7）、松脂素-4β葡萄糖苷（pinoresinol-4βglucopyranoside，8）、表松脂素-4β葡萄糖苷（epipinoresinol-4βglucopyranoside，9）、pyrafortunoside A（10）、苯乙基蕓香苷（phenylethyl-rutinoside，11）、苯甲醇β吡喃葡萄糖苷（benzyl alcoholβglucopyranoside，12）、methyl-1-(βribofuranosyl)- imidazolin-2-one-4-carboxylate（13）、莽草酸甲酯（methyl shikimate，14）、莽草酸（shikimic acid，15）?；衔?、3～6、9～15為首次從荔枝核中分離得到。通過脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7作為抗炎模型，對所得化合物進(jìn)行體外抗炎活性研究，結(jié)果表明，化合物13對NO釋放具有較強抑制活性，其半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）為（27.9±2.8）μmol/L，化合物15也顯示出一定的抑制活性，其IC50為（62.4±9.7）μmol/L；抗氧化活性結(jié)果表明，化合物4具有一定的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基清除活性，其IC50為（109.8±1.5）μmol/L。

1 材料與儀器

Bruker Avance III 400 MHz、Bruker DRX 500 MHz、Bruker Avance III 600 MHz超導(dǎo)核磁共振儀（德國Bruker公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；C18半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，美國Agilent公司）；色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工廠）；GF254薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；LH-20羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20，美國Pharmacia公司）；MCI樹脂（日本三菱化學(xué)公司）；反相C18柱色譜材料（ODS，德國Merck公司）；D101大孔吸附樹脂（天津市大鈞科技有限公司）；薄層色譜顯色劑（10%硫酸乙醇溶液）；甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、石油醚等試劑為重蒸的工業(yè)或化學(xué)純?nèi)軇?；色譜甲醇（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?；Synergy2多功能酶標(biāo)儀（美國BIOTEK）；HP80型細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國Eppendorf公司）；LPS、NO檢測試劑盒、-單甲基精氨酸（-NMMA，碧云天生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）；青霉素/鏈霉素雙抗、胰酶（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；維生素C片（廣東恒健制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H44021171，批號201001）。

荔枝核藥材于2017年9月購自新螺螄灣藥材市場，產(chǎn)自廣西，由云南中醫(yī)藥大學(xué)李宏哲副教授鑒定為無患子科植物荔枝Sonn的干燥成熟種子，標(biāo)本保存于云南省高校民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室（D2017-001）。

2 提取與分離

荔枝核干燥樣品30 kg，粉碎后用85%的乙醇回流提取3次，合并得5.2 L提取液，減壓濃縮得浸膏3.4 kg。浸膏加水混懸用石油醚萃取3次，然后依次用醋酸乙酯和正丁醇萃取6次，減壓濃縮得到石油醚部位（729.7 g）、醋酸乙酯部位（522.9 g）、正丁醇部位（558.6 g）和水部位（1 665.4 g）。將正丁醇部位（558.6 g）過D101大孔樹脂以（30%、50%、70%和90%）乙醇-水梯度洗脫，得6個粗分段（Fr. 1～6）。Fr. 1（120.8 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇（40∶1～1∶1）梯度洗脫，得到6個流分（Fr. 1.1～1.6）。Fr. 1.2（10.2 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇（30∶1～0∶1）梯度洗脫，得到5個流分（Fr. 1.2.1～1.2.5）。Fr. 1.2.2（4.8 g）經(jīng)MCI柱色譜以甲醇-水（10∶90～100∶0）梯度洗脫，到6個流分（Fr. 1.2.2.1～1.2.2.6）。Fr. 1.2.2.5（130.8 mg）經(jīng)半制備液相［乙腈-水（8∶92）］分離純化，得化合物14（20.8 mg，R＝8 min）。Fr. 1.2.2.6（903.6 mg）經(jīng)硅膠柱色譜以三氯甲烷-甲醇（20∶1～0∶1）梯度洗脫得化合物15（228 mg）。Fr. 1.5（17.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜以三氯甲烷-甲醇（20∶1～0∶1），重結(jié)晶得到化合物13（120 mg）。Fr.2（47.0 g）過D101大孔樹脂以（30%、50%、70%和90%乙醇）洗脫，得7個流分（Fr. 2.1～2.7），F(xiàn)r. 2.3（27.5 g）經(jīng)硅膠柱色譜，以三氯甲烷-甲醇（20∶1～0∶1）洗脫，得5個流分（Fr. 2.3.1～2.3.5），F(xiàn)r. 2.3.2（757.3 mg）經(jīng)反相ODS柱色譜，以甲醇-水（10∶90～100∶0）梯度洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20色譜（甲醇）進(jìn)行純化，得到化合物5（32.4 mg），F(xiàn)r. 2.3.4（2.8 g）經(jīng)反相ODS柱色譜，以甲醇-水（10∶90～100∶0）洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20色譜，以三氯甲烷-甲醇（1∶1）純化，得到化合物10（9 mg）。Fr. 4（135.8 g）經(jīng)硅膠柱色譜以三氯甲烷-甲醇（20∶1～0∶1）洗脫，得到9個流分（Fr. 4.1～4.9），F(xiàn)r. 4.5（1.2 g）經(jīng)反相ODS柱色譜以甲醇-水（10∶90～100∶0）分離，經(jīng)Sephadex LH-20色譜（甲醇）后，得到化合物7（60.8 mg），經(jīng)半制備液相［乙腈-水（12∶88）］分離純化得到化合物11（38.2 mg，R＝27 min），經(jīng)半制備液相［乙腈-水（17∶83）］分離純化得到化合物8（10.6 mg，R＝2 min）和9（1.8 mg，R＝8 min）。Fr. 4.8經(jīng)半制備液相［乙腈-水（21∶79）］分離純化得到化合物1（70.8 mg，R＝21 min）、3（3.7 mg，R＝10 min），經(jīng)半制備液相［乙腈-水（17∶83）］分離純化得到化合物4（10.8 mg，R＝26 min）。Fr. 5（52.1 g）經(jīng)硅膠柱色譜以三氯甲烷-甲醇（20∶1～0∶1）洗脫，得到5個流分（Fr. 5.1～5.5），F(xiàn)r. 5.2經(jīng)反相ODS柱色譜以甲醇-水（10∶90～100∶0），Sephadex LH-20色譜（甲醇）純化后，得到化合物6（6 mg）和12（2.7 mg）。Fr. 5.4經(jīng)反相ODS柱色譜以甲醇-水（10∶90～100∶0），Sephadex LH-20色譜（甲醇）純化后，得到化合物2（42.9 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色無定形粉末，分子式為C33H42O18，/: 725 [M－H]?。1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.25 (2H, dd,= 8.6, 1.5 Hz, H-2, 6), 6.78 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3, 5), 6.13 (1H, d,= 1.7 Hz, H-8), 6.07 (1H, d,= 1.8 Hz, H-6), 5.29 (1H, ddd,= 12.8, 7.2, 3.0 Hz, H-2), 5.22 (1H, t,= 3.5 Hz, H-1), 5.05 (1H, dd,= 7.7, 5.1 Hz, H-1), 4.67 (1H, brs, H-1), 1.16 (3H, d,= 6.7 Hz, H-6), 1.13 (3H, d,= 6.7 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 198.4 (C-4), 166.4 (C-7), 164.9 (C-9), 164.3 (C-5), 158.9 (C-4), 130.7 (C-1), 129.1 (C-2, 6), 116.4 (C-3, 5), 105.0 (C-10), 102.1 (C-1), 102.0 (C-1), 99.6 (C-1), 97.8 (C-6), 96.9 (C-8), 80.5 (C-2), 80.4 (C-2), 78.3 (C-5), 76.9 (C-3), 74.0 (C-4), 73.5 (C-4), 72.3 (C-2), 71.9 (C-2), 71.6 (C-4), 71.0 (C- 3), 70.4 (C- 3), 69.7 (C-5), 68.0 (C-5), 67.3 (C-6), 43.8 (C-3), 17.9 (C-6), 16.8 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[15]，故鑒定化合物1為柚皮素- 7(2,6-二α--鼠李糖基)-β吡喃葡萄糖苷。

化合物2：黃色無定形粉末，分子式為C33H42O17，/709 [M－H]?。1H-NMR (400 MHz, DMSO-6): 12.0 (1H, brs, OH-5), 7.47 (2H, d,= 7.3 Hz, H-2, 6), 7.38 (2H, t,= 7.3 Hz, H-3, 5), 7.33 (1H, m, H-4), 6.08 (1H, d,= 2.4 Hz, H-8), 6.06 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 5.60 (1H, dd,= 12.6, 3.2 Hz, H-2), 5.10 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1), 5.02 (1H, d,= 3.5 Hz, H-1), 4.57 (1H, brs, H-1), 3.84 (1H, d,= 6.9 Hz, H-5), 3.73 (1H, d,= 11.1 Hz, H-6), 3.13 (1H, d,= 15.1 Hz, H-3a), 3.15 (1H, m, H-4), 2.79 (1H, dd,= 17.2, 3.3 Hz, H-3b), 1.02 (3H, d,= 6.5 Hz, H-6), 0.97 (3H, d,= 6.4 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-6): 196.8 (C-4), 164.9 (C-7), 163.0 (C-9), 162.5 (C-5), 138.4 (C-1), 128.7 (C-4), 128.6 (C-3, 5), 126.8 (C-2, 6), 103.5 (C-10), 100.7 (C-1), 100.6 (C-1), 97.6 (C-1), 96.5 (C-6), 95.3 (C-8), 79.8 (C-2), 78.5 (C-2), 76.5 (C-3), 75.5 (C-5), 72.1 (C-4), 71.7 (C-4), 70.7 (C- 3), 70.3 (C-2), 69.7 (C- 3), 69.3 (C-4), 68.6 (C-2), 68.4 (C-5), 66.4 (C-5), 65.9 (C-6), 42.1 (C-3), 17.9 (C-6), 16.5 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[16]，故鑒定化合物2為litchioside D。

化合物3：黃色無定形粉末，分子式為C34H42O20，ESI-MS/769 [M－H]?，1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.71 (1H, dd,= 8.6, 2.2 Hz, H-6), 7.59 (1H, d,= 2.2 Hz, H-2), 7.04 (1H, d,= 8.6 Hz, H-5), 6.37 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 6.18 (1H, d,= 2.1Hz, H-6), 5.62 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1), 5.21 (1H, d,= 1.7 Hz, H-1), 4.50 (1H, d,= 1.7 Hz, H-1), 3.93 (3H, s, 4-OCH3), 1.05 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6), 0.95 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 179.3 (C-4), 165.7 (C-7), 163.2 (C-5), 158.6 (C-9), 158.4 (C-2), 151.4 (C-3), 147.1 (C-4), 134.7 (C-3), 124.6 (C-6), 123.2 (C-1), 117.0 (C-5), 111.9 (C-2), 105.9 (C-10), 102.6 (C-1), 102.2 (C-1), 100.5 (C-1), 99.8 (C-6), 94.7 (C-8), 79.8 (C-2), 78.9 (C-5), 77.1 (C-3), 74.0 (C-4), 73.8 (C-4), 72.4 (C- 3), 72.3 (C- 3), 72.2 (C-2), 72.1 (C-2), 71.8 (C-4), 69.9 (C-5), 69.7 (C-5), 68.2 (C-6), 56.4 (4-OCH3), 17.8 (C-6), 17.5 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[16]，故鑒定化合物3為異鼠李素-3(2,6-二α--鼠李糖基)-β吡喃葡萄糖苷。

化合物4：黃色無定形粉末，分子式為C42H46O22，ESI-MS/: 901 [M－H]?，1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.50 (1H, d,= 15.9 Hz, H-7), 7.37 (1H, d,= 2.1 Hz, H-2), 7.32 (1H, dd,= 8.3, 2.1 Hz, H-6), 7.06 (1H, d,= 8.3 Hz, H-5), 7.06 (1H, d,= 8.3 Hz, H-3), 6.92 (1H, d,= 8.3 Hz, H-6), 6.56 (1H, d,= 2.3 Hz, H-2), 6.39 (1H, s, H-8), 6.37 (1H, d,= 2.1 Hz, H-6), 6.20 (1H, d,= 15.9 Hz, H-8), 5.56 (1H, brs, H-1), 5.54 (1H, d,= 1.7 Hz, H-1), 4.51 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1), 4.34 (1H, d,= 2.4 Hz, H-2), 4.05 (1H, s, H-2), 1.29 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6), 0.98 (3H, d,= 6.1 Hz, H-6)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 179.9 (C-4), 169.1 (C-9), 163.4 (C-7), 160.9 (C-4), 162.7 (C-5), 158.6 (C-2), 157.7 (C-9), 150.3 (C-4), 146.7 (C-7), 146.6 (C-3), 135.6 (C-3), 130.5 (C-2, 6), 126.6 (C-1), 122.9 (C-6), 122.5 (C-1), 117.1 (C-5), 116.4 (C-3, 5), 116.3 (C-8), 114.8 (C-2), 107.5 (C-10), 105.9 (C-1), 102.2 (C-1), 100.5 (C-6), 99.9 (C-1), 95.3 (C-8), 82.3 (C-3), 77.9 (C-3), 75.6 (C-5), 75.2 (C-2), 73.6 (C-4), 72.5 (C-3), 72.1 (C-2), 72.0 (C-4), 71.8 (C-2), 71.7 (C-5), 71.6 (C-4), 71.2 (C-5), 65.1 (C-6), 18.1 (C-6), 17.8 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[17]，故鑒定化合物4為山柰酚-3(6啡?；?-β-葡萄糖基-(1→3)-α-鼠李糖-7α-鼠李糖苷。

化合物5：無色油狀物，分子式為C19H30O9，ESI-MS/: 425 [M＋Na]+，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.60 (1H, dt,= 10.9, 7.2 Hz, H-3), 5.48 (1H, dt,= 10.9, 7.4 Hz, H-2), 4.36 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 3.77 (3H, s, H-1), 3.65 (1H, dt,= 9.5, 7.1 Hz, H-5), 3.25 (1H, dd,= 9.0, 7.8 Hz, H-2), 2.80 (1H, ddd,= 14.9, 4.1, 1.7 Hz, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 222.0 (C-3), 174.6 (C-1), 129.1 (C-2, 3), 104.5 (C-1), 78.2 (C-3), 78.0 (C-5), 75.2 (C-2), 71.8 (C-4), 70.4 (C-5), 62.9 (C-6), 55.2 (C-2), 52.3 (C-1), 39.4 (C-2), 39.3 (C-1), 38.7 (C-4), 29.2 (C-4), 28.2 (C-5), 26.6 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[18]，故鑒定化合物5為5β葡萄糖苷茉莉酮酸甲酯。

化合物6：無色油狀物，分子式為C22H36O9，ESI-MS/: 467 [M＋Na]+，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.57 (1H, dt,= 12.1, 7.2 Hz, H-3), 5.45 (1H, dt,= 12.1, 7.2 Hz, H-2), 4.32 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 4.15 (2H, t,= 6.6 Hz, H-1), 3.93 (1H, m, H-5a), 3.89 (1H, d,= 1.9 Hz, H-6a), 3.71 (1H, dd,= 11.9, 5.0 Hz, H-6b), 3.61 (1H, dt,= 9.2, 7.0 Hz, H-5b), 3.22 (1H, dd,= 9.0, 7.7 Hz, H-2), 2.76 (1H, dd,= 14.6, 3.8 Hz, H-2a), 2.41 (1H, m, H-2b), 2.04 (1H, dt,= 10.7, 5.4 Hz, H-2), 1.68 (2H, m, H-2), 1.45 (2H, dt,= 14.5, 7.5 Hz, H-3), 1.00 (3H, t,= 7.4 Hz, H-4)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 221.9 (C-3), 174.2 (C-1), 129.0 (C-2), 128.9 (C-3), 104.4 (C-1), 78.1 (C-3), 77.9 (C-5), 75.1 (C-2), 71.7 (C-4), 70.2 (C-5), 65.5 (C-1), 62.8 (C-6), 55.1 (C-2), 39.9 (C-2), 39.3 (C-1), 38.6 (C-4), 31.8 (C-2), 29.1 (C-4), 28.1 (C-5), 26.5 (C-1), 20.2 (C-3), 14.0 (C-4)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[19]，故鑒定化合物6為5β葡萄糖苷茉莉酮酸丁酯。

化合物7：無色油狀物，分子式為C18H28O9，ESI-MS/387 [M－H]?，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 5.44 (1H, dt,= 10.9, 6.9 Hz, H-3), 5.33 (1H, dt,= 10.9, 7.4 Hz, H-2), 4.20 (1H, d,= 7.9 Hz, H-1), 3.59 (1H, dd,= 11.8, 4.9 Hz, H-6a), 3.48 (1H, dt,= 9.8, 7.1 Hz, H-5b), 3.10 (1H, dd,= 9.0, 7.8 Hz, H-2), 2.03 (1H, dd,= 19.1, 10.7 Hz, H-4a), 1.92 (1H, dt,= 10.9, 5.7 Hz, H-2)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 222.0 (C-3), 176.1 (C-1), 128.9 (C-2, 3), 104.2 (C-1), 78.0 (C-3), 77.8 (C-5), 75.0 (C-2), 71.5 (C-4), 70.2 (C-5), 62.7 (C-6), 55.0 (C-2), 39.8 (C-2), 39.1 (C-1), 38.6 (C-4), 29.0 (C-4), 28.1 (C-5), 26.4 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[20]，故鑒定化合物7為5β葡萄糖苷茉莉酮酸。

化合物8：黃色無定形粉末，分子式為C26H32O11，ESI-MS/: 520 [M＋H]+，1H-NMR (500 MHz, CD3OD): 7.14 (1H, d,= 8.5 Hz, H-5), 7.02 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.94 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.90 (1H, dd,= 8.4, 2.1 Hz, H-6), 6.80 (1H, dd,= 8.1, 2.0 Hz, H-6), 6.76 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 4.74 (1H, d,= 4.0 Hz, H-7), 4.69 (1H, d,= 4.3 Hz, H-7), 3.86 (3H, s, OCH3), 3.84 (3H, s, OCH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD): 151.0 (C-4), 149.1 (C-4), 147.5 (C-3), 147.3 (C-3), 137.5 (C-1), 133.7 (C-1), 120.0 (C-6), 119.8 (C-6), 118.0 (C-5), 116.1 (C-5), 111.6 (C-2), 111.0 (C-2), 102.8 (C-1), 87.5 (C-7), 87.1 (C-7), 78.2 (C-5), 77.8 (C-3), 74.9 (C-2), 72.7 (C- 9, 9), 71.3 (C-4), 62.5 (C-6), 56.7 (3-OCH3), 56.4 (3-OCH3), 55.5 (C-8), 55.3 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[21]，故鑒定化合物8為松脂素-4β葡萄糖苷。

化合物9：黃色無定形粉末，分子式為C26H32O11，ESI-MS/: 520 [M＋H]+，1H-NMR (600 MHz, CD3OD): 7.15 (1H, d,= 8.3 Hz, H-5), 7.03 (1H, d,= 2.0 Hz, H-2), 6.97 (1H, s, H-2), 6.93 (1H, dd,= 8.3, 1.2 Hz, H-6), 6.81 (1H, dd,= 8.1, 1.0 Hz, H-6), 6.78 (1H, d,= 8.1 Hz, H-5), 4.48 (1H, d,= 6.9 Hz, H-7), 4.14 (1H, d,= 9.4 Hz, H-7), 3.40 (1H, m, H-8), 3.87 (3H, s, OCH3), 3.86 (3H, s, OCH3), 2.93 (1H, m, H-8)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD): 151.0 (C-4), 148.8 (C-3), 147.6 (C-3), 146.6 (C-4), 137.5 (C-1), 131.3 (C-1), 119.9 (C-6), 119.4 (C-6), 118.0 (C-5), 116.0 (C-5), 111.5 (C-2), 110.5 (C-2), 102.8 (C-1), 89.0 (C-7), 83.5 (C-7), 78.2 (C-5), 77.8 (C-3), 74.9 (C-2), 72.0(C-9), 71.3 (C-4), 70.7 (C- 9), 62.5 (C-6), 56.7 (3-OCH3), 56.4 (3-OCH3), 55.8 (C-8), 51.3 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[22]，故鑒定化合物9為表松脂素-4β葡萄糖苷。

化合物10：淡黃色膠狀固體，分子式為C20H28O13，ESI-MS/: 499 [M＋Na]+，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.16 (1H, d,= 2.1 Hz, H-3), 5.96 (1H, d,= 2.3 Hz, H-5), 5.01 (1H, d,= 7.6 Hz, H-1), 4.71 (1H, d,= 1.5 Hz, H-1), 4.01 (1H, dd,= 11.2, 1.7 Hz, H-6a), 3.87 (1H, dd,= 3.4, 1.6 Hz, H-6b), 2.69 (3H, s, H-8), 1.16 (3H, d,= 6.2 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 205.0 (C-7), 167.8 (C-2), 166.3 (C-4), 162.5 (C-6), 107.1 (C-1), 102.4 (C-1), 102.1 (C-1), 98.4 (C-3), 95.7 (C-5), 78.6 (C-3), 77.3 (C-5), 74.9 (C-2), 74.2 (C-4), 72.5 (C-2), 72.2 (C-3), 71.3 (C-4), 70.0 (C-5), 67.7 (C-6), 33.6 (C-8), 18.0 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[23-24]，故鑒定化合物10為pyrafortunoside A。

化合物11：白色粉末，分子式為C20H30O10，ESI-MS/: 453 [M＋Na]+，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.27 (2H, m, H-2, 6), 7.26 (2H, m, H-3, 5), 7.18 (1H, m, H-4), 4.77 (1H, brs, H-1), 4.31 (1H, d,= 7.8 Hz, H-1), 4.08 (1H, m, H-8a), 3.78 (1H, m, H-8b), 2.94 (2H, d,= 7.1 Hz, H-7), 1.25 (3H, d,= 6.1 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 139.9 (C-1), 129.9 (C-3, 5), 129.3 (C-2, 6), 127.2 (C-4), 104.4 (C-1), 102.2 (C-1), 78.0 (C-3), 76.8 (C-5), 75.0 (C-2), 73.9 (C-4), 72.1 (C-2), 72.3 (C-3), 71.8 (C-8), 71.6 (C-4), 69.7 (C-5), 68.1 (C-6), 37.2 (C-7), 18.0 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[25]，故鑒定化合物11為苯乙基蕓香苷。

化合物12：無色針晶（甲醇），mp 123～124 ℃，分子式為C13H18O6，ESI-MS/: 293 [M＋Na]+，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 7.46 (2H, d,= 7.2 Hz, H-2, 6), 7.37 (2H, d,= 7.3 Hz, H-3, 5), 7.31 (1H, d,= 7.2 Hz, H-4), 4.97 (1H, d,= 11.8 Hz, H-7a), 4.71 (1H, d,= 11.8 Hz, H-7b), 4.40 (1H, d,= 7.7 Hz, H-1), 3.94 (1H, dd,= 11.9, 2.1 Hz, H-6a), 3.73 (1H, dd,= 11.9, 5.4 Hz, H-6b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD):139.1 (C-1), 129.3 (C-3, 5), 129.2 (C-2, 6), 128.7 (C-4), 103.3 (C-1), 78.1 (C-3), 78.0 (C-5), 75.2 (C-2), 71.8 (C-7), 71.8 (C-4), 62.8 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[26]，故鑒定化合物12為苯甲醇β吡喃葡萄糖苷。

化合物13：白色結(jié)晶（甲醇），mp 183～186 ℃，分子式為C10H14N2O7，ESI?MS/: 273 [M－H]?，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 10.89 (1H, d,= 2.0 Hz, H-3), 7.55 (1H, s, H-5), 5.36 (1H, d,= 6.1 Hz, H-1), 5.24 (1H, d,= 6.3 Hz, H-OH), 5.00 (1H, d,= 4.9 Hz, H-OH), 4.93 (1H, d,= 5.3 Hz, 5-OH), 4.11 (1H, dd,= 11.3, 6.1 Hz, H-4), 3.92 (1H, m, H-2), 3.75 (1H, dd,= 7.1, 3.6 Hz, H-3), 3.69 (3H, s, H-OCH3), 3.51 (1H, m, H-5a), 3.41 (1H, m, H-5b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD):159.4 (C-6), 152.6 (C-2), 118.0 (C-5), 113.3 (C-4), 85.8 (C-1), 84.9 (C-4), 73.4 (C-3), 70.4 (C-2), 61.4 (C-5), 51.5 (6-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[27]，故鑒定化合物13為methyl-1-(βribofuranosyl)-imidazolin- 2-one-4-carboxylate。

化合物14：白色針狀結(jié)晶（甲醇），mp 114～115 ℃，分子式為C8H12O5，ESI-MS/: 189 [M＋H]+，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.82 (1H, dt,= 3.6, 1.8 Hz, H-2), 4.40 (1H, m, H-3), 4.02 (1H, dt,= 7.3, 5.2 Hz, H-4), 3.77 (3H, s, H-8), 3.72 (1H, dd,= 7.3, 4.1Hz, H-5), 2.72 (1H, m, H-6a), 2.23 (1H, m, H-6b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 168.7 (C-7), 139.0 (C-2), 130.2 (C-1), 72.8 (C-3), 68.4 (C-4), 67.2 (C-5), 52.3 (C-8), 31.5 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[28]，故鑒定化合物14為莽草酸甲酯。

化合物15：無色針狀結(jié)晶（甲醇），mp 185～187 ℃，分子式為C7H10O5，ESI-MS/: 175 [M＋H]+，1H-NMR (400 MHz, CD3OD): 6.71 (1H, m, H-2), 4.28 (1H, m, H-3), 3.89 (1H, m, H-4), 3.59 (1H, dd,= 7.4, 4.2 Hz, H-5), 2.63 (1H, m, H-6a), 2.59 (1H, m, H-6b)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD): 170.1 (C-7), 138.8 (C-2), 130.8 (C-1), 72.8 (C-3), 68.4 (C-4), 67.3 (C-5), 31.7 (C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道一致[29]，故鑒定化合物15為莽草酸。

4 生物活性評價

4.1 細(xì)胞活力及抗炎活性實驗

化合物用DMSO溶液配制成100 mg/mL的存儲液，使用時用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋為所需要濃度，并保證DMSO的終濃度不超過0.1%。

4.1.1 對細(xì)胞活力的影響 本研究首先檢測化合物對小鼠RAW264.7細(xì)胞的毒性。對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞接種到96孔板，每孔接種2×104個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后去除舊培養(yǎng)基，加入含2、10、20、50、100 μg/mL化合物的新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同時設(shè)置調(diào)零組（不含細(xì)胞）和對照組（添加等濃度的DMSO），每個組設(shè)3個重復(fù)孔。細(xì)胞處理24 h后，每孔加入10 μL的MTS溶液，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度（），根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(化合物－調(diào)零)/(對照－調(diào)零)

檢測發(fā)現(xiàn)化合物1～15對RAW264.7細(xì)胞活力沒有明顯的抑制作用，表明化合物在質(zhì)量濃度100 μg/L以下無明顯的細(xì)胞毒性。

4.1.2 對細(xì)胞NO生成的影響 取對數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞接種到96板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行給藥處理，細(xì)胞分為對照組、模型組、陽性藥組、化合物組。24 h后細(xì)胞去除舊培養(yǎng)基，各組加入不同的新培養(yǎng)基，其中對照組加入正常培養(yǎng)基，模型組加入含1μg/mL LPS的培養(yǎng)基，陽性藥組加入含1 μg/mL LPS＋-NMMA（濃度為10、20、50、100、200 μmol/L）培養(yǎng)基，化合物組加入含1 μg/mL LPS＋化合物（質(zhì)量濃度為2、10、20、50、100 μg/mL）培養(yǎng)基處理24 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)液50 μL到新的96孔板中，每孔加入100 μL Griess混合試劑，充分混勻后用酶標(biāo)儀在540 nm處檢測值，檢測NO濃度，并根據(jù)以下公式計算化合物NO生成抑制率，半數(shù)抑制濃度IC50根據(jù)Reed&Muench法計算，化合物物質(zhì)的量濃度根據(jù)質(zhì)量濃度和化合物相對分子質(zhì)量進(jìn)行換算。

NO生成抑制率＝(模型－化合物)/(模型－對照)

結(jié)果顯示，化合物13對NO生成量具有較強抑制活性，其IC50值為（27.9±2.8）μmol/L，與陽性對照藥-NMMA的IC50值（23.0±0.6）μmol/L抑制活性接近；化合物15對NO生成量也具有一定的抑制活性，其IC50為（62.4±9.7）μmol/L。其他化合物對NO生成量無明顯的抑制活性。

4.2 DPPH自由基的清除活性

采用DPPH法[9,30]評價化合物1～15的體外抗氧化作用。將待測化合物和陽性對照品（維生素C）用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mg/mL的待測樣品溶液。精密量取50 μL不同濃度待測樣品溶液，甲醇溶液和維生素C溶液，分別加入150 μL的DPPH溶液，作為實驗組（）、陰性對照組（B）和陽性對照組，50μL待測樣品溶液加入150μL甲醇為空白對照組（0），25 ℃下避光保溫顯色30 min，于517 nm波長下測定值并計算化合物對DPPH自由基清除率。

自由基清除率＝1－(－0)/B

測定結(jié)果表明，化合物4具有一定的DPPH自由基清除活性，其IC50為（109.8±1.5）μmol/L，陽性對照組維生素C的IC50為（17.0±0.4）μmol/L。

5 討論

本研究綜合運用硅膠柱色譜、反相ODS柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、半制備HPLC以及重結(jié)晶等多種分離純化技術(shù)，結(jié)合核磁共振、質(zhì)譜等波譜鑒定技術(shù)對荔枝核的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離鑒定了15個化合物，化合物1、3～6、9～15為首次從荔枝核中分離得到。其中，化合物1～4為黃酮苷類，是荔枝核中的主要成分類型；化合物5～7為茉莉酮酸酯類，近年從荔枝核中報道了系列該類型新化合物[3]；化合物5和6為首次從荔枝核中報道；化合物8和9為雙四氫呋喃型木脂素苷類成分，為一對同分異構(gòu)體，其質(zhì)譜相同，核磁共振氫譜及碳譜數(shù)據(jù)近似，主要差別在于C-7、H-7的化學(xué)位移值及H-7的偶合常數(shù)值，與化合物8相比，化合物9的C-7及H-7核磁共振信號向高場位移，H-7的偶合常數(shù)值增大；化合物10～12為小分子芳香族的氧苷類（其中化合物10為酚苷、11和12為醇苷），化合物13為核苷類，化合物14和15為多元醇酸類，該研究結(jié)果進(jìn)一步揭示荔枝核的化學(xué)成分，為活性研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

抗炎活性測定結(jié)果表明，化合物13顯示出較強的NO抑制活性，其IC50與陽性對照藥-NMMA的抑制活性接近，化合物15具有一定的抑制活性?？寡趸钚越Y(jié)果表明，化合物4顯示出一定的DPPH自由基清除活性，化合物1～3顯示較弱活性。據(jù)文獻(xiàn)報道，黃酮類（C6-C3-C6）化合物的抗氧化活性與羥基數(shù)目、位置及C環(huán)C-2和C-3位是否為不飽和雙鍵有關(guān)，當(dāng)B環(huán)C-3和C-4位為鄰二酚羥基時，抗氧化活性最強；當(dāng)C環(huán)C-3位為羥基、C-2和C-3位為不飽和雙鍵時，抗氧化活性較強；當(dāng)A環(huán)的C-5和C-7位為酚羥基時，對抗氧化活性有一定增強作用[31-32]。與化合物4相比較，化合物1和2的活性較弱，可能是因為化合物1和2中C-2和C-3位為飽和單鍵，A、B和C環(huán)的交叉共軛體系被破壞?；衔?和4均為黃酮醇苷類，化合物3的A環(huán)雖有C-5和C-7位酚羥基，但對抗氧化活性影響較小，而化合物4中有鄰二酚羥基的咖啡?；〈赡苁瞧涫够衔?的抗氧化活性增強。以上結(jié)果豐富了荔枝核的抗炎和抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用荔枝核藥用價值，開展后續(xù)研究提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Studies on chemical constituents and biological activities from seeds of

REN Jia-jia1, YANG Xing1, WU Shi-li1, ZHANG Zhi-bi2, LI Bao-jing1, LI Yan-ping1, HE Hong-ping1, ZUO Ai-xue1, DONG Fa-wu1

1. Yunnan Key Laboratory of Sustainable Utilization of Southern Medicine, College of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China 2. Yunnan Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine & Biomedical Engineering Research Center, Kunming Medical University, Kunming 650500, China

To study the chemical constituents and biological activities from the-butanol extract of Lizhihe ().The compounds were systematically isolated and purified by using various chromatographic separation and analysis techniques, including silica gel, D101 macroporous resins, MCI, ODS, Sephadex LH-20 chromatographies and semi-prepative HPLC. The structures were identified on the basis of physicochemical properties and spectral data. The inhibitory effect of the compound on nitirc oxide production in LPS-induced mouse macrophage RAW264.7 cells was evaluated by Griss assay. Moreover, the antioxidant activitieswere tested by DPPH assay.A total of 15 compounds were isolated and identified as naringenin-7(2,6-diα--rhamnopyranosyl)-βglucopyranoside (1), litchioside D (2), isorhamnetin- 3(2,6-diα--rhamnopyranosyl)-βglucopyranoside (3), kaempferol-3[(6-caffeoyl)-β-glucopyranosyl(1→3)-α- rhamnopyranoside]-7α-rhamnopyranoside (4), 5βglucopyranosyloxyjasmo-nic methyl ester (5), 5βglucopyranosyloxyjasmonic butyl ester (6), 5βglucopyranosyloxyjasmonic acid (7), pinoresinol-4βglucopyranoside (8), epipinoresinol-4βglucopyranoside (9), pyrafortunoside A (10), phenylethyl-rutinoside (11), benzyl alcoholβglucopyranoside (12), methyl-1-(βribofuranosyl)-imidazolin-2-one-4-carboxylate (13), methyl shikimate (14), and shikimic acid (15). Amoung them, compound 13 showed strong inhibitory activities against LPS-induced NO production in RAW264.7 macrophages, with IC50value of (27.9±2.8) μmol/L, 15 exhibted obvious activities with IC50value of (62.4±9.7) μmol/L. Additionally, compound 4 displayed a degree of DPPH radical scavenging activities with IC50value of (109.8±1.5) μmol/L.Compounds 1, 3—6, 9—15 are isolated formfor the first time. Compound 13 had stronganti-inflammatory activityand 15 possessed moderate anti-inflammatory activity. Moreover, Compound 4 was found to have moderate anti-oxidant activity.

; glycoside; anti-inflammatory activity; anti-oxidant activity; kaempferol-3[(6-caffeoyl)-β-glucopyranosyl(1→3)-α-rhamnopyranoside]-7α-rhamnopyranoside; shikimic acid

R284.1

A

0253 - 2670(2022)24 - 7664 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.24.003

2022-04-09

國家自然科學(xué)基金資助項目（82260758）；國家自然科學(xué)基金資助項目（31860092）；云南省高層次人才培養(yǎng)支持計劃“青年拔尖人才”專項（YNWR-QNBJ-2020-255）；云南省基礎(chǔ)研究計劃面上項目（202101AT070254）；云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室開放課題重點項目（202105AG070012ZD2201）

任嘉佳（1996—），碩士研究生，從事中藥民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: 2936954422@qq.com

董發(fā)武，副教授，從事中藥民族藥改善男性不育相關(guān)疾病藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: 15087182863 E-mail: 593742545@qq.com

左愛學(xué)，副教授，從事中藥民族藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。Tel: 13987125772 E-mail: 1002042656@qq.com

[責(zé)任編輯 王文倩]