土曲霉對(duì)小鼠肝氧化損傷及鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的影響

向 益，張 樺，王 利*，魏 勇，俄木曲者

(1.西南民族大學(xué) 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用國(guó)家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.西南民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；3.四川省畜牧科學(xué)研究院，成都 610066)

肝是機(jī)體重要的代謝和解毒器官。生物性和物理性等因素均可造成肝損傷。四氯化碳可引起大鼠肝纖維化[1]。對(duì)乙酰氨基酚可引起小鼠藥物性肝損傷[2]。白酒可引起小鼠酒精性肝損傷[3]。飼喂蛋氨酸膽堿缺乏飼料可引起小鼠非酒精性脂肪性肝損傷[4]。飼喂含鎘飼料可引起仔豬肝毒性損傷[5]。脂多糖可引起小鼠膿毒癥[6]。乙型肝炎病毒可引起大鼠病毒性肝炎[7]。土曲霉是一種機(jī)會(huì)性致病菌，可引起人和動(dòng)物肝損傷，如兒童肝炎、小鼠脂肪肝和大鼠肝纖維化，但其損傷機(jī)制尚不清楚[8-10]。

鐵死亡(ferroptosis)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞死亡方式，其特征是鐵依賴(lài)性的，細(xì)胞內(nèi)活性氧堆積的非細(xì)胞凋亡形式的細(xì)胞死亡[11]。當(dāng)誘導(dǎo)劑作用于肝癌、肺癌和卵巢癌細(xì)胞后，癌細(xì)胞的增殖通過(guò)鐵死亡方式被抑制[12-14]。此外，鐵死亡與伴隨脂質(zhì)過(guò)氧化的非惡性細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制也密切相關(guān)。鐵死亡可發(fā)生于丙型肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、藥物性肝損傷和血色沉著病[11]。這些肝損傷類(lèi)型均與鐵代謝失衡以及活性氧增多誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)[15]。本研究用土曲霉MSF2菌株孢子懸液注射小鼠，觀察肝氧化損傷相關(guān)指標(biāo)、組織病理學(xué)和鐵死亡相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，揭示該菌株引起小鼠肝損傷的分子機(jī)制。這為進(jìn)一步探究土曲霉的致病機(jī)制提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

土曲霉MSF2菌株分離自四川某羊場(chǎng)發(fā)病羊肝，由本課題組鑒定并保種于西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用國(guó)家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)材料

20只昆明小鼠，體重為(18±2)g，雌雄各半，購(gòu)自四川省成都市中醫(yī)藥研究所。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-PX)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和鐵離子檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成科技有限公司；普魯士藍(lán)染色試劑盒購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Reagent Kit均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

采用三點(diǎn)接種法將保種的土曲霉MSF2菌株無(wú)菌接種于PDA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)5 d，制備孢子懸液，用血球計(jì)數(shù)法將濃度調(diào)整為5×107CFU·mL-1[16]。20只 昆明小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼喂3 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組10只，試驗(yàn)組腹腔注射0.3 mL孢子懸液，對(duì)照組注射等量生理鹽水，試驗(yàn)周期為7 d。試驗(yàn)結(jié)束后采集小鼠肝分別保存于4%多聚甲醛、2.5%戊二醛和-80 ℃冰箱備用。

1.4 小鼠肝氧化損傷指標(biāo)及鐵離子含量檢測(cè)

取對(duì)照組和試驗(yàn)組小鼠肝0.2 g于50 mL管中，加入9倍體積生理鹽水，用超聲波破碎儀在400 A，5 s·次-1，間隔10 s反復(fù)5次條件下破碎，制成10%組織勻漿。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)肝MDA含量、GSH含量、GSH-PX活力、T-SOD活力及鐵離子含量。

1.5 小鼠肝組織切片制作及HE染色

取出保存于4%多聚甲醛的肝，流水沖洗24 h后，于不同濃度乙醇中逐級(jí)脫水1 h，二甲苯透明25 min 后，進(jìn)行浸蠟與包埋。切片后，脫蠟至水，常規(guī)蘇木素、伊紅染色，中性樹(shù)膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察其病理變化。

1.6 小鼠肝普魯士藍(lán)染色

將制備的小鼠肝組織切片脫蠟至水，用普魯士藍(lán)工作液染色30 min，伊紅復(fù)染10 s，90%乙醇、95%乙醇和100%乙醇各脫水2 min，二甲苯透明10 min，中性樹(shù)膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。

1.7 小鼠肝透射電鏡切片制作

將保存于2.5%戊二醛的小鼠肝取出，用1% 鋨酸固定2 h，在4 ℃條件下，不同濃度乙醇中逐級(jí)脫水10 min。室溫包埋與切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，用透射電子顯微鏡觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。

1.8 Real-PCR檢測(cè)鐵死亡相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取小鼠肝總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20 ℃保存。檢測(cè)各組小鼠肝TFR1、DMT1、FTH1、GPX4、SLC7A11、VDAC3基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平(引物序列見(jiàn)表1)。反應(yīng)程序：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，退火10 s(溫度見(jiàn)表1)，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)，計(jì)算各基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

表1 鐵死亡相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences of ferroptosis related gene

1.9 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，利用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，用Graphpad 5.0軟件制圖。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肝氧化損傷指標(biāo)的變化

用MDA、GSH、GSH-PX、T-SOD試劑盒檢測(cè)小鼠肝各指標(biāo)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠肝中MDA含量極顯著升高(P<0.01)，GSH含量、GSH-PX活力和T-SOD活力極顯著降低(P<0.01)，詳見(jiàn)圖1。這表明小鼠感染土曲霉MSF2菌株后肝發(fā)生了氧化損傷。

A.丙二醛含量；B.谷胱甘肽含量；C.谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力；D.總超氧化物歧化酶活力。*表示對(duì)照組與試驗(yàn)組相比差異顯著(P<0.05)；**表示對(duì)照組與試驗(yàn)組相比差異極顯著(P<0.01)。下同A.MDA content；B.GSH content；C.GSH-PX activity；D.T-SOD activity.*indicates a significant difference between the control group and the test group (P<0.05);** indicates that the difference between the control group and the test group is extremely significant (P<0.01).The same as below圖1 小鼠肝氧化損傷指標(biāo)的變化Fig.1 The change of oxidative damage indexes in mice liver

2.2 小鼠肝鐵離子含量的變化

用鐵檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠肝鐵離子含量。結(jié)果表明，試驗(yàn)組小鼠肝中的鐵離子含量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，詳見(jiàn)圖2。這表明小鼠感染土曲霉MSF2菌株后肝鐵離子代謝紊亂。

圖2 小鼠肝鐵離子含量變化Fig.2 The change of iron ions content in mice liver

2.3 小鼠肝組織病理學(xué)變化

肝組織病理切片經(jīng)HE染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察其病理變化。結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞清晰，核大小均一、呈圓形(圖3A)；試驗(yàn)組小鼠肝中央靜脈充滿(mǎn)大量紅細(xì)胞，肝細(xì)胞腫脹，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主，少量肝細(xì)胞腫脹、壞死，溶解(圖3B)。這表明小鼠感染土曲霉MSF2菌株后肝出現(xiàn)病理?yè)p傷。

A.對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞清晰，未見(jiàn)明顯病理變化；B.試驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞腫脹、壞死(黑色箭頭)，淋巴細(xì)胞(紅色箭頭)，巨噬細(xì)胞(藍(lán)色箭頭)浸潤(rùn)A.The hepatocytes of mice in the control group were clear and had no pathological changes;B.The hepatocytes of mice in the test group were swollen and necrotic (black arrow),lymphocytes (red arrow)and macrophages (blue arrow)were infiltrated圖3 小鼠肝組織病理變化(400×)Fig.3 The change of histopathologic in mice liver (400×)

2.4 小鼠肝普魯士藍(lán)染色

小鼠肝切片經(jīng)普魯士藍(lán)染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞未見(jiàn)被染成藍(lán)色的鐵離子沉積，鐵染色結(jié)果呈陰性(圖4A)，試驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞中可見(jiàn)藍(lán)色深染的鐵離子沉積(圖4B)。

A.對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞鐵染色陰性；B.試驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞可見(jiàn)鐵離子沉積(黑色箭頭)A.Iron stain was negative in the control group of mice hepatocytes；B.Iron ions accumulated in the test group of mice hepatocytes (black arrow)圖4 小鼠肝普魯士藍(lán)染色結(jié)果(400×)Fig.4 Results of Perls stain in mice liver (400×)

2.5 小鼠肝超微結(jié)構(gòu)變化

制備肝超微病理切片后，用透射電鏡觀察其超均勻，胞核規(guī)則，核內(nèi)常染色質(zhì)分布，線(xiàn)粒體大多呈圓形且結(jié)構(gòu)完整,電子密度均勻,可見(jiàn)線(xiàn)粒體嵴微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞質(zhì)分布(圖5A)；試驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體變小、數(shù)量增多，線(xiàn)粒體嵴減少甚至消失，膜密度增加，染色變深(圖5B)。這表明小鼠感染土曲霉MSF2菌株后肝發(fā)生了鐵死亡。

A.對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體完整呈圓形，電子密度均勻，可見(jiàn)細(xì)管狀嵴；B.試驗(yàn)組肝細(xì)胞線(xiàn)粒體變小、數(shù)量增多，線(xiàn)粒體嵴減少甚至消失，膜密度增加，染色變深。Mit.線(xiàn)粒體；rER.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；RI.核糖體A.The mitochondria in the hepatocytes of the control group were complete and round,with uniform electron density and fine tubular cristae;B.In the test group,the mitochondria of hepatocytes became smaller and more numerous,the mitochondrial cristae decreased or even disappeared,the membrane density increased,and the staining became darker.Mit.Mitochondria;rER.Rough endoplasmic reticulum;RI.Ribosome圖5 小鼠肝超微結(jié)構(gòu)變化(15 000×)Fig.5 The change of ultrastructure in mice liver (15 000×)

2.6 小鼠肝鐵死亡相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化

qPCR檢測(cè)鐵死亡相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠肝中TFR1、DMT1、FTH1 基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P<0.01)，GPX4 基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平極顯著降低(P<0.01)；SLC7A11 基因mRNA 相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05)；VDAC3 基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)，詳見(jiàn)圖6。

圖6 小鼠肝鐵死亡相關(guān)基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 Relative mRNA transcription level of ferroptosis related genes of mice liver

3 討 論

土曲霉是一種機(jī)會(huì)性病原菌，易感染患有惡性腫瘤、接受同種異體造血干細(xì)胞移植或?qū)嶓w器官移植的患者，引起播散性真菌病。當(dāng)人或動(dòng)物感染土曲霉后，導(dǎo)致肝嚴(yán)重?fù)p傷。Trachana等[8]報(bào)道患免疫缺陷的兒童感染土曲霉后引發(fā)肝炎，活檢發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞變性、壞死，淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。Slesion等[9]報(bào)道土曲霉可引起小鼠持久性、亞臨床性肝損傷，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Sharma等[10]報(bào)道土曲霉感染可引起大鼠肝纖維化，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝小葉周?chē)w維增生，細(xì)胞壞死、空泡化明顯，并伴有單核細(xì)胞浸潤(rùn)。Day和Penhale[17]報(bào)道土曲霉感染可引起犬肝損傷，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)霉菌菌絲出現(xiàn)在肝細(xì)胞間，肝細(xì)胞壞死，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。本研究中土曲霉MSF2菌株也引起小鼠急性肝炎，病理變化與上述報(bào)道基本一致。損傷程度的差異可能由菌株來(lái)源或毒力強(qiáng)弱不同導(dǎo)致。

鐵死亡的特征是鐵離子過(guò)載和毒性脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積，所以可通過(guò)氧化損傷相關(guān)指標(biāo)以及鐵死亡相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平判定是否發(fā)生鐵死亡。MDA是自由基發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物。GSH、GSH-PX能將有毒的過(guò)氧化物還原為無(wú)毒的羥基化合物，維持機(jī)體氧化與抗氧化平衡。SOD能清除對(duì)機(jī)體有害的超氧陰離子自由基，是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶[18-19]。這些指標(biāo)的變化可反映機(jī)體氧化損傷程度。TFR1、DMT1、FTH1控制著鐵離子的攝取與儲(chǔ)存，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)有著重要作用。鐵穩(wěn)態(tài)被破壞后，細(xì)胞內(nèi)游離鐵含量增加通過(guò)Fenton反應(yīng)促進(jìn)脂質(zhì)活性氧的產(chǎn)生，促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。GPX4表達(dá)降低導(dǎo)致GSH含量下降，大量活性氧產(chǎn)生，導(dǎo)致鐵死亡發(fā)生。SLC7A11調(diào)控胱氨酸的攝取，胱氨酸可合成GSH，SLC7A11表達(dá)減少，加劇氧化損傷并促進(jìn)鐵死亡發(fā)生。VDAC3是細(xì)胞內(nèi)代謝物分子進(jìn)出線(xiàn)粒體的必經(jīng)通道，VDAC3表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)鐵死亡發(fā)生[20-22]。這些基因的變化與鐵死亡密切相關(guān)。

鐵死亡可見(jiàn)于各種類(lèi)型的疾病模型中。Yang等[23]報(bào)道高脂飲食可引起小鼠非酒精性脂肪性肝炎，模型組小鼠肝氧化損傷程度增加，MDA含量升高，SOD活力和GSH-PX活力降低，鐵離子含量升高，TFR1表達(dá)升高，F(xiàn)TH1和GPX4表達(dá)降低。李安培[24]報(bào)道六價(jià)鉻可引起大鼠腎損傷，模型組大鼠腎鐵離子含量升高，GPX4表達(dá)降低，TFR1表達(dá)升高。晏思源[25]報(bào)道葡萄糖腹膜透析液可引起大鼠腹膜纖維化，模型組GPX4和SLC7A11表達(dá)降低。Chen等[26]報(bào)道葡聚糖硫酸鈉(DSS)可引起小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，模型組小鼠結(jié)腸組織鐵離子含量升高，MDA含量升高，GPX4和FTH1表達(dá)降低。何信用等[27]報(bào)道高脂飲食可引起小鼠動(dòng)脈粥樣硬化，模型組小鼠動(dòng)脈SOD活力、GSH含量降低，MDA含量升高，F(xiàn)TH1、GPX4和SLC7A11表達(dá)降低。Liu等[28]使用鐵死亡激活劑(erastin)在神經(jīng)細(xì)胞中構(gòu)建鐵中毒模型，細(xì)胞中鐵離子含量升高，MDA含量升高，GSH含量降低，TFR1、FTH1和VDAC3表達(dá)升高，GPX4和SLC7A11表達(dá)降低。Xu等[29]采用DSS構(gòu)建小鼠結(jié)腸炎模型，模型組MDA含量升高，組織鐵離子含量升高，GPX4表達(dá)降低，F(xiàn)TH1表達(dá)升高。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致。在本研究中，F(xiàn)TH1基因mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，這是由于鐵代謝失衡初期，細(xì)胞內(nèi)游離鐵離子含量升高，鐵蛋白儲(chǔ)存能力增加，導(dǎo)致FTH1轉(zhuǎn)錄水平升高。此外，本研究用透射電鏡觀察了肝細(xì)胞超微變化，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組小鼠肝細(xì)胞具有顯著的鐵死亡特征——線(xiàn)粒體萎縮、嵴減少以及膜密度增加[18]。

4 結(jié) 論

土曲霉MSF2菌株可引起小鼠肝MDA含量升高，GSH含量、GSH-PX活力和T-SOD活力降低，肝氧化水平升高，鐵離子含量升高，線(xiàn)粒體萎縮、嵴減少和膜密度增加，TFR1、DMT1、FTH1和VDAC3基因 mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，GPX4和SLC7A11基因 mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低。土曲霉MSF2菌株可引起小鼠肝發(fā)生鐵死亡。