甘露糖修飾的殼聚糖聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米微球作為口蹄疫病毒核酸疫苗遞送載體的特性評(píng)價(jià)

李 顯，張中旺，張富東，呂建亮，李嘉豪，潘 麗

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 OIE/中國(guó)國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730064)

自Illum等[1]提出殼聚糖微粒作為鼻黏膜疫苗載體以來，其發(fā)展已有20多年。殼聚糖是由幾丁質(zhì)脫乙酰化得到的一種天然的生物可降解聚合物(圖1)，具有無毒、黏附性好、生物利用度和電荷密度高等優(yōu)點(diǎn)，因而在生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。與幾丁質(zhì)相比，殼聚糖有一個(gè)獨(dú)特的特點(diǎn)，即氨基葡萄糖殘基C-2位置存在伯胺[3-4]，大量氨基的存在不僅與其脫乙酰度密切相關(guān)，也為其改性提供了可能性。各種化學(xué)基團(tuán)的修飾決定了殼聚糖的功能和性質(zhì)，例如為了提高殼聚糖在疫苗遞送中的溶解性對(duì)其進(jìn)行甲基化修飾，得到季銨化親水性衍生物三甲基殼聚糖[5-6]。對(duì)其進(jìn)行硫代化修飾，改性后的殼聚糖衍生物具有高滲透性、生物黏附性、高溶解度和原位凝膠性能[7]。此外，由于殼聚糖表面具有伯氨基的特性，也常用于接枝其他高分子化合物，如帶正電荷的殼聚糖包覆帶負(fù)電荷的PLGA，以提高對(duì)黏膜疫苗遞送的免疫應(yīng)答[8-9]。

圖1 幾丁質(zhì)脫乙?；玫綒ぞ厶荈ig.1 Deacetylation of chitin to produce chitosan

對(duì)于疫苗的遞送來說，還可利用殼聚糖表面官能團(tuán)容易修飾的特點(diǎn)，添加靶向抗原遞呈細(xì)胞(antigen-presenting cells，APCs)的化學(xué)基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)靶向遞送。APCs(如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)表面表達(dá)一系列病原體識(shí)別受體(PRRs)，包括Toll樣受體(TLRs)[10]和C型凝集素受體(CLRs)[11-12]。甘露糖受體(mannose receptor，MR)存在于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上，屬于CLRs家族成員。巨噬細(xì)胞表達(dá)的MR識(shí)別并內(nèi)吞以甘露糖基為末端的甘露糖基衍生物，將其轉(zhuǎn)運(yùn)到早期的核內(nèi)體，核內(nèi)體中的抗原被定位于溶酶體，抗原片段被降解加工呈遞給MHC分子，刺激適應(yīng)性免疫反應(yīng)[13]。

在過去的幾年中，甘露糖基化的殼聚糖顆粒被用于不同抗原的遞呈中，并且取得了良好的預(yù)期效果[14-16]。但甘露糖基化的殼聚糖納米微球作為FMDV核酸疫苗遞呈載體卻鮮有報(bào)道。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前研究結(jié)果(未發(fā)表)，選擇A型口蹄疫病毒的代表性毒株FMDV/MM、FMDV/WH09和FMDV/AF72的若干抗原表位，分別為T細(xì)胞表位VP1(21-60aa)，B細(xì)胞表位VP1(140-160aa)、VP1(200-212 aa)，通過Linker(GGGGS)2進(jìn)行3種毒株表位的重復(fù)串聯(lián)得到FMDV TB表位的序列并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。因此，本研究以構(gòu)建的含有FMDV TB表位基因的真核表達(dá)質(zhì)粒為對(duì)象，對(duì)MCS-PLGA-NPs作為FMDV核酸疫苗遞送載體的特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為下一步該遞呈載體攜帶核酸靶向APCs表面甘露糖受體和應(yīng)用于動(dòng)物免疫的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及細(xì)胞

真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP購(gòu)自淼靈生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒pUC57-TB-FL由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司優(yōu)化合成，RAW264.7細(xì)胞由蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫防控技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 主要試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA Bio-Tek公司(美國(guó))，DNA Marker DL5000(TaKaRa)購(gòu)自寶生物工程有限公司，工具酶HindⅢ、SalⅠ、T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司(美國(guó))，博來霉素、TAE電泳液購(gòu)自北京索萊寶公司，核酸染料購(gòu)自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，瓊脂糖購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)公司，酵母提取物、胰化蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，低分子量殼聚糖、甘露糖、氰基硼氫化鈉、聚乙烯醇(PVA)均購(gòu)自Sigma公司，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA50：50，黏度0.29 dL·g-1)購(gòu)自山東省醫(yī)療器械研究所，無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，高糖DMEM basic培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青-鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，DAPI染料、10×PBS、4%多聚甲醛組織細(xì)胞固定液均購(gòu)自索萊寶公司，DNase Ⅰ購(gòu)自日本TaKaRa公司，瓊脂糖購(gòu)自BIOWESTE公司(西班牙)，Cy3熒光素購(gòu)自Mirusbio公司，HRP標(biāo)記的兔源抗A型FMDV多克隆抗體，由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存，二氯甲烷、無水乙醇、冰醋酸均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 主要儀器

電熱恒溫水浴鍋(DK-8D型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；立式電壓力滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))；磁力攪拌器(84-1A型，上海司樂儀器有限公司)；水循環(huán)式真空泵(SHB-Ⅲ型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；電子分析天平(Sartorius BAS124S型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；電動(dòng)攪拌器(JJ-1型，常州國(guó)華電器有限公司)；低溫冷凍干燥儀(CSSS-4型，Gene Company Limi)元素分析儀(Elementar公司，德國(guó))；雙面超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；倒置光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)；掃描電子顯微鏡(JSM-6701F)；粒徑測(cè)定儀(ZS90，美國(guó))；電泳儀(Bio-Rad，美國(guó))、凝膠/蛋白質(zhì)紫外成像系統(tǒng)(Bio-Rad ALD 1244型，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))；激光共聚焦顯微鏡(TCS SP8，德國(guó)徠卡)。

1.4 真核過表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB的構(gòu)建

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建合成的質(zhì)粒pUC57-TB-FL為模板質(zhì)粒，通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出目的基因TB。引物序列及酶切位點(diǎn)詳見表1。然后按照Zheng等[17]所述方法，將擴(kuò)增的TB基因通過HindⅢ和SalⅠ酶切位點(diǎn)插入連接到真核表達(dá)載體pBudCE4.1-EGFP上，構(gòu)建出含有綠色熒光蛋白基因的重組A/FMDV TB表位基因真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence used in the experiment

1.5 甘露糖基化殼聚糖的制備

采用甘露糖的醛基與殼聚糖分子表面氨基進(jìn)行西佛堿反應(yīng)，然后在氰基硼氫化鈉的還原作用下得到甘露糖修飾的殼聚糖衍生物(圖2)。制備方法參考Zhou等[18]所述，并在此基礎(chǔ)加以改進(jìn)。1)將 殼聚糖(500 mg，1倍量)加入30 mL甲醇∶超純水=1∶1的混合溶液中，此時(shí)殼聚糖呈粉末狀分散于混合溶液。加入溶液體積1%的醋酸后，溶液立刻變黏稠，狀態(tài)呈透明膠狀，若此時(shí)磁力攪拌器無法令其劇烈攪拌，將體系移至機(jī)械攪拌下。加入甘露糖(81 mg，0.15倍量)反應(yīng)過夜，約10 h。加入氰基硼氫化鈉(50 mg，0.45倍量)，此時(shí)體系出現(xiàn)大量氣泡浮于溶劑表面，強(qiáng)力攪拌使體系均勻反應(yīng)約6 h。反應(yīng)體系放大時(shí)按放大倍數(shù)增加藥品和溶劑的用量；2)后處理：向反應(yīng)體系中加入大量乙醇使產(chǎn)物分散，真空抽濾得到產(chǎn)物。將產(chǎn)物再溶于乙醇中分散約20 min，抽濾，重復(fù)3次，得到塊狀瓊脂樣產(chǎn)物。將產(chǎn)物溶于超純水中分散一次，抽濾得到的產(chǎn)物冷凍干燥，得到成品。將得到的成品取30 mg 50 ℃真空干燥過夜，用微量元素分析儀測(cè)定合成物中碳、氮、氫的元素含量，根據(jù)化學(xué)式計(jì)算甘露糖修飾的殼聚糖衍生物的取代度(Z%)。燃燒法測(cè)定各元素占比。重復(fù)測(cè)量3次。

圖2 甘露糖基化殼聚糖合成線路Fig.2 Synthetic circuit diagram of mannylated chitosan

1.6 MCS-PLGA-NPs制備及表征

采用雙重乳化揮發(fā)法(W/O/W)制備MCS-PLGA-NPs，制備方法參考Zhou等[18]所述，并在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)。將1%的PLGA二氯甲烷溶液作為油相O，去離子水為水相W；二者混合冰浴超聲3 min，形成初乳W/O；再將初乳迅速倒入等體積0.5%甘露糖基化殼聚糖溶液和2%PVA溶液中，冰浴超聲5 min，形成復(fù)乳W/O/W；將復(fù)乳置于40 ℃水浴，磁力攪拌4 h揮發(fā)有機(jī)溶劑；4 ℃，12 000 r·min-1離心30 min，收集沉淀，去離子水洗滌2～3次，凍干后-20 ℃ 保存。將得到的MCS-PLGA-NPs重懸于去離子水中，用粒徑儀測(cè)定顆粒的粒徑、zeta電位；再將納米微球稀釋至合適濃度置于銅柱，自然干燥后噴金處理，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.7 MCS-PLGA-NPs吸附質(zhì)粒能力的測(cè)定

稱取適量納米微球至離心管中，與適量質(zhì)粒DNA(1 μg·μL-1)渦旋混勻，使納米微球的質(zhì)量與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量比(w∶w)分別為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1和100∶1，室溫孵育30 min。將各質(zhì)量比的樣品進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察納米微球與質(zhì)粒DNA的結(jié)合情況。

1.8 MCS-PLGA-NPs結(jié)合質(zhì)粒DNA抵抗DNaseⅠ的降解

納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比60∶1進(jìn)行室溫孵育30 min。根據(jù)楊蘊(yùn)琦等[19]所述方法，按以下條件設(shè)置試驗(yàn)組：M組，裸質(zhì)粒DNA；1組，裸質(zhì)粒DNA+DNaseⅠ；2組，納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA；3組，納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA +0.5%SDS處理；4組，納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA+DNase Ⅰ處理后再用0.5%SDS處理組。然后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.9 MCS-PLGA-NPs細(xì)胞毒性的檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)MCS-PLGA-NPs細(xì)胞毒性。將RAW264.7細(xì)胞接種至96孔板中，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；用DMEM將納米微球稀釋至濃度為100、80、60、40、20和10 μg·mL-1的混懸液，加至96孔板中，100 μL·孔-1，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，每組重復(fù)6次，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；加入CCK-8,10 μL·孔-1，繼續(xù)培養(yǎng)1 h；酶標(biāo)儀檢測(cè)OD450 nm值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)]×100%

A(加藥)：具有細(xì)胞、CCK8溶液和藥物溶液的孔的吸光度；

A(空白)：具有培養(yǎng)基和CCK8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度；

A(0加藥)：具有細(xì)胞、CCK8溶液而沒有藥物溶液孔的吸光度。

1.10 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物的攝取

采用激光共聚焦試驗(yàn)觀察巨噬細(xì)胞對(duì)MCS-PLGA-NPs-質(zhì)粒DNA復(fù)合物的攝取。質(zhì)粒DNA用熒光素Cy3標(biāo)記，然后將Cy3標(biāo)記的質(zhì)粒與納米微球以60∶1的質(zhì)量比結(jié)合后，納米微球-DNA復(fù)合物與RAW264.7細(xì)胞共同孵育30 min，激光共聚焦觀察質(zhì)粒與納米微球的結(jié)合情況以及細(xì)胞對(duì)納米微球-DNA復(fù)合物的攝取情況。

1.11 MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物在RAW264.7細(xì)胞中的表達(dá)驗(yàn)證

將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7接種至12孔板，細(xì)胞密度約為5×105個(gè)·孔-1，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，將MCS-PLGA-NPs與真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB按方法“1.7”中獲得的最適吸附效率結(jié)合與RAW264.7細(xì)胞共孵育，同時(shí)將空白細(xì)胞作為陰性對(duì)照。24 h后棄掉培養(yǎng)基，每孔加入500 μL 4%多聚甲醛，室溫固定15 min，1×PBS溶液洗滌3次，每次5 min；加入300 μL DAPI溶液，室溫染色8 min，1×PBS溶液洗滌3次，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。然后收取、處理表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞樣品，用抗FMDV的兔源特異性多克隆抗體對(duì)表達(dá)的重組TB蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05差異為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 含綠色熒光蛋白基因的重組A/FMDV TB表位基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

對(duì)獲得的真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，載體片段大約5 kb，目的基因片段大小約為597 bp，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。

1.重組質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB；2.重組質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB Hind Ⅲ和SalⅠ的雙酶切鑒定；M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1.pBudCE4.1-EGFP-TB;2.pBudCE4.1-EGFP-TB digested with HindⅢ and SalⅠ;M.DL5000 DNA marker圖3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pBudCE4.1-EGFP-TB的酶切鑒定Fig.3 The identification of plasmid pBudCE4.1-EGFP-TB by double enzyme digestion

2.2 甘露糖基化殼聚糖的獲得

假設(shè)殼聚糖的去乙酰度為X%，乙酰度為Y%，

則X%+Y%=1

(式1)

設(shè)此時(shí)殼聚糖的C元素(分子量12)與N元素(分子量14)的質(zhì)量比為A，去乙?；奶窃?個(gè)C原子，非去乙?；奶窃瓌t有8個(gè)C原子，則

A=(6*X%*12+8*Y%*12)/[14*(X%+Y%)]

(式2)

當(dāng)甘露糖修飾后，設(shè)C元素與N元素的質(zhì)量比為A’，取代值為Z%，去乙?；奶窃?個(gè)C原子，非去乙酰基的糖原有8個(gè)C原子，甘露糖修飾的糖原則有12個(gè)C原子，則

A’=[ 6*(X-Z)%*12+12*Z*12+8*Y%*12]/[14*((X-Z)%+Z%+Y%)]

(式3)

將式3化簡(jiǎn)得到取代值的計(jì)算式為

Z%=(14A’+24*X%-96)/72

(式4)

將元素分析測(cè)得的數(shù)值與殼聚糖去乙酰度代入(式4)即可計(jì)算出甘露糖修飾的殼聚糖衍生物的取代值。得到4批甘露糖修飾的殼聚糖衍生物，取代值分別為10.60%、6.33%、6.72%和7.89%，見表2。

表2 元素分析測(cè)得的衍生物N、C、H的數(shù)值Table 2 Derivatives N,C,H values measured by elemental analysis

2.3 MCS-PLGA-NPs制備及表征

制備的納米微球在納米粒度儀下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得其平均粒徑分布在255 nm，見圖4A，分散系數(shù)PDI為0.213，分散性良好，平均zeta電位為+19.9 mV，見圖4B，表明納米微球在水溶液狀態(tài)下具有結(jié)合帶負(fù)電荷質(zhì)粒DNA的能力。掃描電鏡下觀察，納米顆粒呈均一的球形，表面略微粗糙，粒徑大小為100～300 nm，與動(dòng)態(tài)光散射測(cè)定的粒徑分布一致，見圖5。

A.MCS-PLGA-NPs粒徑分布圖；B.MCS-PLGA-NPs zeta電位圖A.Size distribution of MCS-PLGA-NPs；B.Zeta potential of MCS-PLGA-NPs圖4 MCS-PLGA-NPs粒徑分布和zeta電位Fig.4 Size distribution and zeta potential of MCS-PLGA-NPs

圖5 MCS-PLGA-NPs掃描電鏡圖Fig.5 SEM of MCS-PLGA-NPs

2.4 MCS-PLGA-NPs吸附質(zhì)粒能力的測(cè)定

凝膠電泳結(jié)果顯示，MCS-PLGA-NPs吸附質(zhì)粒的能力隨其質(zhì)量的增加而增加。當(dāng)納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比60∶1時(shí)，質(zhì)粒DNA能完全結(jié)合在納米微球上，見圖6。因而，選擇納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為60∶1作為后續(xù)試驗(yàn)的最佳結(jié)合比。

M.質(zhì)粒DNA；1.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為20∶1；2.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為40∶1；3.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為60∶1；4.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為80∶1；5.納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為100∶1M.Plasmid DNA;1:The mass ratio of nanospheres to plasmid DNA is 20∶1；2.The mass ratio of nanospheres to plasmid DNA is 40∶1；3.The mass ratio of nanospheres to plasmid DNA is 60∶1；4.The mass ratio of nano-microspheres to plasmid DNA is 80∶1；5.The mass ratio of nanospheres to plasmid DNA is 100∶1圖6 MCS-PLGA-NPs吸附質(zhì)粒能力的凝膠電泳圖Fig.6 Gel electrophoresis of plasmid adsorption capacity of MCS-PLGA-NPs

2.5 MCS-PLGA-NPs結(jié)合質(zhì)粒DNA抵抗DNaseⅠ的降解能力

瓊脂糖凝膠阻滯試驗(yàn)表明，當(dāng)納米微球與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比60∶1時(shí)，通過靜電吸附的質(zhì)粒DNA完全結(jié)合在納米顆粒上(組2)。即使在電場(chǎng)條件下，帶負(fù)電的質(zhì)粒DNA也很難從納米顆粒上解離下來，納米微球-DNA復(fù)合物完全被滯留在加樣孔中(組2)；納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA+SDS處理組表明，陰離子活性劑SDS能使質(zhì)粒DNA從納米微球上解離下來(組3)；納米微球結(jié)合質(zhì)粒DNA + DNase Ⅰ處理后再用SDS處理組表明，質(zhì)粒DNA結(jié)合在納米微球上可以在一定程度上抵抗DNase Ⅰ的降解(組4)。詳見圖7。

-.沒有；+.有；M.質(zhì)粒DNA；1.DNaseⅠ處理的質(zhì)粒DNA；2.MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物(w∶w=60∶1)；3.經(jīng) 0.5%SDS處理的納米微球-DNA復(fù)合物；4.DNaseⅠ處理過的納米微球-DNA復(fù)合物，再經(jīng)0.5%SDS處理后的上清-.Indicates no;+.Indicates yes;M.Plasmid DNA；1.Plasmid DNA digested with DNaseⅠ；2.MCS-PLGA-NPs-DNA complex (w∶w=60∶1)；3.Nanosphere-DNA complex treated with 0.5% SDS；4.The supernatant of nanosphere-DNA complex digested with DNaseⅠand then treated with 0.5% SDS圖7 MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物抵抗核酸酶降解的凝膠電泳圖Fig.7 Gel electrophoresis of MCS-PLGA-NPs-DNA complex resist degradation by DNase Ⅰ

2.6 MCS-PLGA-NPs細(xì)胞毒性的檢測(cè)

CCK8試驗(yàn)結(jié)果顯示，10 μg·mL-1組與60 μg·mL-1組的MCS-PLGA-NPs與RAW264.7細(xì)胞孵育24 h后，對(duì)細(xì)胞存活率影響無明顯變化(P=0.121 2)。雖然100 μg·mL-1組與10 μg·mL-1組的納米微球?qū)?xì)胞存活率影響有顯著性差異(P<0.01)，但該組細(xì)胞存活率仍能達(dá)到85%以上，表明MCS-PLGA-NPs毒性較低。見圖8。

NS.無顯著差異；*.P<0.05；**.P<0.01NS.No significant difference；*.P<0.05；**.P<0.01圖8 MCS-PLGA-NPs的細(xì)胞毒性Fig.8 Cytotoxicity of MCS-PLGA-NPs

2.7 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7對(duì)MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物的攝取

質(zhì)粒DNA被熒光素Cy3標(biāo)記后，按照MCS-PLGA-NPs與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比為60∶1進(jìn)行室溫結(jié)合30 min，然后與RAW264.7細(xì)胞共孵育30 min。激光共聚焦結(jié)果表明，Cy3熒光質(zhì)粒DNA成功吸附在MCS-PLGA-NPs表面并且小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7能很好地?cái)z取微球-質(zhì)粒DNA復(fù)合物。詳見圖9。

A.MCS-PLGA-NPs結(jié)合未被Cy3標(biāo)記的質(zhì)粒DNA激光共聚焦圖像；B.MCS-PLGA-NPs結(jié)合被Cy3標(biāo)記的質(zhì)粒DNA激光共聚焦圖像；DIC.明場(chǎng)；Cy3.經(jīng)Cy3標(biāo)記的質(zhì)粒DNA在綠色激光器下的狀態(tài)；DAPI.經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞核；MERGE.DIC、Cy3、DAPI的疊加圖A.Confocal laser image of MCS-PLGA-NPs combined with plasmid DNA not labeled with Cy3；B.Confocal laser image of MCS-PLGA-NPs combined with plasmid DNA labeled with Cy3；DIC.Bright field；Cy3.The state of the Cy3-labeled plasmid DNA under the green laser；DAPI.DAPI-stained cell nucleus；MERGE.Overlay images of DIC,EGFP,and DAPI in three states圖9 RAW264.7細(xì)胞攝取MCS-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物激光共聚焦圖像Fig.9 Confocal laser images of MCS-PLGA-NPs-DNA complex were captured by RAW264.7 cells

2.8 MCS-PLGA-NPS加載的質(zhì)粒DNA在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中的表達(dá)

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，綠色熒光蛋白正確表達(dá)，表明MCS-PLGA-NPs具有脂質(zhì)體類似的性質(zhì)，可以攜帶質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞表達(dá)。詳見圖10。為了進(jìn)一步確定重組蛋白TB的表達(dá)，用抗FMDV的兔源特異性多克隆抗體對(duì)TB蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，得到目的蛋白大小約22 ku，見圖11。結(jié)果表明，重組蛋白TB在RAW264.7中進(jìn)行了表達(dá)。

A.空白細(xì)胞熒光顯微鏡圖像；B.MCA-PLGA-NPs-DNA復(fù)合物與細(xì)胞共孵育后24 h熒光顯微鏡圖像；DIC.明場(chǎng)；EGFP.表達(dá)的綠色熒光蛋白；DAPI.經(jīng)DAPI染色的細(xì)胞核；MERGE.DIC、EGFP、DAPI三種狀態(tài)下的疊加圖A.Fluorescence microscope image of blank cells；B.Fluorescence microscope image of MCA-PLGA-NPs-DNA complexes incubated with cells for 24 hours；DIC.Bright field；EGFP.Expressed green fluorescent protein；DAPI.DAPI stained cellular nucleus；MERGE.Overlay images of DIC,EGFP,and DAPI in three states圖10 MCS-PLGA-NPs吸附的DNA在細(xì)胞中的表達(dá)Fig.10 Expression of DNA adsorbed by MCS-PLGA-NPs in cells

1.陰性對(duì)照；2～4.TB蛋白1.Negative control；2-4.TB protein圖11 兔源FMDV多克隆抗體對(duì)TB蛋白進(jìn)行Western blot鑒定Fig.11 Identification of TB protein by Western blot with rabbit FMDV polyclonal antibody

3 討 論

核酸疫苗的低免疫原性一直是其應(yīng)用的主要限制，許多策略已經(jīng)被研究來提高疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答效力[20]。陽離子殼聚糖以其良好的生物性能被廣泛應(yīng)用于DNA[17,20-21]、RNA[22-24]的遞送。本試驗(yàn)利用陽離子殼聚糖表面易被修飾的特點(diǎn)，將一定量的小分子甘露糖通過化學(xué)反應(yīng)連接到殼聚糖表面，模擬機(jī)體識(shí)別病原的模式，利用非病毒載體達(dá)到抗原的靶向遞送。研究發(fā)現(xiàn)甘露糖受體介導(dǎo)的抗原攝取與未經(jīng)甘露糖受體識(shí)別的抗原相比，將抗原遞呈到T細(xì)胞的效率提高了大約100倍[25]，這就意味著在短時(shí)間內(nèi)抗原遞呈細(xì)胞可以攝取更多的抗原來激發(fā)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。最近的研究表明，殼聚糖納米顆粒還具有逃逸溶酶體的能力，使抗原免受溶酶體酸性環(huán)境的破壞[26]，抗原利用水平大幅提高。

殼聚糖表面較高的甘露糖修飾度，會(huì)使殼聚糖表面的伯氨基集團(tuán)減少，這導(dǎo)致殼聚糖納米微球難以制備和被細(xì)胞攝取[27]，甘露糖取代度在4%～21%不影響殼聚糖成球，并且能很好地發(fā)揮修飾后的免疫功能作用[28-30]。在本研究中，甘露糖的取代度在5%～10%,并且利用表面帶負(fù)電荷的PLGA作為陽離子殼聚糖納米微球的內(nèi)核，更利于殼聚糖納米微球的形成。除此之外，帶負(fù)電荷的核酸吸附在殼聚糖的表面會(huì)占據(jù)一定的氨基，與甘露糖取代殼聚糖表面的伯氨基共同作用，減弱殼聚糖正電荷的性能?；谝陨峡紤]，選用低取代度的甘露糖基用以試驗(yàn)的驗(yàn)證研究。

本研究通過超聲乳化揮發(fā)的方法制備MCS-PLGA-NPs，然后將質(zhì)粒DNA通過靜電作用吸附在其表面。在先前的研究中，Zhao等[31]利用超聲乳化揮發(fā)的方法將新城疫病毒DNA疫苗作為水相包裹在殼聚糖PLGA納米微球的內(nèi)部，得到納米微球直徑為699.1 nm±5.2 nm，包封率為98.1%，zeta電位為+6.35 mV并且可以緩慢釋放包裹的DNA。Lebre等[20]在其研究中表明，質(zhì)粒DNA是以靜電吸附的方式結(jié)合在了殼聚糖納米微球的表面。事實(shí)上，質(zhì)粒DNA確實(shí)以靜電吸附的方式結(jié)合在殼聚糖納米微球的表面。殼聚糖是幾丁質(zhì)脫乙?；玫降漠a(chǎn)物，這就使得殼聚糖本身含有大量的伯氨基。在水溶液狀態(tài)下，殼聚糖表面帶有大量的正電荷，即使殼聚糖包裹了水溶液狀態(tài)下帶有負(fù)電荷的PLGA，所制得納米微球的Zeta電位值仍然很高。Zhao等所制備的殼聚糖PLGA-DNA復(fù)合物zeta電位低的原因可能是除了包裹在納米微球內(nèi)部的DNA，還存在部分質(zhì)粒DNA吸附或包埋在納米微球的表面。在疫苗遞送中，殼聚糖納米微球的直徑越小越容易進(jìn)入細(xì)胞，從而提高核酸疫苗的遞送效率。采用Zhao等的方法(超聲功率50 W)得到的納米微球粒徑過大，雖然可以通過增大超聲功率來改變微球大小，但是，過大的超聲功率會(huì)大大損傷質(zhì)粒DNA(質(zhì)粒250 W功率超聲1 min即可全部斷裂，結(jié)果未展示)。綜合以上考慮，本研究先制備粒徑較小的MCS-PLGA-NPs，然后再將質(zhì)粒DNA吸附其表面。

諸多文獻(xiàn)報(bào)道殼聚糖納米粒子吸附質(zhì)粒DNA后形成的殼聚糖-DNA復(fù)合物可以使DNA免受DNase I的降解[32-35]。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，將其保護(hù)質(zhì)粒DNA免受DNase I的降解的原理解釋為：DNA與殼聚糖形成殼聚糖-DNA復(fù)合物時(shí)，DNA包裹在殼聚糖內(nèi)部和包埋在殼聚糖表面，使DNA免受DNase I損壞。而在本研究中，質(zhì)粒DNA不參與納米微球制備的過程，通過吸附在殼聚糖表面也能對(duì)質(zhì)粒DNA抵抗DNase I降解產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。對(duì)此現(xiàn)象的猜測(cè)：殼聚糖是一種帶有大量正電荷的二元線形聚合物，通過靜電力作用，DNA吸附在殼聚糖表面，類似鑲嵌，使DNA免受DNase I的降解。詳見圖12。

A.DNA包裹和包埋在殼聚糖粒子中；B.DNA鑲嵌在殼聚糖PLGA納米微球上A.DNA is wrapped and embedded in chitosan particles;B.DNA is embedded in chitosan PLGA nanospheres圖12 質(zhì)粒DNA免受DNase I的降解的原理Fig.12 Principle of protecting plasmid DNA from degradation by DNase I

殼聚糖作為一種非病毒基因傳遞系統(tǒng)受到研究人員的關(guān)注，但由于帶負(fù)電荷的DNA與帶正電荷殼聚糖之間存在較強(qiáng)的相互作用，其轉(zhuǎn)染效率較低[20]。這種低轉(zhuǎn)染效率又可以解釋為含有大量DNA的殼聚糖粒子在細(xì)胞表面附著不良、殼聚糖-DNA復(fù)合物無法逃逸溶酶體降解以及DNA從殼聚糖粒子中釋放不佳[20]。目前研究表明，載體和質(zhì)粒DNA之間平衡和適度的相互作用是成功轉(zhuǎn)染的因素之一，負(fù)電荷成分的加入可能有利于提高轉(zhuǎn)染效率[36-38]。海藻酸鹽[36]、聚谷氨酸[37-38]、人血清白蛋白[20]的加入降低了殼聚糖與DNA的相互作用強(qiáng)度，從而提高了轉(zhuǎn)染效率。本研究中，加入帶負(fù)電荷的PLGA作為殼聚糖納米微球的內(nèi)核與低甘露糖修飾共同作用可能也有助于提高殼聚糖遞送系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率(未驗(yàn)證)?？傊髡叱晒χ苽淞薓CS-PLGA-NPs并利用其加載FMDV核酸疫苗在細(xì)胞中進(jìn)行成功表達(dá)，為FMDV核酸疫苗的遞送研究提供了新的方向和見解，也為該遞送載體攜帶特定抗原靶向APCs表面甘露糖受體以及應(yīng)用于動(dòng)物免疫的研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

成功制備了MCS以及MCS-PLGA-NPs；明確了MCS-PLGA-NPs與質(zhì)粒DNA質(zhì)量比60∶1時(shí)，吸附效果最好；MCS-PLGA-NPs加載FMDV核酸疫苗可以在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。本研究為后續(xù)FMDV核酸疫苗的遞送研究奠定了基礎(chǔ)。