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    基于糞便樣本的野生犬科動物物種鑒別與棘球絳蟲感染調(diào)查

    2021-12-31 01:08:58尚婧曄張光葭丹巴澤里喻文杰沈蕓舟
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報 2021年12期
    關(guān)鍵詞:糞樣犬科棘球

    尚婧曄,張光葭,丹巴澤里,王 奇,喻文杰,何 偉,廖 沙,沈蕓舟,黃 燕*,王 謙,鐘 波,劉 陽*

    (1.四川省疾病預(yù)防控制中心,成都 610041;2.甘孜藏族自治州州疾病預(yù)防控制中心,康定 626099;3.涼山彝族自治州疾病預(yù)防控制中心,西昌 615000)

    犬科動物是棘球絳蟲的主要終末宿主和傳染源。了解犬科動物感染蟲種及其感染水平,可以明確不同終末宿主在棘球蚴病傳播中所起作用和風(fēng)險程度,為棘球絳蟲終末宿主的防控提供重要的策略依據(jù)。由于樣本獲取困難、檢測方法有限,長期以來,包括流浪犬在內(nèi)的棘球絳蟲野外終宿主感染水平的調(diào)查始終是一個棘手的問題。出于對野生動物保護(hù)和食肉動物危險性的考慮,早期采用的捕殺剖檢或藥物導(dǎo)泄收集蟲體的方法已經(jīng)不再適用。非損傷性采樣的糞樣檢測是目前最具有操作性的方法。與家犬不同,野外動物糞樣為野外撿拾,來源并不明確。不同動物糞便雖然具有一定的外觀形態(tài)特征,但單憑眼觀鑒別其來源,仍可能出現(xiàn)偏差。簡單進(jìn)行病原檢測而不對樣本來源進(jìn)行準(zhǔn)確辨識,很可能會因?yàn)榧{入其他非目標(biāo)宿主樣本而造成檢測陽性率遠(yuǎn)低于實(shí)際感染率,或掩蓋單一宿主的高感染率,難以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行樣本的溯源極為重要。

    目前,國內(nèi)棘球絳蟲終末宿主種類分子鑒別的研究不多,且主要集中于單一屬內(nèi)物種的鑒別[1-2]。線粒體DNA(mtDNA)因具有多拷貝、變異快、缺乏重組、分子量小等特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于各種動、植物的分子鑒定和分類,已證實(shí)對多種哺乳動物具有良好的區(qū)分效果[3-6]。本研究以采集自棘球絳蟲高流行區(qū)野外環(huán)境中的犬科動物糞便為樣本,以mtDNA控制區(qū)(D-loop)基因?yàn)榉肿訕?biāo)記,對不同犬科動物同源序列進(jìn)行比對分析,探索mtDNA D-loop高變區(qū)序列用于棘球絳蟲主要終末宿主鑒別的可能性,同時,通過糞-抗原檢測,對樣本棘球絳蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查。

    1 材料與方法

    1.1 樣本來源

    本研究檢測糞樣101份,于2016年采集自甘孜州石渠縣真達(dá)、呷依、格孟3鄉(xiāng)的野外環(huán)境,包括居民定居點(diǎn)周圍和狐貍、狼等棘球絳蟲野外終末宿主洞穴口及經(jīng)常出沒的區(qū)域。根據(jù)糞樣外觀形態(tài)和采集地點(diǎn),對糞樣來源宿主種類進(jìn)行初步鑒定,將采集的樣本分為3組:1)疑似狼糞樣32份,主要采自狼洞口和高山、半高山牛、羊、藏原羚等大型哺乳動物活動較多的地方,糞便較粗長,顏色泛白,帶有少量動物長毛發(fā)和較多、較大的動物骨頭;2)疑似狐糞樣30份,主要采自狐洞口和半高山、沿河高原草甸高原鼠兔、青海田鼠等小型哺乳動物活動頻繁的地區(qū),糞便較細(xì)長,呈灰黑色,帶有較多動物短毛發(fā);3)疑似犬糞樣本39份,主要采自定居點(diǎn)周邊高原鼠兔、青海田鼠等小型哺乳動物活動較多的地區(qū),糞便粗細(xì)、長短多介于狼和狐之間,呈棕黑或灰黑色,帶有動物短毛發(fā)。

    所有樣本于-80 ℃冷凍保存1個月以上,以滅活蟲卵。

    1.2 主要試劑和儀器

    主要使用試劑包括QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qiagen,Germany),GoTaq G2 Hot Start Master Mixes(Promega,USA),犬糞包蟲抗原檢測試劑盒(深圳市康百得生物科技有限公司,中國)。主要使用儀器包括AB2720 PCR儀(Applied Biosystems,USA),電泳儀(BioRad,USA),凝膠成像儀(BioRad,USA),電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠,中國)。

    1.3 基因組DNA提取

    參考文獻(xiàn)[1]方法對糞樣中可能存在的宿主腸道脫落組織、細(xì)胞碎片等進(jìn)行富集處理后,按照糞便DNA提取試劑盒操作說明提取糞樣基因組DNA,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 宿主物種鑒別

    1.4.1 PCR擴(kuò)增和測序 參考文獻(xiàn)[7]合成用以擴(kuò)增哺乳動物mtDNA D-loop區(qū)的通用引物L(fēng)15995:5′ -CTCCACTATCAGCACCCAAAG-3′,H16498:5′-CCTGAAGTAAGAACCAGATG-3′。PCR反應(yīng)體積為25 μL,包含1×GoTaq G2 Hot Start Master Mixes,上下游引物0.4 μmol·L-1,DNA模板20~50 ng。擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送擎科生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序。

    1.4.2 序列分析 所獲序列經(jīng)DNAStar軟件進(jìn)行自動雙向拼接并加以適當(dāng)手動調(diào)整后,采用ClustalX2軟件[8]進(jìn)行多重比對。使用DnaSP5軟件[9]分析序列單倍型與變異位點(diǎn)。將單倍型序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表物種序列進(jìn)行BLAST比對。利用MEGA7軟件[10]計(jì)算基于Kimura-2-parameter模型(K2P)的遺傳距離,同時以小家鼠(Musmusculus)為外群,采用最大似然法(Maximum Likehood,ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.5 棘球絳蟲抗原檢測

    1.5.1 糞-抗原檢測 糞樣經(jīng)適當(dāng)搗碎處理后,按照犬糞包蟲抗原檢測試劑盒操作說明,采用ELISA夾心法對糞樣中棘球絳蟲抗原進(jìn)行檢測。

    1.5.2 數(shù)據(jù)處理 采用EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用χ2檢驗(yàn)對不同來源樣本棘球絳蟲抗原陽性率差異進(jìn)行比較。

    2 結(jié) 果

    2.1 宿主物種鑒別

    2.1.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 提取的101份糞樣DNA中有74份擴(kuò)增出目的條帶,PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示在350~400 bp出現(xiàn)清晰的單一條帶,擴(kuò)增產(chǎn)物可用于后續(xù)測序分析,樣本檢測成功率為73.27%(圖1)。

    2.1.2 序列變異與單倍型分析 所獲74條序列經(jīng)比對、剪切后,最終整理為297 bp的同源序列(GenBank登錄號:MZ189011~MZ189084),定義單倍型20個,根據(jù)序列堿基差異大小,分為4個單倍型集合,其中單倍型H1~H6核苷酸變異位點(diǎn)13個,6個單倍型間堿基差異為1~10個;單倍型H7~H10核苷酸變異位點(diǎn)5個,4個單倍型間堿基差異為1~5個;單倍型H11~H15核苷酸變異位點(diǎn)11個,5個單倍型間堿基差異為1~8個;單倍型H16~H20核苷酸變異位點(diǎn)5個,5個單倍型間堿基差異為2~5個(表1、2)。單倍型集間,以單倍型H1~H6與H7~H10堿基差異最小,平均為17.83,其次為單倍型H11~H15與H16~H20,平均堿基差異為38.64,單倍型H1~H6、H7~H10與單倍型H11~H15、H16~H20間堿基差異較大,平均為64.85~70.10。

    表1 單倍型H1~H10線粒體控制區(qū)基因變異位點(diǎn)Table 1 Mutation sites in the mtDNA control region of H1-H10

    2.1.3 序列相似度比對 經(jīng)Blast比對,所有單倍型序列均與GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的單一物種同源序列高度相似,對比結(jié)果分別為犬(Canislupusfamiliaris)、灰狼(Canislupus)、紅狐(Vulpesvulpes)和藏狐(Vulpesferrilata)4種犬科動物(表3)。

    表3 單倍型序列BLAST比對結(jié)果Table 3 BLAST results of the haplotype sequences

    1~9.檢測的糞便樣本;M.DL5000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);N.無模板對照1-9.Fecal samples detected in the study;M.DL5000 DNA molecular weight markers;N.No template control圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The results of the PCR amplification

    表2 H11~H20線粒體控制區(qū)基因變異位點(diǎn)Table 2 Mutation sites in the mtDNA control region of H11-H20

    2.1.4 遺傳距離分析 基于K2P模型的遺傳距離分析結(jié)果顯示,20個單倍型之間遺傳距離為0.004~0.354。4個單倍型集間遺傳距離遠(yuǎn)大于各集合內(nèi)單倍型間遺傳距離;單倍型H1~H6與H7~H10、單倍型H11~H15與H16~H20間遺傳距離較與其他單倍型集間遺傳距離??;單倍型H1~H6、H7~H10、H11~H15、H16~H20分別與犬、灰狼、赤狐和藏狐遺傳關(guān)系最近(表4)。

    表4 基于K2P模型的平均遺傳距離Table 4 Average genetic distance based on the K2P model

    2.1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹表現(xiàn)出明顯的聚類現(xiàn)象,所有單倍型分為兩大支,其中單倍型H7~H10與灰狼參考序列(KT901460)聚集在一起,并與單倍型H1~H6及犬參考序列(JN695048)共處同一大分支;另一大分支是由單倍型H11~H15與赤狐參考序列(KJ846513),以及單倍型H16~H20與藏狐參考序列(JF520840)各自聚集成簇后再形成的一個大支(圖2)。

    2.2 棘球絳蟲感染檢測

    經(jīng)棘球絳蟲糞-抗原ELISA檢測共發(fā)現(xiàn)陽性樣本11份,陽性率為10.89%(11/101)(表5)。

    小于75%的自展值未予顯示Bootstrap values below 75% were not shown圖2 基于線粒體控制區(qū)基因序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 ML tree based on mtDNA control region sequences

    表5 棘球絳蟲糞-抗原ELISA檢測結(jié)果Table 5 The results of copro-antigen ELISA tests for detection of Echinococcus

    3 討 論

    棘球絳蟲終末宿主感染調(diào)查是棘球蚴病監(jiān)測的重點(diǎn),也是防控的難點(diǎn)和薄弱點(diǎn)。糞便作為非損傷性采集樣本,可同時用于來源宿主的物種鑒定和棘球絳蟲的感染檢測,對棘球絳蟲終末宿主,尤其是野生終末宿主的調(diào)查研究具有重要意義。近年來的研究報道中所涉及的野外犬科動物感染調(diào)查均選擇以糞便為樣本,在檢測其內(nèi)棘球絳蟲特異性抗原或核酸的同時,根據(jù)糞樣外形特征來推測其宿主來源[11-12]。本次研究結(jié)果證實(shí),以糞樣形態(tài)特點(diǎn)和采樣環(huán)境來判斷樣本來源動物種類具有一定可行性,但也存在一定的誤差,尤其是犬糞,誤辨率較高。另外,由于眼觀鑒別嚴(yán)重依賴現(xiàn)場人員個人經(jīng)驗(yàn),也極大地限制了該方法的推廣應(yīng)用。本次檢測的101份糞樣中,74份通過糞樣DNA擴(kuò)增、測序和分析,成功實(shí)現(xiàn)對其來源的4種犬科動物的鑒別,結(jié)果表明,分子檢測可有效鑒定糞便樣本來源動物種類,作為形態(tài)判別的修正依據(jù),有效提升鑒定準(zhǔn)確率。另一方面,研究結(jié)果也反映出糞樣檢測的不足,與血液、組織等樣本相比,糞便樣本檢測成功率一般相對較低。本次用于檢測的糞樣為野外撿拾,部分樣本可能因?yàn)槠芈稌r間過長,受到高原陽光爆嗮或雨水沖刷,造成糞樣被某些有抑制作用的成分污染,或其內(nèi)含有的宿主核酸降解,而未能成功擴(kuò)增。研究結(jié)果提示,要進(jìn)一步提升樣本檢出率,應(yīng)盡量采集新鮮糞便用于分子檢測,同時,探索更為有效的目的成分富集前處理方法。

    mtDNA目前被廣泛應(yīng)用于物種鑒定、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生等研究,以cox1、細(xì)胞色素b(cytb)等編碼基因?yàn)榇淼腄NA條形碼技術(shù)在嚙齒類、魚類、鳥類等動物識別與分類研究中均取得了較為理想的結(jié)果[13-15]。然而,由于受到選擇壓力的影響,這些編碼基因通常無法有效區(qū)分親緣關(guān)系較近的物種,相較之下,作為mtDNA中唯一的非編碼區(qū)域,D-loop區(qū)因?yàn)槿狈x擇壓力,變異速度較編碼區(qū)基因更快,被認(rèn)為對近緣和近期分化的物種具有更好的分辨能力[7]。本研究對成功擴(kuò)增獲得的74份mtDNA D-loop區(qū)基因片段進(jìn)行了分析,同源序列比對結(jié)果顯示,檢測序列可與GenBank中單一物種序列相匹配,多態(tài)性位點(diǎn)差異與遺傳距離分析結(jié)果與BLAST比對結(jié)果一致,所鑒定的物種間距離遠(yuǎn)大于種內(nèi)距離,滿足物種鑒定的判別條件,系統(tǒng)發(fā)育發(fā)育樹中,鑒別為同一物種的不同單倍型以高自展值進(jìn)行聚類,支持其鑒別結(jié)果,綜合各項(xiàng)分析結(jié)果,可判斷糞樣來源分別為犬、灰狼、赤狐和藏狐4種犬科動物。研究表明,以mtDNA D-loop區(qū)序列分析作為犬科動物糞樣不同物種來源的鑒定依據(jù)具有可行性,該方法對包括狼及其近緣馴化種犬在內(nèi)的棘球絳蟲主要終末宿主均具有較好的辨識能力。

    盡管基于mtDNAD-loop區(qū)對犬科動物的鑒別具有快捷、高效、簡易等優(yōu)點(diǎn),但仍然存在一定的局限性。由于線粒體基因母系遺傳的特點(diǎn),基于mtDNA的分析無法識別自然界中可能偶爾發(fā)生的雜交事件,對沒有生殖隔離的物種間自然交配產(chǎn)生的雜交及其回交子代個體的鑒別存在一定缺陷[16-17]。因此,為進(jìn)一步提高鑒別的準(zhǔn)確度,在對mtDNA D-loop區(qū)堿基序列進(jìn)行分析比較的同時,可結(jié)合常染色體基因的雙親遺傳或Y染色體基因的父系遺傳分子標(biāo)記對物種進(jìn)行鑒別[18-20]。此外,采用微衛(wèi)星標(biāo)記對物種個體進(jìn)行識別分析,可進(jìn)一步排除可能存在的來源于同一宿主的重復(fù)樣本,實(shí)現(xiàn)對棘球絳蟲終末宿主的精準(zhǔn)識別,為棘球絳蟲終末宿主防控提供更為系統(tǒng)、全面的數(shù)據(jù)支撐。

    家犬作為牧區(qū)重要的生產(chǎn)工具和人類的親密伙伴,與其相關(guān)的因素,如家庭是否養(yǎng)犬、犬只數(shù)量、是否與犬親密接觸等,被認(rèn)為是我國棘球蚴病流行區(qū)、尤其是青藏高原地區(qū)棘球絳蟲傳播最重要的風(fēng)險因素[21-23],但自2006年我國棘球蚴病防治項(xiàng)目實(shí)施以來,經(jīng)過近15年以家犬驅(qū)蟲為主的綜合防控,目前各流行區(qū)家犬棘球絳蟲感染率均已出現(xiàn)明顯下降,并維持于較低水平[24-26]。與此同時,流浪犬(無主犬)因其數(shù)量多、流動性大等特點(diǎn),干預(yù)十分困難,其感染控制成效極為有限[27-28],類似地,作為棘球絳蟲的保蟲宿主,狼、狐貍等野生犬科動物感染率也遠(yuǎn)高于家犬[1,11]。本次對糞樣棘球絳蟲抗原檢測結(jié)果顯示,調(diào)查地區(qū)野外犬科動物具有較高的棘球絳蟲抗原陽性率,但相較于此前采用不同檢測方法對該地區(qū)野生犬科動物棘球絳蟲感染情況的調(diào)查結(jié)果,感染率有所下降,這可能是由于各研究項(xiàng)目調(diào)查時間、調(diào)查方法、樣本代表性,以及所涉及宿主種類等的不同而導(dǎo)致[29-31]。由于現(xiàn)有針對野外犬科動物棘球絳蟲感染情況的研究嚴(yán)重不足,依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)難以對當(dāng)?shù)匾巴馊苿游锛蚪{蟲感染水平作出全面的有效推斷,但可以明確的是,在家犬棘球絳蟲感染率得到有效控制的情況下,包括流浪犬在內(nèi)的野外犬科動物所具有的高感染率可能對流行區(qū)棘球絳蟲的傳播起到更大的作用,由其引起人群感染的危害不應(yīng)被忽視。強(qiáng)化宿主物種鑒別與個體鑒定、病原分子檢測等關(guān)鍵技術(shù),開展野外犬科動物棘球絳蟲感染水平監(jiān)測,有針對性地提出對野外犬科動物的防控措施,將有助棘球蚴病下一步防控目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。

    4 結(jié) 論

    通過mtDNA D-loop區(qū)序列分析對野外犬科動物糞便的物種鑒別結(jié)果顯示,成功確定檢測的糞樣分別來自犬、灰狼、赤狐和藏狐4種犬科動物,同時,基于棘球絳蟲糞抗原的檢測發(fā)現(xiàn),樣本來源個體具有較高的棘球絳蟲感染率。研究結(jié)果可為進(jìn)一步提升棘球絳蟲野外終末宿主精準(zhǔn)監(jiān)測質(zhì)量提供技術(shù)依據(jù),作為調(diào)查地區(qū)野生犬科動物棘球絳蟲感染數(shù)據(jù)的更新和補(bǔ)充,為當(dāng)?shù)亻_展棘球絳蟲防控提供數(shù)據(jù)參考。

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