海藻中鉻形態(tài)和含量的檢測分析方法研究

蔣麗琴 蔣 立 馬 偵 蔡 艷,* 鐘鶯鶯 楊震峰 徐新穎

(1 浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100；2 寧波海關技術中心 浙江 寧波 315048)

近年來，隨著現(xiàn)代工業(yè)進程的加快，大量工業(yè)廢水和生活污水排入水環(huán)境中，由此造成近海養(yǎng)殖區(qū)域重金屬污染不斷加劇[1-2]。海藻主要生長和養(yǎng)殖在近海區(qū)域，其生長位置比較穩(wěn)定、移動性差，遇到污染水質(zhì)后暴污時間較長，并且對重金屬的吸附積累能力強，因此極易出現(xiàn)重金屬超標。海藻作為寶貴的海洋資源，不僅具有食用價值，深受消費者的喜愛，而且在海洋藥物、功能食品、生物活性物質(zhì)、動物飼料等領域也有重要的作用，具有很大的應用潛力和極高的經(jīng)濟價值[3-4]。

重金屬鉻(Cr)是海藻中普遍存在的重金屬元素，其相關研究主要集中在殘留量分析、污染狀況評價等方面，且大都針對鉻的總濃度[5-7]。而重金屬元素的生理及毒性作用不僅與其總含量有關，還與其存在的形態(tài)有關。相關研究表明，生物基質(zhì)中鉻一部分與有機配體或蛋白結合形成結合態(tài)，另一部分以游離態(tài)存在[8-9]。游離態(tài)的Cr(Ⅲ)能促進人體葡萄糖、脂肪、蛋白質(zhì)和核酸代謝，對降血糖、降血脂具有良好的作用[10]；而以游離態(tài)形式存在的Cr(Ⅵ)具有較強的氧化潛力，能導致蛋白質(zhì)和DNA損傷，易致癌并誘發(fā)基因突變[10-12]。鉻的形態(tài)和價態(tài)不同，其毒性也存在明顯差異，以鉻的總量來進行評價往往會放大其對人體健康的危害，因此需要對鉻的形態(tài)進行深入研究。本試驗以3種海藻(海帶Laminariajaponica、壇紫菜Porphyrahaitanensis、滸苔Enteromorphaprolifera)為研究對象，考察絡合劑的種類和濃度、流動相的種類和濃度、pH值、溫度及提取方式對海藻中Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的影響；建立同時檢測海藻中Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)形態(tài)的分析方法，以期為海藻中鉻形態(tài)分析方法的建立和鉻形態(tài)含量分析提供基礎理論和方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3種海藻樣品(福建霞浦海帶、江蘇昆山壇紫菜、浙江象山滸苔)購于當?shù)爻校? 000 mg·L-1Cr(Ⅲ)標準品、1 000 mg·L-1Cr(Ⅵ)標準品，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；ProElut C18柱，北京迪馬科技有限公司；吡啶-2,6-二羧酸(2,6-pyrinedicarboxylic acid，PDCA，純度99%)，美國Sigma Aldrich公司；濃硝酸(色譜純)，美國ThermoFisher Scientific公司；甲醇(色譜純)，美國TEDIA公司；乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na，分析純)、氨水(分析純)、過氧化氫(優(yōu)級純)、硝酸銨(分析純)、乙酸銨(分析純)、檸檬酸銨(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

PDCA-硝酸銨溶液的配制：5 mmol·L-1PDCA和50 mmol·L-1硝酸銨的混合溶液，并用氨水調(diào)節(jié)pH值至7.0。

配制0、5.0、10.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg·L-1的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混合標準溶液，用PDCA-硝酸銨溶液定容，混合標準溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 儀器與設備

Agilent 8800型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)，美國Agilent科技公司；UltiMate 3000型高效液相色譜儀-ICAP Q型電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用儀(high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry，HPLC-ICP-MS)、IonPac CG5A(4 mm×50 mm)陽離子色譜柱、ST40R高速冷凍離心機，美國ThermoFisher Scientific公司；Mulitwave PRO微波消解儀，奧地利Anton Paar公司；BHW-09A24S趕酸儀，上海博通化學試劑有限公司；XS205DU分析天平、MPC 227 pH計，瑞士Mettler Toledo公司；CHORUSIa3超純水系統(tǒng)，英國ELGA公司；JFSD 100粉碎機，上海嘉定糧油儀器有限公司；VORTEX-GENIE2可調(diào)速旋渦混合器，美國Scientific Industries公司；SK8210HP超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司；13 mm×0.45 mm水相濾膜，島津(上海)實驗器材有限公司。

1.3 樣品前處理

將海藻樣品(水分含量分別為：海帶13.13%，紫菜14.96%，滸苔17.27%)剪碎后用粉碎機研磨粉碎，充分混勻后備用。

游離態(tài)Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)測定預處理：稱取0.2 g(精確至0.000 1 g)均質(zhì)后的海藻樣品至25 mL容量瓶中，加入5 mmol·L-1PDCA-硝酸銨溶液(pH值7.0)定容至25 mL，40℃超聲10 min，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過C18柱，前2 mL濾液棄去，剩余濾液過0.45 μm濾膜后用HPLC-ICP-MS測定Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的含量。同時做空白試驗。濾液和殘渣同步做總鉻含量測定。

總鉻測定預處理：

海藻樣品總鉻：稱取0.2 g(精確至0.000 1 g)均質(zhì)后的海藻樣品于聚四氟乙烯消解罐中，加入6.0 mL濃硝酸和2.0 mL過氧化氫，放置過夜后于微波消解儀消解，微波消解條件為：10 min內(nèi)由室溫上升至190℃， 并保持15 min至消解結束。冷卻后取出，在趕酸儀(180℃)上加熱至1 mL，冷卻至室溫，用超純水定容至50 mL，混勻后用ICP-MS測定。同時做空白試驗。

游離態(tài)總鉻(濾液)：移取Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)前處理上清液10 mL，加入6.0 mL濃硝酸和2.0 mL過氧化氫，按上述方法進行微波消解后，冷卻并定容，用ICP-MS測定濾液中總鉻含量。

結合態(tài)總鉻(殘渣)：將Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)預處理后殘渣中加入6.0 mL濃硝酸和2.0 mL過氧化氫，按上述方法進行微波消解后，冷卻并定容，用ICP-MS測定殘渣中總鉻含量。

1.4 條件優(yōu)化

1.4.1 絡合劑的選擇及其濃度的優(yōu)化 在均質(zhì)后的海帶樣品中添加一定量的Cr(Ⅲ)，與不同濃度(1、2、5、10 mmol·L-1)的 EDTA和PDCA-硝酸銨溶液(pH值7.0)在40℃條件下分別超聲處理10、20、40、60、80、100和120 min，然后按1.3中的方法進行游離態(tài)Cr(Ⅲ) 前處理和HPLC-ICP-MS含量測定，考察絡合劑類型、濃度和絡合時間對Cr(Ⅲ)絡合效果的影響。

1.4.2 溫度和提取方式的優(yōu)化 在均質(zhì)后的海藻樣品中加入5 mmol·L-1PDCA-硝酸銨溶液(pH值7.0)，在不同溫度(40、50、60、70℃)下分別超聲、水浴處理提取10 min，后按1.3中的方法進行游離態(tài)Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)、游離態(tài)總鉻的前處理和含量測定，考察不同溫度和提取方式對Cr(Ⅲ)的絡合速率、游離態(tài)總鉻含量及Cr(Ⅵ) 與Cr(Ⅲ)轉化的影響。

1.4.3 流動相的選擇及其濃度的優(yōu)化 以相同濃度的硝酸銨，乙酸銨和檸檬酸銨溶液，及不同濃度(25、50、75、100 mmol·L-1)的硝酸銨溶液作為流動相，考察流動相種類和濃度對Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)分離效果的影響。

1.4.4 流動相pH值的優(yōu)化 考察不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5和8.0)的50 mmol·L-1NH4NO3流動相對Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)分離效果的影響。

1.5 最佳儀器進樣條件

采用ICP-MS測定總鉻含量，檢測條件為：射頻功率1 500 W，載氣為高純氬氣，等離子體氣流量15.0 L·min-1， 載氣流量1.10 L·min-1，輔助氣流量0.90 L·min-1， He碰撞模式，氦氣流量4.40×10-3L·min-1，采樣深度7 mm，檢測質(zhì)量數(shù)m/z=52。

采用HPLC-ICP-MS測定Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)含量，HPLC條件：流動相：50 mmol·L-1NH4NO3(pH值7.0，氨水調(diào)節(jié))，流速：0.5 mL·min-1；進樣量：20 μL；ICP-MS條件：射頻功率1 550 W，載氣為高純氬氣，等離子體氣流量14.0 L·min-1，載氣流量：0.8 L·min-1，輔助氣流量0.25 L·min-1，He碰撞模式，氦氣流量4.0×10-3L·min-1， 采樣深度5 mm，檢測質(zhì)量數(shù)m/z=52。

1.6 加標回收試驗

向海帶樣品中分別添加不同濃度梯度(20～300 μg·L-1)的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)標準溶液，然后按1.3的方法進行游離態(tài)Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的加標回收率試驗，各水平重復3次。

2 結果與分析

2.1 前處理與分析條件的優(yōu)化與確定

2.1.1 絡合劑及其濃度 游離態(tài)Cr(Ⅲ)通常以Cr3+、Cr(OH)2+、Cr(OH)2+等陽離子形式存在，Cr(Ⅵ)通常以CrO42-、Cr2O72-、HCrO4-等陰離子形式存在[11,13]。Cr(Ⅲ)配位交換的動力弱，需要絡合形成穩(wěn)定的陰離子才能進行測定。結果顯示，EDTA和PDCA兩種絡合劑在超聲10 min時均可實現(xiàn)完全絡合，說明超聲時間對絡合效率的影響不顯著；在相同濃度時，Cr(Ⅲ)與EDTA及PDCA絡合物的響應值無顯著差異。本試驗以陽離子交換柱作為分析柱，檢測時發(fā)現(xiàn)Cr(Ⅲ)-EDTA絡合物的出峰時間較早(tR=53 s)， 與死時間(t0=46 s)接近，因此，為準確定性分析，后續(xù)試驗采用PDCA作為Cr(Ⅲ)的絡合劑。

當PDCA絡合劑濃度增加時，Cr(Ⅲ)的響應值隨之增大，而當PDCA絡合劑濃度達到10 mmol·L-1時，Cr(Ⅵ)的峰形變寬，分離度降低，影響Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的分離效果。綜合研究結果，選擇PDCA-硝酸銨溶液作為絡合劑的濃度為5 mmol·L-1。

2.1.2 溫度和提取方式 由圖1可知，隨著提取溫度的升高，游離態(tài)總鉻含量略有增加，當溫度達到70℃時，游離態(tài)總鉻含量較40℃時增加了8.57個百分點，這可能是由于溫度升高導致海藻中的結合態(tài)鉻部分釋放出來，轉化為游離態(tài)鉻；Cr(Ⅵ)轉化為Cr(Ⅲ)的比例隨溫度上升趨勢明顯，當溫度從40℃上升至70℃時，Cr(Ⅵ)的轉化率從19.61%增加至48.15%，這與李登科等[14]的研究結果一致，表明升高溫度會提高Cr(Ⅵ)的轉化率。此外，試驗過程中發(fā)現(xiàn)在相同的提取溫度下，超聲提取較水浴震蕩處理下Cr(Ⅲ)絡合的效率更高。因此，選擇40℃超聲對海藻樣品進行前處理。

圖1 溫度對游離態(tài)總鉻和Cr(Ⅵ)轉化的影響Fig.1 Effect of temperature on the increase rate of total soluble Cr and Cr (Ⅵ) conversion

2.1.3 流動相及其濃度 試驗通過HPLC-ICP-MS同時分離并檢測游離態(tài)Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)，因此需選擇能提供分析物所需離子強度，不干擾目標分離物，以及不降低ICP離子化效率的流動相[15]。結果表明，采用乙酸銨和檸檬酸銨作為流動相時，Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的色譜峰峰形拖尾嚴重，且存在相互重疊；選用硝酸銨溶液時，基線平穩(wěn)，能實現(xiàn)Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的有效分離。

流動相的濃度對Cr(Ⅵ)的峰形和信噪比，以及Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的分離度有明顯影響。隨著硝酸銨溶液濃度的增加，色譜峰的響應值增加，而分離度隨之下降，結果如圖2所示。當硝酸銨溶液濃度為75和100 mmol·L-1時，分離度均小于1.5，而當濃度為25 mmol·L-1時，分析時間較長，且色譜峰的響應值較低。因此，選擇50 mmol·L-1硝酸銨作為流動相溶液。

注：A:25 mmol·L-1；B: 50 mmol·L-1；C:75 mmol·L-1；D: 100 mmol·L-1。圖2 流動相濃度對Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)分離度的影響Fig.2 Effect of mobile phase concentration on the resolution of Cr (Ⅲ) and Cr (Ⅵ)

2.1.4 pH值對鉻形態(tài)的影響 Cr(Ⅲ)穩(wěn)定存在于弱酸性環(huán)境中，Cr(Ⅵ)穩(wěn)定存在于中性或弱堿性溶液中[16]，因此pH值會影響Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)形態(tài)之間的轉化。由圖3可知，隨著流動相pH值的增大，Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的分離度呈先增后減的趨勢，在pH值為7.0時，分離度達到最佳(分離度為3.14)。因此，流動相的pH值選擇7.0。

圖3 不同pH值對Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)分離度的影響Fig.3 Effect of different pH value on separation of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ)

此外，由于PDCA溶液呈酸性，將其直接作為絡合劑加入海藻樣品中，易使Cr(Ⅵ)向Cr(Ⅲ)轉化。因此，本試驗通過用氨水調(diào)節(jié)PDCA-硝酸銨溶液的pH值至7.0，使海藻樣品中鉻形態(tài)保持在其初始形態(tài)下，從而實現(xiàn)對鉻的各種形態(tài)進行準確定量。

2.2 工作曲線和方法檢出限

由表1可知，以Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的質(zhì)量濃度X和響應值Y繪制標準曲線。其中標準曲線的線性范圍在0～500 μg·L-1之間，相關系數(shù)均為0.999 9。以3倍信噪比計算檢出限，得到Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的最小質(zhì)量濃度檢出限分別為0.015和0.003 μg·g-1，以10倍信噪比計算定量限，得到Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的最小質(zhì)量濃度定量限分別為0.049和0.011 μg·g-1。

表1 Cr(Ⅲ) 和Cr(Ⅵ)的線性方程、檢出限及定量限Table 1 Linear equations and detection limit of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ)

2.3 加標回收率測定

不同Cr(Ⅲ)含量的添加水平下，Cr(Ⅲ)的加標回收率如圖4所示，當加標量為20～80 μg·L-1時，回收率在40.88%～49.75%之間；隨著Cr(Ⅲ)加標量增加，Cr(Ⅲ)的回收率隨之上升，當加標量增加至100～300 μg·L-1時，回收率基本穩(wěn)定在71.43%～107.98%之間，相對標準偏差在0.61%～9.12%之間。

圖4 不同添加水平下Cr(Ⅲ)的加標回收率Fig.4 Recoveries of Cr(Ⅲ) at different spiking levels

如表2所示，在Cr(Ⅵ)的加標回收試驗中，隨著Cr(Ⅵ)加標量的增加，Cr(Ⅲ)的檢出含量也呈遞增趨勢，綜合Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的含量，Cr總回收率基本穩(wěn)定在67.04%～79.48%之間。此外，對比Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的含量發(fā)現(xiàn)，添加Cr(Ⅵ)的轉化率在15.93%～23.51%之間，平均轉化率為19.60%，說明在海藻基質(zhì)中添加的部分Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)。

表2 Cr(Ⅵ)加標回收數(shù)據(jù)Table 2 Recovery data of Cr(Ⅵ)

2.4 實際樣品的測定

由圖5可知，本試驗建立的方法分離度高、基線穩(wěn)定，且無雜峰干擾。由表3可知，除滸苔樣品中總鉻含量略高于我國現(xiàn)行GB 2762-2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》[17]中總鉻的限值要求(2.0 mg·kg-1) 外，海帶和紫菜樣品中總鉻的含量均低于限值標準。在3種海藻樣品中，結合態(tài)和游離態(tài)鉻的含量相加與總鉻含量基本相等，說明海藻中的鉻主要以這2種形式存在，且以結合態(tài)鉻為主，占81.12%～93.18%，其中滸苔中結合態(tài)鉻的占比最高；此外，游離態(tài)鉻含量與Cr(Ⅲ)含量無明顯差異，說明游離態(tài)鉻主要以無毒的Cr(Ⅲ)形式存在，Cr(Ⅵ)檢測含量均低于檢出限，表明海藻中基本不存在Cr(Ⅵ)。

表3 3種海藻樣品中鉻形態(tài)含量Table 3 Chromium speciation in three seaweed samples

注：A:混合標準溶液；B:海帶；C:紫菜；D:滸苔。Note: A:Standard solution. V:Laminaria japonica.C: Porphyra haitanensis. D:Enteromorpha prolifera.圖5 Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)標準溶液和3種海藻樣品色譜圖Fig.5 Chromatogram of Cr(Ⅲ) and Cr(Ⅵ) in standard and three seaweed samples

3 討論

目前，在環(huán)境樣品如水樣[18-20]及土壤[21-22]中Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的形態(tài)分析研究較多，由于其基質(zhì)相對簡單，鉻形態(tài)的轉化受提取過程的影響較??；而在食品尤其是海產(chǎn)品中，由于樣品基質(zhì)復雜、干擾物質(zhì)多，在提取過程中易破壞鉻的初始形態(tài)從而無法對其各形態(tài)進行準確定量。樊祥等[23]和Sadeghi等[24]通過先絡合樣品中Cr(Ⅲ)或Cr(Ⅵ)，后采用差減法獲得另一形態(tài)鉻的含量，無法同時測定Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)。本試驗通過優(yōu)化前處理條件，以中性PDCA(pH值7.0)溶液作為絡合劑，中性硝酸銨溶液(pH值7.0)作為流動相，保證了提取和檢測過程中鉻的形態(tài)分配不發(fā)生變化，從而準確定量Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)。

本研究結果表明，在不同Cr(Ⅲ)含量的添加水平下，Cr(Ⅲ)的加標回收率存在差異，這可能是由于海藻細胞壁主要由肽聚糖、磷脂和蛋白質(zhì)組成，帶有一定的負電荷，有許多與金屬離子結合的官能團[25-27]，當加入少量Cr(Ⅲ)時(20～80 μg·L-1)，部分Cr(Ⅲ)被迅速結合，形成穩(wěn)定的結合態(tài)鉻，而PDCA類絡合劑只能絡合游離態(tài)的鉻，因此Cr(Ⅲ)的檢出量明顯低于加入量，回收率約為50%；而當Cr(Ⅲ)添加量逐漸增加時(100～300 μg·L-1)，海藻中的官能團與Cr(Ⅲ)已趨于飽和，因此其回收率良好。李靜等[28]在乳制品中添加0.2～0.8 mg·L-1Cr(Ⅲ)，其添加量遠高于本試驗的添加范圍，因此其回收率穩(wěn)定在96.4%～102.7%之間。

在Cr(Ⅵ)加標回收試驗中發(fā)現(xiàn)，添加Cr(Ⅵ)中約有20%轉化為Cr(Ⅲ)，大量研究均發(fā)現(xiàn)類似的轉化現(xiàn)象，如煙草[14]、茶湯[29]、乳制品[30]等相關基質(zhì)中Cr(Ⅵ)的轉化率接近100%，而在鮸魚[15]和雞組織樣品[31]中Cr(Ⅵ)的轉化率分別為80%和30%。推測添加Cr(Ⅵ)的轉化率不同可能由以下兩方面原因導致：一是不同樣品基質(zhì)本身的還原性物質(zhì)存在差異，二是由于EDTA/PDCA絡合劑呈酸性，在樣品前處理中直接加入會促使Cr(Ⅵ)向Cr(Ⅲ)轉化。此外，試驗還檢測到一未知色譜峰，這與Lin等[32]發(fā)現(xiàn)的結果一致，其峰面積隨Cr(Ⅵ)添加量的增加而增大，這也導致Cr(Ⅵ)的回收率略低，推測其為鉻絡合物的另一種形式，具體形式還有待進一步研究。

本試驗結果也證實了在海藻中大部分鉻呈化合態(tài)，少部分呈游離態(tài)，且Cr(Ⅲ)是游離態(tài)鉻存在的主要形態(tài)。祝銀等[33]在厚殼貽貝暴露研究中加入Cr(Ⅵ)，發(fā)現(xiàn)其被轉化成Cr(Ⅲ)和有機Cr，說明Cr(Ⅵ)無法長期穩(wěn)定地存在于生物體內(nèi)。我國現(xiàn)行國家標準GB 2762-2017[17]對總鉻進行了限值要求(2.0 mg·kg-1)， 旨在通過監(jiān)控水產(chǎn)品中總鉻含量，進而對危害人體健康的Cr(Ⅵ)含量進行限量。而海藻對金屬鉻雖具有較強的吸附累積能力，但其能將富集的金屬離子轉化為各種無毒或微毒的有機體，因此即使海藻鉻總量超標，但食用海藻對人體不會構成健康風險。因此，目前尚未有因食用海藻而發(fā)生鉻中毒事件的報道，這也從側面對本試驗進行了驗證。

4 結論

本研究通過對絡合劑的種類和濃度、流動相的種類和濃度、pH值、溫度及提取方式等條件進行優(yōu)化，建立了HPLC-ICP-MS法同時測定海藻中游離態(tài)Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的方法，前處理操作簡單、檢出限低、精密度高，可實現(xiàn)對海藻樣品中鉻形態(tài)的快速準確分析。此外，利用ICP-MS對3種海藻中鉻的不同形態(tài)進行分析，結果表明，海藻中鉻主要以結合態(tài)鉻和游離態(tài)鉻形式存在，且結合態(tài)鉻是其存在的主要形式，游離態(tài)鉻以Cr(Ⅲ)為主、Cr(Ⅵ)幾乎不存在。