鹽酸曲美他嗪納米乳的制備及其對缺血缺氧型 心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

刁中極，平洋，雷銳，虞德忱，殷實，王偉（.佳木斯市中心醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 5400；.佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 54007）

缺血性心血管疾病是臨床常見病和多發(fā)病，大量的循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)表明，心血管疾病的治療藥物主要是通過改善局部缺血心肌的氧供需平衡，間接發(fā)揮心肌保護(hù)作用，但治療后仍有患者留有心力衰竭的癥狀或體征[1]。因此合理優(yōu)化心肌能量代謝受到了廣大醫(yī)務(wù)工作者的推薦。曲美他嗪作為一種改善能量代謝的新藥，因其獨特的作用機(jī)制及效果，在臨床中越來越受到重視。由于其能減輕心肌細(xì)胞酸中毒和細(xì)胞內(nèi)Na＋、Ca2＋超載，抑制氧自由基生成，穩(wěn)定線粒體膜功能狀態(tài)[2]，其臨床應(yīng)用已從單純穩(wěn)定型心絞痛擴(kuò)展到對多種心肌缺血及心功能障礙的保護(hù)治療。鹽酸曲美他嗪在臨床上的使用劑型為口服普通片劑、緩釋片劑和膠囊劑[3-4]，以固體制劑形式的給藥方式，難免會影響藥物的體內(nèi)吸收，本研究通過藥劑學(xué)方法和手段，將鹽酸曲美他嗪制備成W/O型口服納米乳劑。納米乳具有較小粒徑，分散均勻度高，藥物分散度高，能提高藥物作用效果，同時對藥物透皮吸收也有促進(jìn)作用。鹽酸曲美他嗪納米乳劑的研究將為曲美他嗪新劑型開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器及試藥

FA2004N電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器）；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物儀器）；MALVERN Zetasizer Nano ZS粒徑分析儀（英國馬爾文儀器）；透射電子顯微鏡（日本株式會社儀器）；Agilent高效液相色譜儀工作站（日本島津儀器）；371型-CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo儀器）；TECAN sunrise光吸收酶標(biāo)儀（瑞士帝肯儀器）；TGL-16GB臺式高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器）；KQ-200KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器）；SZ93-1自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器）；Innoval ODS-2 C18色譜柱（博納艾杰爾儀器）。

鹽酸曲美他嗪（批號：Lot#E1905020，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；1，2-丙二醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；脂肪酸山梨坦80（Span-80）、聚乙二醇400（PEG-400）（上海山浦化工有限公司）；聚氧乙烯40氫化蓖麻油（RH 40）、大豆磷脂（PC）、肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、辛葵酸甘油酯（GTCC）、聚山梨酯-80（Tween-80）、液體石蠟、1-庚烷磺酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司）；大豆油（九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司）；單硬脂酸甘油酯（江蘇伯業(yè)生物科技有限公司）；無水乙醇（天津市凱通化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；H9c2 大鼠心肌細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、PBS（Hyclone）；肌酸激酶同工酶（CKMB）試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司，批號：20191013）、超氧化物歧化酶（SOD、批號：20191103）和丙二醛（MDA、批號：20191104）試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 處方中各組分篩選

2.1.1 乳化劑的篩選 擬對PC、Span-80、RH 40、單硬脂酸甘油酯作為乳化劑篩選，基于文獻(xiàn)方法[5]，采用丙二醇為助乳化劑，IPM為油相，乳化劑∶助乳化劑∶油相按1∶1∶2（質(zhì)量比）稱取并混合，置于恒溫磁力攪拌器中，待形成透明溶液時緩慢滴加蒸餾水進(jìn)行乳化。以乳劑外觀狀態(tài)為指標(biāo)，進(jìn)行乳化劑篩選。

2.1.2 助乳化劑的篩選 擬對PEG-400、Tween-80、無水乙醇與丙二醇作為助乳化劑篩選。分別按1∶1的比例與PC混合，將混合溶液按1∶1的比例與IPM混合，制備方法同上。以乳劑外觀狀態(tài)進(jìn)行助乳化劑篩選。

2.1.3 油相的篩選 擬對IPM、GTCC、液體石蠟以及大豆油作為油相篩選，助乳化劑丙二醇和無水乙醇分別與乳化劑PC按1∶1的比例進(jìn)行混合，再將混合溶液按1∶1的比例依次與上述的油相混合。以乳劑外觀狀態(tài)及過微孔濾膜阻力大小為指標(biāo)，對油相進(jìn)行篩選。

2.1.4 乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比的篩選 乳化劑與助乳化劑的質(zhì)量比（Km）可以反映二者配比關(guān)系對納米乳形成的影響。固定PC/丙二醇/IPM/水納米乳體系[6]，將PC與丙二醇以Km為1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、3∶2與4∶1進(jìn)行混合，恒溫磁力攪拌一段時間，使成透明溶液后，緩慢滴加蒸餾水，形成空白納米乳。以乳劑外觀狀態(tài)及過膜阻力為指標(biāo)確定PC與丙二醇的Km。

2.1.5 偽三元相圖確定乳化區(qū)域 將PC與丙二醇以固定比例Km3∶2置于燒杯中，再將混合溶液與油相按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混合均勻，于52℃恒溫磁力攪拌至全溶，向溶液體系中滴加蒸餾水，待體系由澄清變渾濁時記錄雙蒸水用量[7-9]，采用origin 9.0軟件繪制偽三元相圖。

2.1.6 復(fù)合乳劑的篩選 為得到預(yù)期粒徑的納米乳溶液，擬采用復(fù)合乳化劑[10-13]，即調(diào)整混合乳化劑的親水親油平衡值（HLB），增加乳化膜的穩(wěn)固性。以Tween-80和PC作為復(fù)合乳化劑，基于處方（用量比）PC∶丙二醇∶IPM∶鹽酸曲美他嗪水溶液＝5∶3.43∶33.83∶9。將PC與Tween-80以5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1混合制備納米乳，以乳劑形成狀態(tài)、形成納米乳時的溫度區(qū)間、超聲分散后乳劑的外觀、過微孔濾膜阻力以及粒徑為考察指標(biāo)，對復(fù)合乳化劑進(jìn)行篩選。

2.2 鹽酸曲美他嗪納米乳的制備

精密稱取PC 1.20 g、Tween-80 0.3 g、丙二醇1.03 g、IPM 10.15 g置于燒杯中，于52℃下恒溫磁力攪拌至PC全溶，再稱取鹽酸曲美他嗪原料藥100 mg于2.6 g雙蒸水中，攪拌使其溶解，于室溫下緩慢地向上述混合體系中滴加鹽酸曲美他嗪溶液直至體系變?yōu)橥该鳡罹鶆蛞后w，將溶液置于冰水浴條件下，功率為70%，超聲分散7 min，即得鹽酸曲美他嗪納米乳。

2.3 鹽酸曲美他嗪納米乳的表征

2.3.1 丁達(dá)爾現(xiàn)象 按“2.2”項下方法制備納米乳，采用外激光照射方式，觀察鹽酸曲美他嗪納米乳。

2.3.2 納米乳劑類型鑒別 分別取兩份鹽酸曲美他嗪納米乳1.5 mL置于離心管中，向兩離心管中分別滴加蘇丹紅Ⅲ和亞甲基藍(lán)染色劑，靜止放置，觀察兩種染色劑在乳液中的擴(kuò)散程度，以確定納米乳劑類型[14]。

2.3.3 納米乳外觀形態(tài)觀察 取鹽酸曲美他嗪納米乳1 mL，加入IPM溶液按體積比1∶10進(jìn)行稀釋，待測樣品滴于超薄碳膜上，待自然揮干后，于透射電子顯微鏡（TEM）下觀察外觀形態(tài)。

2.3.4 粒徑及zeta電位 取鹽酸曲美他嗪納米乳，分別置于石英比色皿和電位檢測池中，采用馬爾文激光粒度儀測定納米乳的粒徑與zeta電位。

2.4 鹽酸曲美他嗪納米乳的檢測

2.4.1 色譜條件 流動相：1-庚烷磺酸鈉溶液（1-庚烷磺酸鈉1.8383 g，純凈水配制，磷酸調(diào)節(jié)pH 2.55）-乙腈-甲醇＝645∶316∶39；色譜柱：Innoval ODS-2（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1 mL·min－1；紫外檢測波長：231 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸曲美他嗪對照品500 mg，甲醇溶解并定容于100 mL 量瓶中，即得質(zhì)量濃度為5.0 mg·mL－1的鹽酸曲美他嗪對照品溶液，備用。

2.4.3 空白納米乳樣品的制備和測定 精密吸取空白納米乳1 mL，加入10 mL甲醇溶液破乳，于8000 r·min－1離心15 min，取1 mL上清液于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得空白納米乳樣品；待測樣品過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣檢測。

2.4.4 含量測定 精密量取鹽酸曲美他嗪納米乳1 mL，按“2.4.3”項下方法處理，即得鹽酸曲美他嗪納米乳待測樣品，過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣檢測。

2.5 H9c2 心肌細(xì)胞保護(hù)作用

2.5.1 H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)及分組 大鼠 H9c2 心肌細(xì)胞于 DMEM 高糖培養(yǎng)基（含10% FBS、1%雙抗）中，37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。正常組用完全培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；模型組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h 后更換為無糖無血清的DMEM 培養(yǎng)基，密閉培養(yǎng)。給藥組以含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)，1 h 后更換為無糖無血清的DMEM 培養(yǎng)基，密閉培養(yǎng)。

2.5.2 CCK-8法檢測 H9c2 心肌細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期H9c2 心肌細(xì)胞按1×105個·mL－1，接種于96孔板內(nèi)，每個濃度設(shè)定3個復(fù)孔，于5%CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，每孔加入不同濃度的納米乳溶液，對照組加等量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h后每孔加入 CCK-8 溶液于5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，酶標(biāo)儀450 nm測定各孔的吸光度值，并計算各組對H9c2細(xì)胞的生長抑制率。

2.5.3 比色法檢測LDH含量及心肌細(xì)胞內(nèi) CKMB、SOD、MDA 含量 取出上述細(xì)胞培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的 LDH 含量及細(xì)胞內(nèi) CK-MB、SOD、MDA的含量[15-16]。

2.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)分布、方差齊性檢驗，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 處方各組分篩選結(jié)果

3.1.1 乳化劑的篩選結(jié)果 結(jié)果見表1所示，由乳劑外觀結(jié)果最終確定乳化劑為PC。

表1 乳化劑篩選結(jié)果 Tab 1 Screening of emulsifiers

3.1.2 助乳化劑的篩選結(jié)果 結(jié)果如表2所示，由乳劑外觀可知，無水乙醇和丙二醇均能得到外觀澄清透明的納米乳溶液，故進(jìn)一步進(jìn)行篩選。

表2 助乳化劑的篩選結(jié)果 Tab 2 Screening of co-emulsifier

3.1.3 油相的篩選結(jié)果 結(jié)果如表3所示，通過對油相的篩選，確定了助乳化劑為丙二醇，而油相篩選結(jié)果中IPM和GTCC均能得到較理想的乳劑，由于GTCC價格較貴，最終確定IPM為油相。

表3 油相篩選的結(jié)果 Tab 3 Screening of the oil phase

3.1.4 乳化劑與助乳化劑質(zhì)量比的篩選結(jié)果 由表4可知，乳化劑與助乳化劑的Km比為3∶2時，能夠滿足各項篩選結(jié)果。

表4 Km的篩選結(jié)果 Tab 4 Screening of the Km

3.1.5 偽三元相圖確定乳化區(qū)域 如表5所示，當(dāng)混合溶液體系由澄清變混濁時納米乳中各部分所占質(zhì)量百分比，通過繪制偽三元相圖初步確定鹽酸曲美他嗪納米乳的乳化區(qū)域（見圖1），用于進(jìn)一步優(yōu)化鹽酸曲美他嗪納米乳中各相處方所占比例見表6。

圖1 PC/Propylene glycol/IPM/雙蒸水體系偽三元相圖Fig 1 Pseudo ternary phase diagram of PC/Propylene glycol/IPM/double distilled water system

表5 乳化區(qū)域 Tab 5 Emulsification area

各組中NE1組與其余3組相比，水相含量高，納米乳粒徑值較小，PDI值最小，表明該處方液滴的分散性較好，流動性好。因此鹽酸曲美他嗪納米乳處方為乳化劑-助乳化劑∶油相∶水相＝5∶20∶4， 其中乳化劑∶助乳化劑為3∶2，見表6。

表6 納米乳的組成、粒徑及分散性 Tab 6 Composition，particle size and dispersibility of nanoemulsion

3.1.6 復(fù)合乳化劑的篩選結(jié)果 復(fù)合乳化劑篩選結(jié)果見表7，PC∶Tween-80＝4∶1時，制備的納米乳粒徑值較為理想，且該處方在后續(xù)冷藏（4℃）的條件下，乳液未出現(xiàn)油水分層，沉淀析出，因此確定鹽酸曲美他嗪納米乳的最終處方W%為復(fù)合乳化劑-助乳化劑：油相∶水相＝5∶20∶4，其中復(fù)合乳化劑∶助乳化劑＝3∶2，復(fù)合乳化劑為PC∶Tween 80＝4∶1。

表7 復(fù)合乳化劑的篩選結(jié)果 Tab 7 Screening of compound emulsifier

3.2 鹽酸曲美他嗪納米乳的表征

3.2.1 丁達(dá)爾現(xiàn)象 制備的納米乳，外觀為金黃色澄清透明的均一液體，用激光光束照射納米乳時，出現(xiàn)一束明顯的紅色光柱，即產(chǎn)生丁達(dá)爾效應(yīng)，證明制備的納米乳屬于膠體溶液，結(jié)果見圖2。

圖2 鹽酸曲美他嗪納米乳的丁達(dá)爾效應(yīng)Fig 2 Tyndall effect of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion

3.2.2 納米乳類型鑒別結(jié)果 由圖3可見油溶性染色劑擴(kuò)散程度要比水溶性染色劑擴(kuò)散速度快，且分布均勻，故可判斷制備的鹽酸曲美他嗪納米乳為W/O型[14]。

圖3 納米乳的類型鑒別Fig 3 Types of nanoemulsion

3.2.3 納米乳外觀形態(tài)觀察結(jié)果 如圖4所示，在TEM中可觀察到鹽酸曲美他嗪納米乳的外觀形態(tài)為均一大小、分布均勻的類圓形乳滴粒子。

圖4 鹽酸曲美他嗪納米乳TEM圖Fig 4 TEM image of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion

3.2.4 粒徑及zeta電位 鹽酸曲美他嗪納米乳的粒徑值為（161.97±1.20）nm，PDI為0.224，zeta電位值為－0.328 mV，見圖5～6。

圖5 鹽酸曲美他嗪納米乳粒徑分布圖Fig 5 Distribution of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion particle sizes

圖6 鹽酸曲美他嗪納米乳zeta 電位圖Fig 6 Zeta potential of trimetazidine hydrochloride nanoemulsion

3.2.5 專屬性考察 由圖7可知，供試品溶液的藥物的保留時間與對照品一致tR＝8.103 min，而且空白樣品對鹽酸曲美他嗪的測定無干擾，分析方法的專屬性良好。

圖7 HPLC 色譜圖Fig 7 HPLC chromatogram

3.2.6 鹽酸曲美他嗪納米乳含量測定 測得納米乳中鹽酸曲美他嗪的含量為4.17 mg·mL－1。

3.3 缺血缺氧型心肌細(xì)胞的保護(hù)作用研究

3.3.1 CCK-8法檢測H9c2細(xì)胞存活率 結(jié)果如表8所示，模型組與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明缺血缺氧型心肌細(xì)胞模型建立成功；各濃度治療組與模型組比較H9c2細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.01），并表現(xiàn)出濃度依賴性。

表8 H9c2細(xì)胞存活率(±s，n＝3) Tab 8 Survival rate of H9c2 cells (±s，n＝3)

表8 H9c2細(xì)胞存活率(±s，n＝3) Tab 8 Survival rate of H9c2 cells (±s，n＝3)

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，# P＜0.01。Note：Compare with the normal group，*P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.01.

組別 劑量/（mg·mL－1） OD值 存活率/%正常組 － 0.2013±0.0020 100.00模型組 － 0.1104±0.0035* 43.96治療組1 0.0045 0.1387±0.0027*# 61.41治療組2 0.045 0.1428±0.0012*# 63.93治療組3 0.45 0.1691±0.0021*# 80.15

3.3.2 LDH、CK-MB、SOD及MDA含量 結(jié)果如表9所示，與正常組比較，模型組H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量顯著增高（P＜0.01）；CKMB、MDA含量顯著升高，SOD含量顯著降低（P＜0.01）與模型組比較，各治療組H9c2細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH含量明顯降低（P＜0.01）。各治療組CK-MB、MDA含量均有不同程度降低（P＜0.01），SOD含量升高（P＜0.01）。

表9 H9c2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中 LDH及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)生化指標(biāo)含量(x±s，n＝3) Tab 9 Content of LDH and related biochemical indexes in H9c2 cells (x±s，n＝3)

4 討論

缺血性心血管疾病可引起心肌缺氧，心肌細(xì)胞能量代謝紊亂。鹽酸曲美他嗪通過調(diào)節(jié)心肌代謝底物，改善能量代謝及心肌缺血，加強(qiáng)心臟功能?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，CK-MB 為主要存在于心肌中的肌酸激酶同工酶，當(dāng)心肌發(fā)生急性損傷時會大量釋放，具有較高的特異性，可以作為判斷心肌損傷程度的依據(jù)[17-18]。SOD和MDA均與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，兩者可通過減少脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生、增加抗氧化物酶的活性而減少氧化應(yīng)激，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而提高細(xì)胞存活率，保護(hù)心肌細(xì)胞[19]。本研究制備的鹽酸曲美他嗪納米乳劑制備方法簡單易于操作，對H9c2 心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，且制備的納米乳劑為W/O型，可增加藥物的脂溶性，進(jìn)一步改善藥物的體內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)運效率，為其體內(nèi)藥動學(xué)和藥理學(xué)研究提供研究基礎(chǔ)。