中藥一致性評(píng)價(jià)關(guān)鍵技術(shù)
——定量指紋圖譜聯(lián)合 一線多評(píng)法研究

閆慧，孫國(guó)祥，孫萬(wàn)陽(yáng)，蘭麗麗，李想，蒲道俊，胡延雷，賈景明，陳振鴻（.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽(yáng) 00；.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng) 00；3.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 03；.西南藥業(yè)股份有限公司，重慶 00038；.國(guó)藥集團(tuán)工業(yè)有限公司，北京 030；.新疆富沃藥業(yè)有限公司，新疆 阿克蘇地區(qū) 899）

藥物一致性評(píng)價(jià)，狹義上要求仿制藥與原研藥符合相同的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，廣義上要求兩者具有相同的活性成分和適應(yīng)證，藥物劑型規(guī)格和給藥途徑相同，符合相同的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到生物等效，即藥學(xué)等效和藥效等效[1]。由于中藥（traditional Chinese medicine，TCM）沒(méi)有進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)程，因此無(wú)法采用參比制劑來(lái)進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)。與化藥相比，中藥來(lái)源復(fù)雜，藥效成分多樣，對(duì)某種疾病起效可能為幾種成分的協(xié)同作用，故僅檢測(cè)其中的一種或幾種成分不能達(dá)到整體評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的目的，這給中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)帶來(lái)很大的困難。因此，為了更加系統(tǒng)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量，孫國(guó)祥教授建立了中藥定量指紋圖譜評(píng)價(jià)理論和技術(shù)，提出中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑控制模式和全質(zhì)量關(guān)控制模式。中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑控制模式是中藥一致性評(píng)價(jià)首選模式，尤其是雙標(biāo)校正后的標(biāo)準(zhǔn)制劑的對(duì)照指紋圖譜將是中藥一致性評(píng)價(jià)的必由之路。中藥系統(tǒng)指紋定量法從宏觀定性和宏觀定量角度出發(fā)，以定量指紋圖譜控制中藥中整體化學(xué)物質(zhì)，進(jìn)而成為整體評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的新方法[2]。本文在中藥標(biāo)準(zhǔn)制劑建立后，采用定量指紋圖譜技術(shù)模式即中藥指紋圖譜與多指標(biāo)成分定量分析相結(jié)合的中藥質(zhì)量控制模式[3]。

但由于中藥成分復(fù)雜，某些對(duì)照品價(jià)格昂貴或難得，使得某些成分的定量控制比較困難，因此，王智民等[4]提出了一測(cè)多評(píng)法。一測(cè)多評(píng)法的出現(xiàn)不僅減少了中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的成本，也簡(jiǎn)化了測(cè)定過(guò)程，提高了工作效率。一測(cè)多評(píng)法是通過(guò)中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，建立樣品中某一有效、價(jià)廉、易得的典型成分與樣品其余成分間的相對(duì)校正因子（relative correction factor，RCF）以計(jì)算樣品中其他成分的量[4]。但是一測(cè)多評(píng)法在技術(shù)上存在4個(gè)方面的不足：① 缺乏線性范圍考察和系統(tǒng)方法學(xué)驗(yàn)證技術(shù)，導(dǎo)致誤差較大；② 無(wú)誤差分析理論和可靠度分析理論，導(dǎo)致分析方法可靠度無(wú)法驗(yàn)證，也無(wú)法指導(dǎo)試驗(yàn)技術(shù)人員如何避免誤差；③ 色譜體系無(wú)誤差校正方法，通常檢測(cè)色譜條件與當(dāng)初建立標(biāo)準(zhǔn)的色譜系統(tǒng)存在系統(tǒng)定量誤差，誤差傳遞導(dǎo)致最終結(jié)果誤差較大（大于5%）；④ 理論技術(shù)不夠扎實(shí)，數(shù)學(xué)上理論探討不夠深入。

本文在一測(cè)多評(píng)法的基礎(chǔ)上，提出一線多評(píng)法（multi-markers assay by monolinear method，MAML），即基于一測(cè)多評(píng)法原理并結(jié)合中藥定量指紋圖譜理論提出的新方法，彌補(bǔ)了一測(cè)多評(píng)法在技術(shù)上的缺陷和不足。既然中藥定量指紋圖譜承認(rèn)所確定的全部指紋峰都能整體定量，那么對(duì)于主要的幾個(gè)指標(biāo)成分的量值分布必然有確定的函數(shù)關(guān)系，因此必然能使用一測(cè)多評(píng)法。一測(cè)多評(píng)法最大缺陷是忽略了線性范圍，考察濃度范圍太窄，忽視了建立標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)和檢驗(yàn)系統(tǒng)之間的量值校正問(wèn)題即系統(tǒng)定量誤差沒(méi)進(jìn)行任何校正。一線多評(píng)法是在多指標(biāo)定量時(shí)采用與指紋圖譜檢測(cè)相同的色譜條件同時(shí)建立多個(gè)活性化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用一測(cè)化合物（一測(cè)物）和多評(píng)化合物（多評(píng)物）標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)計(jì)算校正因子、誤差、可靠度，從而實(shí)現(xiàn)用一測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)多評(píng)物進(jìn)行定量的分析方法。當(dāng)方法建立后，以一線多評(píng)法對(duì)多評(píng)物進(jìn)行定量時(shí)的計(jì)算公式與一測(cè)多評(píng)法相同（一般以線性范圍的平均濃度進(jìn)行試驗(yàn)），不同的是相對(duì)校正因子由多條標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)計(jì)算而來(lái)，具有誤差分析和校正理論及可靠度分析理論。因此一線多評(píng)法是在定量指紋圖譜基礎(chǔ)上利用多條標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的與定量指紋系統(tǒng)具有密切關(guān)聯(lián)度量值的相對(duì)校正因子法，由于有雙標(biāo)校正法而實(shí)現(xiàn)定量誤差可控或很小。中藥定量指紋圖譜聯(lián)合一線多評(píng)能實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥化學(xué)指紋物質(zhì)總量的等位等效控制。 孫國(guó)祥教授提出：① 中藥多指標(biāo)定量分析屬于中藥質(zhì)量的多點(diǎn)或者多點(diǎn)線質(zhì)量控制模式（兩點(diǎn)確定一直線，因此是線性控制范圍）；② 定量指紋圖譜控制屬于從中藥主組分化學(xué)成分出發(fā)形成的平面輪廓控制（用指紋圖譜定性控制是形象化外觀圓控制，用中藥指紋圖譜定量控制是對(duì)總量的幅度控制-大小不同圓）；③ 中藥溶出度控制屬于對(duì)中藥主組分指紋溶出的立體控制-球形（實(shí)際情況可能為凹凸不規(guī)則的球）。中藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)必須是基于標(biāo)準(zhǔn)制劑的點(diǎn)線面立體化控制，見(jiàn)圖1。中藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)的藥學(xué)質(zhì)量研究應(yīng)從這三個(gè)方面開(kāi)展，才能控制好藥效物質(zhì)總量的等位，同時(shí)控制好體外溶出度一致性來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥固體制劑工藝過(guò)程的一致性控制——質(zhì)量與藥效實(shí)現(xiàn)等位等效。

圖1 中藥一致性評(píng)價(jià)點(diǎn)線面立體控制模型（Q-markers點(diǎn)線控制，指紋圖譜圓面控制和溶出度立體球控制）Fig 1 Dot-line-plane-stereoscopic control model for TCM consistency evaluation（dot-line control of Q-markers，circular plane control of fingerprints and stereoscopic ball control of dissolution）

1 定量指紋圖譜聯(lián)合一線多評(píng)法模型的建立

1.1 一線多評(píng)法線性范圍

在定量指紋圖譜條件下的多指標(biāo)定量時(shí)，必須采用統(tǒng)一化色譜條件同時(shí)建立多條標(biāo)準(zhǔn)曲線，用其中一條標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)對(duì)多指標(biāo)分別準(zhǔn)確定量的方法稱為一線多評(píng)法。一線多評(píng)法的最大特點(diǎn)是把標(biāo)準(zhǔn)曲線法最大程度地簡(jiǎn)化，節(jié)省對(duì)照品使用。具體要求為：① RCF（fsi）必須滿足一定線性范圍，推薦10～20倍濃度范圍，最大不超過(guò)100倍；② 一測(cè)物線性范圍為Rs＝[Cs1，Cs2]，多評(píng)物線性范圍為Ri＝[Ci1，Ci2]，則被測(cè)物濃度應(yīng)在Ri＝[Ci1，Ci2]，通常線性范圍的均值濃度為最佳點(diǎn)Cavg＝（C1＋C2）/2；③ 用標(biāo)準(zhǔn)曲線A＝bC＋a求RCF更合理（有線性范圍）。用線性方程求RCF特點(diǎn)：① 用最小二乘法計(jì)算濃度斜率bi，能準(zhǔn)確地揭示峰面積對(duì)濃度增長(zhǎng)的靈敏度，且給出誤差項(xiàng)ai（標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距）；② 給出的線性范圍和相關(guān)系數(shù)能揭示濃度適用范圍和誤差大??；③ 用截距和截距斜率容易計(jì)算fsi誤差；④ 方法可靠度能預(yù)先準(zhǔn)確估算；⑤ 一線多評(píng)法方法學(xué)驗(yàn)證后，仍然采用一點(diǎn)法或兩點(diǎn)法對(duì)多指標(biāo)成分定量，因此檢驗(yàn)工作中沒(méi)必要每次都作標(biāo)準(zhǔn)曲線，避免浪費(fèi)對(duì)照品和資源。

1.2 一線多評(píng)法應(yīng)用

一測(cè)物S標(biāo)準(zhǔn)曲線和多評(píng)物i標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)公式（1）和（2），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算一測(cè)物絕對(duì)校正因子fi見(jiàn)公式（3）和（4）。bas＝as/Cs，bai＝ai/Ci分別為一測(cè)物S截距斜率和多評(píng)物i截距斜率（即斜率絕對(duì)誤差）?？芍獪y(cè)定絕對(duì)校正因子時(shí)，一測(cè)物Cs和多評(píng)物Ci對(duì)bas和bai影響很大，兩者濃度越大則截距斜率越小，即高濃度測(cè)定誤差很小。線性平均濃度C0＝0.5（C1＋C2）（即通常為測(cè)定樣品濃度，線性范圍中間濃度）為最佳。用斜率公式直接計(jì)算相對(duì)校正因子fsi見(jiàn)公式（5），把標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比稱為簡(jiǎn)相對(duì)校正因子f'si，當(dāng)ba＝│a/C│≤1%b時(shí)可用斜率直接計(jì)算fsi，見(jiàn)公式（6）（誤差小于1.0%）。

一線多評(píng)法是建立在一測(cè)物S和多評(píng)物i的標(biāo)準(zhǔn)曲線基礎(chǔ)上，具有以下特點(diǎn)：① 線性范圍揭示一線多評(píng)法適用范圍；② 給出誤差范圍和可靠度；③ 基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的一線多評(píng)法科學(xué)性和準(zhǔn)確性顯著提高；④ 一線多評(píng)法只有在精密度和方法重復(fù)性均ba＝│a/C│≤1%b時(shí)，RSD≤2.0%才能保證方法的準(zhǔn)確度是可靠的。

1.3 一線多評(píng)法誤差

1.3.1 相對(duì)校正因子的相對(duì)誤差 按誤差傳遞規(guī)律得fsi相對(duì)誤差見(jiàn)公式（7），主要由一測(cè)物S和多評(píng)物i截距誤差之差所決定。用均值濃度計(jì)算截距斜率時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線自身誤差的大小決定了相對(duì)fsi誤差。計(jì)算一線多評(píng)的被測(cè)物濃度的相對(duì)誤差，見(jiàn)公式（8），稱量步驟的相對(duì)誤差小是十分重要的，得定量可靠度，見(jiàn)公式（9）。其中被測(cè)物相對(duì)峰面積誤差代入樣品中i組分精密度的RSDi（REi≈RSDi），一測(cè)物S的相對(duì)峰面積誤差代入對(duì)照品精密度試驗(yàn)中的RSDs（REs≈RSDs），兩者有部分抵消作用（之差小于1.0%）：

① 若△fsi/fsi≤2.0%和△Csi/Cs≤2.0%，則定量誤差小于4.0%；定量可靠度R不低于95.5%；

② 若△fsi/fsi≤1.0%和△Csi/Cs≤1.0%，則定量誤差小于2.0%；定量可靠度R不低于97.7%；

③ 截距斜率誤差大小直接影響定量結(jié)果，一測(cè)物和多評(píng)物濃度越高則截距斜率越小，測(cè)定樣品準(zhǔn)確度越好。

1.3.2 一線多評(píng)法的相對(duì)誤差 如果標(biāo)準(zhǔn)曲線僅有截距誤差（制備標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度誤差小于1.0%），則測(cè)定多評(píng)物的可靠度，見(jiàn)公式（9），① 測(cè)定S和i峰面積均RSD≤2.0%（不含中間精密度），截距誤差小于1.0%，則方法可靠度大于96.7%；② 若五項(xiàng)相對(duì)誤差都小于1.0%，則方法誤差小于2.0%，可靠度大于97.7%，稱量誤差小顯得十分重要；③ 若五項(xiàng)相對(duì)誤差都小于2.0%，則方法誤差小于4.0%，可靠度大于95.5%；④ 當(dāng)斜率誤差較大時(shí)方法準(zhǔn)確度誤差約5.0%。當(dāng)只考慮截距誤差時(shí)，可靠度估算見(jiàn)表1。因?yàn)橐痪€多評(píng)法的相對(duì)誤差只與測(cè)定混合對(duì)照品和多組分樣品時(shí)的儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果和稱量精密度有關(guān)。因此一線多評(píng)法的方法重復(fù)性試驗(yàn)和準(zhǔn)確度試驗(yàn)是評(píng)價(jià)該方法整體誤差的必要方法。根據(jù)各測(cè)量誤差進(jìn)行不確定度和可靠度大小進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)劃分，總計(jì)有9個(gè)等級(jí)，見(jiàn)表1。

表1 一線多評(píng)法的不確定度和可靠度劃分標(biāo)準(zhǔn) Tab 1 Unreliability and reliability of multi-markers assay by monolinear method

1.3.3 系統(tǒng)指紋定量法原理[5-8]系統(tǒng)指紋定量法（systematically quantified fingerprint method，SQFM）能從宏觀定性角度和宏觀定量角度對(duì)中藥進(jìn)行全方位立體量化控制，適合中藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)。主要包括三個(gè)參數(shù)：宏定性相似度（Sm），宏定量相似度（Pm）和指紋均化變動(dòng)系數(shù)（α），分別見(jiàn)公式（10～12）。其中α在分級(jí)控制時(shí)使用較少，只要充分利用好Sm和Pm就能實(shí)現(xiàn)對(duì)整體主組分指紋的定量控制，該方法還可用于紫外全指紋溶出度評(píng)價(jià)，同時(shí)還能以標(biāo)準(zhǔn)制劑（或參比制劑）為參照對(duì)不同批次中藥固體制劑溶出曲線的相似性進(jìn)行評(píng)價(jià)，因此SQFM和中藥溶出系統(tǒng)指紋定量法是中藥一致性評(píng)價(jià)的核心方法，它們的計(jì)算方法相同。

1.3.4 定量指紋圖譜雙標(biāo)校正法 色譜系統(tǒng)改變會(huì)帶來(lái)定量誤差，通過(guò)雙標(biāo)校正法進(jìn)行校正。把建立特征指紋圖譜（標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜）的系統(tǒng)稱為第一色譜系統(tǒng)（first chromatographic system，F(xiàn)CS），對(duì)發(fā)生誤差后的色譜系統(tǒng)稱為第二色譜系統(tǒng)（second chromatographic system，SCS），在 強(qiáng) 極 性 區(qū) 和弱極性區(qū)各選擇一個(gè)參照物峰作雙標(biāo)（一般為Q-markers），測(cè)定固定濃度雙標(biāo)混合溶液對(duì)應(yīng)峰面積來(lái)計(jì)算FCS和SCS的絕對(duì)定量校正因子fd1和fdi，見(jiàn)公式（13）和公式（14）[9]。SCS與FCS的絕對(duì)定量校正因子之比稱為雙標(biāo)相對(duì)定量校正因子fqi，見(jiàn)公式（15），把FCS定量性質(zhì)平移到新檢測(cè)系統(tǒng)可通過(guò)相對(duì)定量校正因子fqi與樣品稱樣質(zhì)量（mi）直接相乘實(shí)現(xiàn)校正，見(jiàn)公式（16），稱為雙標(biāo)校正法[9]。雙標(biāo)校正法能消除不同色譜系統(tǒng)在不同時(shí)間測(cè)定的指紋圖譜時(shí)所產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，也能保證一線多評(píng)法誤差可控或很小。雙標(biāo)校正法是定量指紋圖譜執(zhí)行中藥質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)的必要基礎(chǔ)和有效保證，是一線多評(píng)法應(yīng)用的前提條件。

2 方法

2.1 儀器與試藥

Agilent1100 型液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器、四元低壓梯度泵、在線脫氣裝置、自動(dòng)進(jìn)樣器），Agilent OpenLAB CDS Chemstation（Edition C.01.07）網(wǎng)絡(luò)工作站（Agilent科技有限公司）。Sarturius-BS 110S分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；ES-E120D電子分析天平（天津市德安特傳感技術(shù)有限公司）；超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）；安捷倫706ds全自動(dòng)溶出儀（配有850ds自動(dòng)取樣器）。

磷酸（色譜純，成都市科龍化工試劑廠）；甲醇、乙腈（色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司）；娃哈哈純凈水（沈陽(yáng)娃哈哈啟力食品有限公司）；庚烷磺酸鈉（色譜純，山東省禹城市中美色譜產(chǎn)品廠）；嗎啡（MP，批號(hào)：171201-200822）、磷酸可待因（MMP，批號(hào)：171203-200504）、甘草苷（LQN，批號(hào)：111610-200604）、甘草酸銨（CHAA，批號(hào)：110731-201619）和苯甲酸鈉（SB，批號(hào)：100433-200301）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

復(fù)方甘草片（S1～S49為廠家A生產(chǎn)；S50～S61為廠家B生產(chǎn)；S62～S73為廠家C生產(chǎn)；S74～S85為廠家D生產(chǎn)；S86～S97為 廠 家E生 產(chǎn)；S98～S109為 廠 家F生 產(chǎn)；S110～S121為廠家G生產(chǎn)；S122～S133為廠家H生產(chǎn)；S134～S145為廠家I生產(chǎn)）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 雙標(biāo)溶液制備 分別取MP和CHAA對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含200 μg MP和800 μg CHAA的雙標(biāo)混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液制備 分別取MP、LQN、MMP、SB和CHAA對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含35 μg MP、60 μg LQN、16 μg MMP、160 μg SB和800 μg CHAA的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取復(fù)方甘草片10片，稱重，研細(xì)，精密稱取約4片量，置于50 mL量瓶中，精密加提取溶劑（80%甲醇溶液，含0.5%磷酸）50 mL，精密稱定，45℃超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz）10 min，靜置至室溫，再精密稱定，用提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

色譜柱為COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.2%磷 酸 水 溶 液（含0.005 mol·L－1庚烷磺酸鈉）為水相A，乙腈-甲醇（9∶1，V/V）溶液為有機(jī)相B，梯度洗脫（0～10 min，96%～79%A；10～20 min，79%～65%A；20～32 min，65%～47%A；32～45 min，47%～18%A；45～50 min，18%～15%A；50～55 min，15%～96%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫為35℃，流速為1.0 mL·min－1，進(jìn)樣量為5 μL。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)考察

在此定量指紋圖譜系統(tǒng)的色譜條件下，以甘草酸（CHA）峰為參照物峰，并用壓縮因子τ的平方校正理論塔板數(shù)后要求應(yīng)不低于8500[10]。此外，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次考察儀器精密度；精密吸取S1供試品溶液，分別在溶液制備后的0、2、4、6、14、22 h進(jìn)樣測(cè)定，考察供試品溶液的穩(wěn)定性；通過(guò)分析6個(gè)單獨(dú)同法制備的S1供試品溶液考察方法的重復(fù)性。評(píng)價(jià)時(shí)以CHA峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，各共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5.0%，結(jié)果表明儀器進(jìn)樣精密度良好，供試品溶液在室溫放置22 h內(nèi)穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

3.2 復(fù)方甘草片指紋圖譜建立和評(píng)價(jià)

按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定9廠家共145批復(fù)方甘草片，記錄色譜圖。將積分后*.cdf文件導(dǎo)入【中藥主組分一致性數(shù)字化評(píng)價(jià)系統(tǒng)2.0】軟件（帶審計(jì)追蹤功能），以CHA峰的保留時(shí)間和峰面積為參照，確定28個(gè)共有指紋峰，按平均值法生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜（RFP），見(jiàn)圖2，其中10號(hào)峰為MP峰，14號(hào)峰為L(zhǎng)QN峰，15號(hào)峰為MMP峰，16號(hào)峰為SB峰，27號(hào)峰為CHA峰。以此RFP為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)145批復(fù)方甘草片進(jìn)行評(píng)價(jià)，樣品指紋圖譜與RFP的Sm不得低于0.90，Pm應(yīng)在80%～120%。根據(jù)所得評(píng)價(jià)結(jié)果，以Sm和Pm為參數(shù)進(jìn)行聚類(lèi)分析，采用SPSS軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)，結(jié)果S75、S81～S85、S107～S109為第Ⅰ類(lèi)，其余為第Ⅱ類(lèi)。雖然Ⅰ類(lèi)Pm數(shù)值偏大，但全部在規(guī)定范圍內(nèi)，決定不剔除任何批次樣品。9廠家樣品定量指紋圖譜評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2（以每個(gè)廠家所有批次結(jié)果的均值體現(xiàn)），表明9廠家產(chǎn)品質(zhì)量均合格。其中廠家A生產(chǎn)的批號(hào)為20171213、廠家B生產(chǎn)的批號(hào)為PDE0712、廠家E生產(chǎn)的批號(hào)為3180502、廠家G生產(chǎn)的批號(hào)為20180620以及廠家H生產(chǎn)的批號(hào)為18053001和18060501的復(fù)方甘草片的Sm≥0.95，Pm≈100%，可初步選作復(fù)方甘草片的標(biāo)準(zhǔn)制劑[11]。試驗(yàn)中每隔一段時(shí)間進(jìn)樣測(cè)定雙標(biāo)溶液，記錄色譜圖，計(jì)算相對(duì)定量校正因子。結(jié)果表明在復(fù)方甘草片特征指紋圖譜研究期間（約45 d）以及樣品測(cè)定期間，fqi始終在0.97～1.03，系統(tǒng)定量性質(zhì)無(wú)顯著變化，不需對(duì)色譜系統(tǒng)進(jìn)行雙標(biāo)校正。

圖2 復(fù)方甘草片對(duì)照指紋圖譜（RFP）Fig 2 RFP of compound licorice tablet

表2 系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià)復(fù)方甘草片質(zhì)量一致性結(jié)果 Tab 2 Quality consistency of evaluated by the systematically quantitative fingerprints

從表2的結(jié)果可看出，所有廠家樣品的平均Sm均大于0.96，說(shuō)明不同廠家生產(chǎn)的樣品之間定性相似度均良好，但只以定性相似度進(jìn)行評(píng)價(jià)，不同批次間的差異不顯著，不能有效地將不同批次的樣品質(zhì)量區(qū)分開(kāi)來(lái)，只能表明不同廠家樣品之間的化學(xué)指紋數(shù)量和分布比例十分相似。因此在評(píng)價(jià)過(guò)程中引入Pm是十分必要的，根據(jù)Pm結(jié)果可進(jìn)一步區(qū)分不同廠家生產(chǎn)的復(fù)方甘草片的質(zhì)量?jī)?yōu)劣以及同一廠家樣品的批間相似性大小。從結(jié)果中可看出廠家A生產(chǎn)的復(fù)方甘草片平均Pm值最小，廠家D生產(chǎn)的復(fù)方甘草片平均Pm值最大，兩者相差16.4%，說(shuō)明不同廠家樣品的化學(xué)指紋含量存在顯著差異。由此可見(jiàn)，中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)僅僅采取指紋圖譜定性參數(shù)評(píng)價(jià)不能達(dá)到全面控制中藥質(zhì)量的目的，定性參數(shù)結(jié)合指紋圖譜的定量相似度參數(shù)才能更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量。

3.3 含量測(cè)定

本文采用兩種方法測(cè)定復(fù)方甘草片中5種化合物含量：

① 標(biāo)準(zhǔn)曲線法：精密稱定MP、LQN、MMP、SB和CHAA適量，用甲醇稀釋?zhuān)瞥?個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。每份溶液在上述色譜條件下各平行測(cè)定兩次，以峰面積均值（Aavg）對(duì)各對(duì)照品濃度（C，mg·mL－1）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3。5種化合物在各線性范圍內(nèi)的線性關(guān)系均很好。利用各標(biāo)準(zhǔn)曲線以外標(biāo)法計(jì)算145批樣品中5種化合物含量，其中CHA含量應(yīng)在CHAA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得值基礎(chǔ)上乘以0.9797[12]。

表3 5種化合物線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限和檢測(cè)限 Tab 3 Linear regression equation，correlation coefficient，linearity，LOQ and LOD of the five Q-markers

② 一線多評(píng)法：利用標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)公式分別計(jì)算一測(cè)物和多評(píng)物的bas/bai與fs/fi，進(jìn)而計(jì)算出各標(biāo)準(zhǔn)曲線的fsi，見(jiàn)表4。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算SB含量，再以SB含量和fsi計(jì)算其他4組分含量。另外，各組分的定量可靠度均不低于96.5%，見(jiàn)表4，表明方法可靠性滿足測(cè)定要求。以上兩種含量計(jì)算方法所得結(jié)果見(jiàn)表5（以每個(gè)廠家各含量結(jié)果均值體現(xiàn)）。另外，《中國(guó)藥典》2020年版要求每片復(fù)方甘草片中MP含量在0.36～0.44 mg，CHA含量不少于7.3 mg[12]，根據(jù)表5結(jié)果可知，除廠家A和廠家G的MP平均含量不合格外，其余廠家MP平均含量均符合藥典規(guī)定，此外，所有廠家CHA平均含量均達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。

表4 復(fù)方甘草片一線多評(píng)法的各項(xiàng)參數(shù)值 Tab 4 Parameter of compound licorice tablet by multi-markers assay by monolinear method

表5 5種化合物含量測(cè)定結(jié)果 Tab 5 Content of the five Q-markers

將標(biāo)準(zhǔn)曲線法與一線多評(píng)法計(jì)算所得的每個(gè)廠家每種組分的平均含量結(jié)果進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)誤差，見(jiàn)表6，兩種計(jì)算方法所得相對(duì)誤差最大值為0.46%，表明一線多評(píng)法能準(zhǔn)確測(cè)定復(fù)方甘草片中5種化合物含量。相較于標(biāo)準(zhǔn)曲線法，一線多評(píng)法可節(jié)省對(duì)照品與分析時(shí)間，為中藥及其復(fù)方制劑的含量測(cè)定提供了一種新的、簡(jiǎn)便的思路。

表6 一線多評(píng)法與標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)誤差 Tab 6 Relative errors between standard curve method and multimarkers assay by monolinear method

4 討論

本文以復(fù)方甘草片為研究對(duì)象，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定145批樣品指紋圖譜，并建立復(fù)方甘草片標(biāo)準(zhǔn)制劑的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，以系統(tǒng)指紋定量法進(jìn)行評(píng)價(jià)。本文提出中藥一致性評(píng)價(jià)應(yīng)以定量指紋圖譜聯(lián)合一線多評(píng)法，實(shí)現(xiàn)復(fù)方甘草片主組分為中藥指紋組分的復(fù)方中藥制劑的整體質(zhì)量的量化控制。本文提出一線多評(píng)法理論、誤差估算方法和可靠度評(píng)價(jià)方法，該方法主要采用統(tǒng)一化色譜條件，建立雙標(biāo)校正法，消除測(cè)定系統(tǒng)變動(dòng)帶來(lái)的系統(tǒng)定量誤差。通過(guò)比較一線多評(píng)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法的計(jì)算結(jié)果，可知一線多評(píng)法所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便，節(jié)省對(duì)照品，可降低檢測(cè)成本和減少分析時(shí)間，為中藥一致性評(píng)價(jià)既提供了定量指紋圖譜控制方法，也提供了一線多評(píng)法的多指標(biāo)定量方法，達(dá)到了在整體上控制好化學(xué)指紋物質(zhì)一致性的目的。因此，中藥定量指紋圖譜聯(lián)合一線多評(píng)法構(gòu)成了中藥一致性評(píng)價(jià)的首要關(guān)鍵技術(shù)。本課題組在復(fù)方甘草片質(zhì)量一致性評(píng)價(jià)中充分使用標(biāo)準(zhǔn)制劑控制模型，用價(jià)廉易得的苯甲酸鈉對(duì)照品作為一測(cè)物來(lái)同時(shí)定量復(fù)方甘草片中其他4種藥效物質(zhì)，收到理想效果。