細胞外囊泡在肝移植中的應用進展

賈德功 賈志興 郭珊珊 程穎

肝移植是目前治療終末期肝病和肝臟不可切除性腫瘤的最終方法，但存在供者短缺、費用高、手術對機體的創(chuàng)傷較大、受者需要長期服用免疫抑制劑預防排斥反應以及可能發(fā)生其他嚴重并發(fā)癥等局限性[1-2]。其中缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）和排斥反應是導致肝移植失敗的重要原因。目前，對于IRI的治療大多停留在支持階段，缺乏特異性的藥物和治療方法，并不能很好地緩解IRI[3]。自20世紀80年代以來，鈣調磷酸酶抑制劑和其他免疫抑制劑的臨床應用使移植物1年存活率升高至80%[4]。但免疫抑制劑的長期使用會出現嚴重的不良反應，如惡性腫瘤、機會性感染、代謝紊亂和器官毒性等，肝移植術后存活超過1年的受者中，惡性腫瘤和感染是兩大主要死因，分別占16.4%和10.5%[5]。因此，急需研究出一種既能減輕IRI和排斥反應，又不影響受者整體免疫功能的新方法，以減少肝移植術后并發(fā)癥，提高肝移植的成功率。

細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是由真核細胞和原核細胞釋放到細胞外微環(huán)境、被磷脂雙層膜包裹的納米顆粒[6-7]，包括外泌體（exosome）、微 囊 泡（microvesicle） 和 凋 亡 小 體（apoptosis body）[8]。但由于某些特征和內容物的重疊，很難區(qū)分其不同的亞型。EV可攜帶多種參與細胞內信號轉導的物質，如微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA，miR）、小干擾核糖核酸（small interfering ribonucleic acid，siRNA）、DNA、蛋白質和脂質等[9]。在眾多體外和體內研究中，來自多種細胞系的EV已被證明具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗炎和組織修復等特性。有研究表明，在大鼠腎移植低溫灌注期，EV具有減輕移植物IRI和抑制排斥反應的作用[10]。而肝臟是EV治療的理想靶器官，因為EV經絕大多數系統給藥后，均會積聚在肝組織中[11]。動物實驗已經證明，IRI前、中、后使用EV，均可減輕組織損傷并促進組織修復[12]。這使EV成為肝移植領域一種十分具有吸引力的治療選擇。然而EV的實際臨床應用仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)，包括EV的分離、純化、鑒定、儲存和靶向遞送等。本文將總結EV在肝移植方面減輕IRI和促進同種異體移植物免疫耐受的作用機制，討論EV應用于臨床所需解決的問題，并對該領域未來的研究方向進行展望。

1 EV在肝IRI中的作用機制

1.1 修復自噬

近期研究表明，肝臟發(fā)生IRI后，增強自噬可提高肝細胞的活性和功能[13]。自噬長期以來被認為是對細胞應激的適應性反應，而細胞應激是一種防止細胞死亡的手段。在肝臟正常生理條件下，基礎水平的自噬可降解線粒體、衰老的細胞質和受損的蛋白，從而調節(jié)肝細胞脂質代謝、免疫應答和細胞死亡。當細胞受到缺血和缺氧等應激時，自噬被激活。但目前關于自噬在肝IRI中的變化和作用機制仍然不是很清楚。

研究表明，IRI可導致線粒體自噬紊亂，清除受損的線粒體能夠預防活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產生從而免受氧化應激損傷[13]。EV可以恢復線粒體自噬，而線粒體自噬可以通過減少細胞內鈣離子濃度和抑制分解代謝來緩解IRI[14]。Yang等[15]在小鼠部分肝IRI模型中，分離小鼠骨髓來源的間充質干細胞并將其轉化為間充質干細胞-肝細胞過渡表型細胞，從中分離出EV，再灌注前后通過尾靜脈注射到小鼠體內。結果發(fā)現，與對照組比較，EV處理組小鼠肝損傷程度較輕，且微管相關蛋白質輕鏈 3（microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3，LC3）-Ⅱ、p62和Beclin-1等自噬相關蛋白的表達水平發(fā)生了變化，表明IRI導致的線粒體異常自噬被修復。另一項研究在大鼠肝IRI模型中注射人臍帶血來源的間充質干細胞分泌的EV，發(fā)現EV與miR-20a共同應用除了肝保護作用，還可以修復自噬相關蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的異常表達[16]。以上研究表明，自噬過程的修復在EV對移植物條件改善中起到重要作用。

1.2 免疫抑制

在大鼠IRI模型中，注射人臍帶來源的間充質干細胞分泌的EV降低了促炎因子干擾素（interferon，IFN）-γ、 腫 瘤 壞 死 因 子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白細胞介素（interleukin，IL）-6的表達水平，并減少了中性粒細胞浸潤和呼吸爆發(fā)[17]。有研究發(fā)現，間充質干細胞分泌的EV可降低促炎因子IL-6和CC趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）7 的表達水平，增強NOD樣受體蛋白（NOD-like receptor protein，NLRP）12的表達，而NLRP12是一種可通過抑制非典型核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路抑制炎癥反應的蛋白[18]。Sun等[19]也發(fā)現在大鼠IRI模型中，注射小型豬脂肪細胞來源的間充質干細胞分泌的EV，可使巨噬細胞、樹突狀細胞、單核細胞和自然殺傷細胞的CD11、CD14和CD161表型的表達減少，且聯合應用褪黑素可以增強EV的免疫抑制功能以及對肝臟的保護作用。Nong等[20]發(fā)現在大鼠IRI模型中，注射間充質干細胞分泌的EV可減輕中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，降低髓過氧化物酶、TNF-α和IL-6等促炎因子的表達。也有研究者在小鼠IRI模型中發(fā)現，注射骨髓來源的樹突狀細胞分泌的EV可以減輕肝IRI，并通過誘導T細胞分化為調節(jié)性T細胞來調控免疫反應[21]。遺憾的是，這些研究均未提及EV對肝臟的長期影響。

有研究者在大鼠肝移植模型中發(fā)現，樹突狀細胞分泌的EV可以減輕肝損傷并且延長移植物存活時間，減少免疫細胞浸潤，促進調節(jié)性T細胞增殖和緩解同種異體移植排斥反應[22]。有趣的是，使用EV和調節(jié)性T細胞聯合治療的9只大鼠中，6只生存時間超過100 d，而未接受治療大鼠的中位生存期僅為10 d[22]。

以上研究闡示了EV對肝移植的免疫抑制機制，未來可通過研究肝免疫細胞群的表型和細胞因子信號通路，進一步探討影響移植物存活的免疫學機制。

1.3 組織再生

EV也能促進IRI后肝組織再生。在小鼠部分肝切除模型中，來自成人肝干細胞的EV能夠減少細胞凋亡并促進肝細胞增殖，且成人肝干細胞分泌的EV可促進70%肝切除大鼠的肝組織再生[23]。同時，多項研究發(fā)現，在IRI前注射間充質干細胞分泌的EV可以增強肝細胞Ki-67（一種細胞增殖標志物）的表達，這表明間充質干細胞分泌的EV可以刺激肝細胞增殖，從而促進IRI后肝組織再生[20,24]。Du等[10]通過觀察增殖細胞核抗原（proliferating nuclear antigen，PCNA）和磷酸化組蛋白 H3（phosphorylated histone H3，PHH3）等細胞增殖標志物發(fā)現，注射EV可以促進IRI后肝細胞的增殖。同時，該研究通過體外和體內實驗，探索了誘導增殖的信號通路，發(fā)現鞘氨醇-1-磷酸酯（sphingosine-1-phosphate，S1P）/鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）通路在肝細胞增殖中起重要作用。Nojima等[25]也發(fā)現EV可以攜帶SphK2刺激靶肝細胞S1P的產生，從而促進肝細胞增殖和肝組織再生。有趣的是，該研究通過靜脈向小鼠分別注射肝細胞、枯否細胞或血竇內皮細胞分泌的EV，發(fā)現只有肝細胞分泌的EV能起到作用。同時，Anger等[24]發(fā)現間充質干細胞分泌的EV可促進氧化應激后肝細胞增殖，而成纖維細胞分泌的EV未能對損傷的移植物產生類似的保護和再生作用。表明EV的保護和再生作用取決于來源的母細胞性質。

2 EV臨床應用面臨的挑戰(zhàn)

2.1 制 備

EV的臨床應用仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)。首先需要解決的是EV的制備問題。臨床應用級EV的培養(yǎng)需從細胞庫中選出具有遺傳穩(wěn)定性的特定細胞系進行體外擴增和培養(yǎng)。當EV達到一定濃度時，則需進一步分離和純化EV。目前已有多種技術用于分離和純化EV，其中超速離心法是使用最為廣泛的方法[26]。超速離心法可以根據密度從其他樣品組分中分離和濃縮EV，但存在產量低、儀器昂貴、處理時間長以及損傷EV外膜等缺點[27]。超速離心法得到的EV可以通過追加密度梯度步驟進一步提純[28]。凝膠排阻色譜法產量高、儀器便宜、簡單和高度可擴展，且可以兼容動態(tài)藥品生產質量管理規(guī)范（current Good Manufacturing Practices，cGMP），得到了越來越多的認可，但其受限于對EV的分辨率低[29]。其他方法包括過濾、沉淀和試劑盒等，均存在產量低、破壞EV的完整性、價格昂貴或不符合cGMP等缺點[30-31]。為了克服這些缺點，人們正在積極探索新方法，如在切向流過濾裝置和生物反應器中培養(yǎng)細胞，通過尺寸排除層析法提高EV產量和純化EV[32]。同樣，乙醇調節(jié)和三維灌注生物反應器的聯合使用也被證明可以提高EV的產量和效能[33]。無論選擇哪一種分離和純化方法，都應著重評估該方法對EV制備和功能的影響。

2.2 儲 存

EV的長期儲存也是臨床應用的一個關鍵問題。雖然有研究表明EV經過反復凍融，在-20 ℃保存6個月后仍可保持穩(wěn)定性，但也有研究表明在3次凍融循環(huán)后，EV的完整性就會喪失[34-35]。EV可以進行凍干制成現成產品，在保留其功能的同時降低生產和存儲成本[36]。然而，存儲介質在EV完整性中起著至關重要的作用，即使少量的離子也會引起pH值變化，導致EV聚集和功能喪失[37]。因此，需要優(yōu)化長期存儲條件，防止EV功能損害。

2.3 遞 送

EV的另一項臨床應用的挑戰(zhàn)是特異性遞送到靶細胞。研究者們在動物實驗中對不同EV給藥途徑進行了評估，其中靜脈給藥是最為常見[38]。一些關于EV治療作用的研究描述了通過靜脈給藥的方式將間充質干細胞或脂肪干細胞分泌的EV遞送到靶器官或組織，如肺血管、頸動脈、心臟、肺、胰腺、肝臟和結腸[39-45]。基于這一證據，靜脈注射間充質干細胞或脂肪干細胞分泌的EV似乎不能為特定器官提供足夠的特異性。同時，值得一提的是，這些研究大多沒有評估相同的實驗方法是否會對除靶器官或靶組織之外的其他器官或組織產生影響。因此，對EV表面蛋白質組和靶細胞表面聚糖圖譜的特性描述可以顯著提高EV靶特異性。

3 EV的潛在應用

目前已有多家公司參與了EV療法的早期開發(fā)，其中幾家已經進入Ⅲ期臨床試驗[46]。如美國Aegle Therapeutics公司使用骨髓來源間充質干細胞分泌的EV治療大皰性營養(yǎng)不良；美國Aruna Biomedical公司使用神經干細胞分泌的EV治療腦卒中和肌萎縮側索硬化；澳大利亞Exopharm公司使用來源于自體血小板分泌的EV促進傷口愈合。以上證據表明EV在臨床應用中具有較大的潛力。研究開發(fā)具有成本效益、符合cGMP要求的方法和設施，用于大規(guī)模生產臨床級EV，是實現EV廣泛臨床應用的必要條件。盡管具有挑戰(zhàn)性，但將為EV未來的治療應用打開大門。

在過去的十年里，人們逐漸認識到EV在細胞間信號傳遞中的作用及其作為生物標志物的潛能。體外和體內研究表明EV具有免疫調節(jié)、抗氧化、抗炎和組織修復等特性，且EV受到囊泡膜蛋白的保護，因此具有一定的穩(wěn)定性和生物安全性。迄今為止，已有多項研究探索了EV作為一種新的治療方法在減輕肝IRI和同種異體肝移植模型移植物損傷中的作用，證實了EV具有改善肝IRI的潛力，并闡述了潛在的機制，包括修復自噬、免疫抑制和組織再生。以間充質干細胞為代表的細胞療法適合應用于肺IRI，因為靜脈注射的細胞體積大，往往被困在小的肺毛細血管中，促進其在肺組織中積聚[47]。與之相反，肝臟由于血管開窗作用和枯否細胞駐留，可以促進納米顆粒在其中選擇性沉積[48]。EV在肝臟中高水平積聚，因此肝臟是EV作用的理想靶點。另外，在肝移植領域，EV的給藥時間更是十分靈活，可在缺血前（器官動脈夾閉）、在器官保存或體外灌注期間、再灌注前以及再灌注后。體外機械灌注更是為EV在肝移植領域的應用提供了一種新的選擇。在移植前將EV遞送到供肝，避免了在獲得供肝前進行器官修整的相關倫理問題。

為了進一步改善治療方法，可以在EV內裝載具有減輕炎癥反應、抑制細胞死亡或者降低氧化應激水平的藥物。通過合成納米顆粒進行給藥在臨床中已十分常見[49]，這種方式有助于從對同一疾病統一治療的舊模式向根據病人參數進行個體化治療的新模式轉變。例如，脂質體是一種在大小、形狀和結構上與EV相似的人工合成納米顆粒級別的脂質，自20世紀90年代以來，一直被用于遞送化學藥物治療（化療）藥物和抗真菌藥物到病人體內，改善了藥物的藥代動力學和特異性靶向遞送，減少了藥物的不良反應，提高了治療效果[50-53]，但仍存在著高免疫原性、高毒性和高清除率等缺點[54]。而EV則表現出較低的毒性和免疫原性，且較少被巨噬細胞吞噬，因此可以在循環(huán)系統和組織中停留較長時間[55]。截止至投稿日，美國國立衛(wèi)生研究院網站已經注冊了51項涉及使用治療性EV的臨床試驗，包括通過植入EV將姜黃素遞送到結腸癌組織中（NCT01294072）、通過EV將治療性siRNA遞送到胰腺癌組織中（NCT03608631）等。雖然目前還沒有研究結果，但這些研究可能會為EV遞送治療藥物的臨床實踐提供借鑒。不僅如此，類似其他人工合成的納米顆粒，EV未來的潛在應用還應包括聯合療法，即不同的藥物被共同裝載到EV中，以確保受體細胞暴露于最佳的藥物濃度比例中[56-58]。

4 小結與展望

部分動物模型研究表明EV具有緩解IRI和促進同種異體移植物免疫耐受的作用，但其安全性還需要進一步研究。EV的臨床應用面臨著生產、分離、純化、儲存以及將如何將EV遞送到靶細胞等問題。盡管關于EV的眾多問題仍未得到解答，技術和實驗方面的挑戰(zhàn)也阻礙了其從實驗室到臨床試驗的轉化，但這種新穎的方法具有極高的應用前景?？傊?，在肝移植中，EV是一種十分具有吸引力的新型治療方法，具有改善肝IRI和減輕排斥反應的潛力，值得進一步研究。