反相高效液相色譜法測定常見食品中乳酸、富馬酸的含量

陳振中

（中科檢測技術(shù)服務(wù)（廣州）股份有限公司，廣東廣州 510000）

富馬酸即名延胡索酸，富馬酸可作為酸度調(diào)節(jié)劑、酸化劑、抗氧化助劑、腌制促進劑和香料使用。本品有強緩沖作用，保持水溶液pH在3.0左右，并對抑菌防霉有重要作用，同時有澀味，是酸味極強的固體酸之一，吸收率低，有助于延長粉末制品等的保存期。當富馬酸變?yōu)楦获R酸鈉后，水溶性及風味均更好。乳酸有很強的防腐保鮮功效，可用在果酒、飲料、糕點等食品中具有調(diào)節(jié)pH值、抑菌、延長保質(zhì)期、調(diào)味、保持食品色澤和提高產(chǎn)品質(zhì)量等作用，食品中加入一定量的乳酸，可保持產(chǎn)品中的微生物的穩(wěn)定性、安全性，同時使口味更加溫和[1]。

現(xiàn)行有效的高效液相色譜法檢測食品中的富馬酸、乳酸的方法一般局限在飼料、果汁、農(nóng)產(chǎn)品等，鮮有運用高效液相色譜法同時測定食品中的富馬酸、乳酸的方法。本實驗建立了常見食品中乳酸、富馬酸提取及反相高效液相色譜的測定方法，選用含乳飲料、葡萄酒、糕點為基質(zhì)，添加乳酸、富馬酸標準品混勻，用水浸泡、稀釋至刻度，搖勻，5 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm無機濾膜后作為樣液，然后以高效液相色譜反相C18柱分離，通過PDA二極管陣列檢測器檢測[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試含乳飲料（原味椰子果粒酸奶飲品，廣州市貝奇飲料有限公司生產(chǎn)）；供試葡萄酒（菲芃莊園葡萄酒，廣州市圣羅倫酒業(yè)有限公司生產(chǎn)）；供試糕點（核桃包，廣州包多寶食品有限公司生產(chǎn)）；乳酸標準品（含量89.9%，英國LGC公司）；富馬酸標準品（含量99.2%，英國LGC公司）；磷酸二氫銨（分析純，廣州化學試劑廠）；超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance e2695高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters公司）；2998 PDA Detector光電二極管陣列檢測器（美國Waters公司）；Uranus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm，廣州菲羅門科學儀器有限公司），電子分析天平（GH-252，廣州市艾安得儀器有限公司）；超聲波清洗機（GT-2013QTS，廣東固特超聲股份有限公司）；低速離心機（KA-1000，上海安亭科學儀器廠）；Cascada I 超純水儀（美國PALL公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸、富馬酸標準溶液配制

秤取乳酸標準品55.6 mg、富馬酸標準品50.4 mg，分別加水轉(zhuǎn)移至50.0 mL容量瓶中，定容至刻度，配置成濃度均為1.0 mg/mL的乳酸、富馬酸標準儲備溶液。分別吸取適量乳酸、富馬酸標準儲備溶液于50.0 mL容量瓶中，配制成6個不同濃度混標（包括空白試樣）。乳酸標準曲線濃度范圍：0 μg/mL、8.33 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL、250.00 μg/mL；富馬酸標準曲線濃度范圍：0 μg/mL、0.083 3 μg/mL、0.250 0 μg/mL、5.000 0 μg/mL、10.000 0 μg/mL、25.000 0 μg/mL。

乳酸、富馬酸在上述濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。線性回歸方程分別為：乳酸Y=16.733x-11.673、富馬酸Y=8.180x-5.590。相關(guān)系數(shù)分別為：乳酸R=0.999 97、富馬酸R=0.999 98

1.3.2 高效液相色譜條件

色譜柱：Uranus C18色譜柱 4.6 mm×250 mm×5 μm；流動相：1 mol/L磷酸二氫銨溶液，磷酸調(diào)節(jié)pH=2.5；流速：0.6 mL/min；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL。

1.3.3 樣品前處理

取有代表性樣品500 g混合均勻，裝入潔凈容器內(nèi)密閉并標明標記，于4 ℃保存。秤取樣品約5 g（精確到0.000 1 g）于50 mL容量瓶中，25 mL超純水水浸泡1 h，超聲提取1 h，稀釋至刻度，搖勻，5 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm無機濾膜后作為樣液，供HPLC測定。

1.3.4 流動相pH值相關(guān)性實驗

配制1 mol/L磷酸二氫銨溶液并用磷酸調(diào)節(jié)pH值，分別配制成pH=2.0、pH=2.5、pH=3.0的1 mol/L磷酸二氫銨溶液，分別以此作為流動相上機檢測，其他色譜條件不變。收集乳酸、富馬酸標樣保留時間、峰寬、分離度，分析兩者與流動相pH值的相關(guān)性，選擇最優(yōu)流動相pH值進行后續(xù)實驗。

1.3.5 方法檢出限實驗

選用信噪比法確定方法檢出限。分別稱取500.0 g 3種基質(zhì)樣品各3份，并分別添加乳酸、富馬酸標準物質(zhì)10.0 mg、0.10 mg；50.0 mg、0.50 mg；100.0 mg、1.00 mg，每種基質(zhì)樣品中乳酸、富馬酸樣品濃度水平 分 別 為 20.0 mg/kg、0.20 mg/kg；100.0 mg/kg、1.00 mg/kg；200.0 mg/kg、2.00 mg/kg。稱取適量樣品前處理后上機檢測，確定本實驗室對本方法的檢出限。

1.3.6 方法回收率與重復性實驗

稱取葡萄酒、含乳飲料、糕點3種基質(zhì)樣品500.0 g各兩份，樣品中分別添加乳酸、富馬酸標準物質(zhì)125.0 mg，1.25 mg樣品濃度水平為乳酸250.0 mg/kg、富馬酸2.50 mg/kg。按照本文樣品前處理方法提取及凈化處理樣品得到1.0 mL樣液 ，用高效液相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相pH值相關(guān)性

實驗數(shù)據(jù)如表1所示。由表1可知，當流動相pH=2.5、pH=3.0時，分離度（R）分別為3.183、7.821，均＞2，有較好分離度。當流動相pH=2.5時，所有待測物完全出峰所需時間適中，且分離度（R）＞2，所以后續(xù)實驗流動相pH均選擇pH=2.5。標準樣中目標物的色譜圖見圖1；葡萄酒、含乳飲料、糕點3種基質(zhì)中目標物色譜圖分別見圖2～4。

表1 流動相pH值對目標位分離度的影響

圖1 標準樣色譜圖

圖2 葡萄酒基質(zhì)色譜圖

圖3 含乳飲料基質(zhì)色譜圖

圖4 糕點基質(zhì)色譜圖

2.2 方法檢出限

本文主要選用信噪比法進行研究。峰高及基線最大波動值數(shù)據(jù)如表2。由表2可知，乳酸濃度水平為100.0 mg/kg、富馬酸度水平為0.020 mg/kg時，信噪比明顯，分別為5倍、2倍，所以本實驗以乳酸濃度水平100.0 mg/kg、富馬酸度水平0.020 mg/kg為方法檢出限，與行業(yè)標準《進出口果汁中乳酸、檸檬酸、富馬酸含量檢測方法 高效液相色譜法》（SN/T 2007—2007）方法檢出限相近，符合要求。

表2 不同濃度下各基質(zhì)中目標物的峰高及基線最大波動值數(shù)據(jù)

2.3 方法回收率與重復性實驗

用高效液相色譜分析，每種基質(zhì)樣品重復測定6次，進行加標回收和精密度實驗，結(jié)果計算實驗數(shù)據(jù)如表3所示。本次實驗樣品基質(zhì)空白為0，樣品濃度水平為乳酸250.0 mg/kg、富馬酸2.50 mg/kg，葡萄酒、含乳飲料、糕點3種樣品基質(zhì)平均添加回收率分別為乳酸97.7%、95.5%、99.1%，富馬酸96.3%、95.5%、97.9%；相對標準偏差分別為乳酸1.1%、1.5%、4.4%，富馬酸1.2%、1.0%、0.3%，結(jié)果表明該方法精密度、重現(xiàn)性良好。

表3 各基質(zhì)中目標物的回收率和精密度

3 結(jié)論

本方法具有較低的檢出限，較好的靈敏度與重現(xiàn)性，能夠簡單、快速、靈敏地對常見食品基質(zhì)中的乳酸、富馬酸實現(xiàn)較好地分離、定性與定量，適用于常見食品基質(zhì)中乳酸、富馬酸含量的測定，適用于常見食品基質(zhì)中乳酸、富馬酸含量檢測。