高效液相色譜法測定飼料中膽固醇

侯林叢，劉麗芳，陸 靜，劉丹丹，蘭尊海＊

（1.河南海瑞正檢測技術有限公司，河南 鄭州 450001；2.河南工業(yè)大學生物工程學院）

膽固醇又稱膽甾醇，一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，膽固醇是動物體維持正常生理活動所必需的物質，在動物體內經過代謝還能轉化為膽汁酸、7-脫氫膽固醇，且7-脫氫膽固醇經紫外線照射會轉變成為維生素D3，適量的膽固醇對維持機體正常生理功能具有重要意義。但堆積過多的膽固醇也會影響動物的健康。從20世紀80年代開始，膽固醇逐漸成為國內外研究的熱點［1］。

目前膽固醇的測定方法主要有直接試劑盒法和間接試劑盒法［2］、氣相色譜法［3-6］、短波近紅外光譜法［7］、氣相色譜-質譜法［8-12］、高效液相色譜法［13-20］、比色法［21-23］、液相色譜-質譜法［24-27］等。其中比色法是傳統(tǒng)方法，操作復雜，所需試劑較多，結果有偏差故而不能廣泛應用，質譜法對儀器和人員的要求較高，在一定程度上增加了檢測的成本。該研究通過與氣相色譜法進行試驗比對后，在大量試驗基礎上優(yōu)化飼料中膽固醇的高效液相色譜法測定條件，以期為基層檢測機構及飼料生產企業(yè)的檢驗人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

e2695高效液相色譜儀，配紫外檢測器；BSA224S分析天平；旋轉蒸發(fā)器。

膽固醇標準品（純度≥99%）、甲醇（色譜純）、無水乙醚（分析純）、抗壞血酸（分析純）、無水乙醇（分析純）、氫氧化鉀（分析純）；蒸餾水、高純水。

飼料原料、配合飼料、濃縮飼料等均為客戶委托檢測的樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 皂化

稱取適量樣品于250 ml 錐形瓶中，加入1g 抗壞血酸、30 ml 無水乙醇、10 ml 50%氫氧化鉀溶液，混勻，沸水浴回流40 min，期間不斷搖晃錐形瓶，防止樣品粘底。皂化完成，分別用無水乙醇和蒸餾水自冷凝管頂端沖洗其內部，取出錐形瓶，用冷水迅速沖涼，放置避光處。

1.2.1.2 提取

用蒸餾水將皂化液轉移至分液漏斗內，分別用40 ml、30 ml、30 ml分3次萃取，棄去水相，合并乙醚層，用蒸餾水洗滌至中性，萃取的過程要防止損失，如產生乳化現象，可加少量的乙醇進行破乳。

智能變電站裝配式建筑造價評價問題的條件假設數學描述如下：假設智能變電站裝配式建筑工程池中有n個裝配式建筑工程造價水平待綜合評價，則可供選擇的裝配式建筑工程集為N={N1,…,Nk,…,Nn}，其中表示n個造價影響因子，影響因子權重向量表示為假設有m位專家參與裝配式建筑造價評價，則將專家集表示為S={S1,S2,…,Sm}，專家權重向量表示為

1.2.1.3 濃縮

將洗至中性的乙醚提取液通過無水硫酸鈉脫水后放置于旋轉蒸發(fā)器上50 ℃旋蒸至近干，并回收乙醚，用甲醇轉移至容量瓶中定容，并稀釋至適當的濃度，0.45 μm濾膜過濾，用于高效液相色譜儀分析。

1.2.2 標準溶液配制

膽固醇標準貯備液（1 mg/ml）：準確稱取100 mg 膽固醇標準品用無水乙醇溶解定容，搖勻配制成標準貯備液，4 ℃密封避光保存，有效期6個月。

膽固醇標準使用液：分別移取一定體積的膽固醇標準貯備液于100 ml棕色容量瓶中，用甲醇定容，配制成10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、500 μg/ml系列標準工作溶液，待測。

2.2.3 色譜條件

C18柱，長250 mm，內徑4.5 mm，粒徑5 μm；甲醇∶水（96∶4，V∶V）。流速1.0 ml/min。檢測波長205 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μl。

2.2.4 計算公式

c—由標準曲線得出的試樣溶液中膽固醇的質量濃度，μg/ml；

V—試樣定容體積，ml；

m—試樣質量，g。

3 結果與分析

3.1 前處理條件的優(yōu)化

3.1.1 皂化時間的選擇

比較了20 min、40 min、60 min 3種不同時間的皂化效率，皂化效率排序為60 min≥40 min＞20 min，在考慮到效率的問題上，選用了40 min 作為皂化時間，3 組樣品不同皂化時間的回收率及相對標準偏差（RSD）結果見表1。

表1 不同皂化時間的結果（n=3）

3.1.2 提取溶劑的選擇

該方法選用同一樣品，采用相同的皂化時間平行測定3次，比較正己烷、無水乙醚、石油醚等3種提取溶劑的影響，發(fā)現提取溶劑對回收率的影響較大。使用正己烷時，回收率較低；無水乙醚和石油醚的回收率基本一致，但使用石油醚作為提取溶劑時，樣品分層較慢，且容易乳化，耗時較長。綜合考慮，選擇無水乙醚作為提取溶劑。不同提取溶劑的回收率及RSD結果見表2。

表2 不同提取時間的結果（n=3）

3.1.3 流動相的選擇

該研究使用甲醇∶水（96∶4，V∶V）、甲醇、乙腈∶水（96 ∶4，V ∶V）3 種流動相對標準溶液及樣品溶液進行分離測定，通過調節(jié)流動相中各組分的比例，使流動相的極性發(fā)生變化，改變分離效率。結果表明，不同流動相的色譜峰保留時間及峰型各有不同，當流動相為甲醇∶水時，色譜峰峰型較好，保留時間為21 min左右，膽固醇標準溶液和樣品溶液色譜圖見圖1、圖2。

圖1 膽固醇標準溶液色譜圖

圖2 膽固醇樣品溶液色譜圖

3.2 方法線性和檢出限

分別移取標準使用溶液注入高效液相色譜儀中，以其濃度值為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。濃度范圍在10.0～500.0 μg/ml時，溶液濃度和色譜峰面積呈現良好的線性關系，Y=3092X+4394.4，r2=0.9995。

取空白樣品，按照樣品處理程序處理后上機測定。另取多份空白樣品，加入不同的較低濃度的膽固醇標準工作液，按照樣品處理程序處理后上機測定，對比結果，將引起3 倍信噪比時的濃度定義為方法檢出限，當樣品稱樣量為5 g時，該方法檢出限為1.0 mg/kg，方法靈敏度較高。

3.3 方法精密度

選取飼料原料（雞腸粉）、豬配合飼料、豬濃縮飼料等3 種不同的飼料產品進行精密度試驗（n=6），測定結果見表3，可以看出，3種不同飼料產品的RSD均不大于5.0%，說明該方法的準確度較高。

表3 精密度測定結果（n=6）

3.4 回收率試驗結果

取不同基質的空白樣品為本底樣品，分別添加2.0 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg 3個不同濃度的膽固醇標準溶液，按照該方法進行試驗操作，平行測定3 次，回收率在88.6%～93.2%之間，RSD 為0.89%～3.65%，方法回收率較高，詳見表4。

表4 回收率測定結果（n=3）

3.5 不同方法結果的比較

利用該研究建立的方法針對同一樣品與現有的氣相色譜法進行了結果比較，結果見表5。結果表明，兩種方法結果差異不顯著。

表5 兩種方法的檢測結果

4 結論與討論

該研究建立了飼料中膽固醇的高效液相色譜測定方法。通過對皂化時間、提取溶劑進行優(yōu)化，分別對飼料原料、配合飼料、濃縮飼料等3 種不同的飼料樣品進行了精密度、準確度及靈敏度試驗，測得6 組數據的相對標準偏差為1.64%～2.09%，不同添加量的平均回收率為88.6%～93.2%，方法的檢出限為1.0 mg/kg。優(yōu)化后的方法重復性好、準確度高、基質干擾小。通過實際樣品的檢測，說明該方法有較廣泛的適用范圍。