環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在病原微生物快速檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展

劉昌亞 任曉東

（昭通衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 云南昭通 657000）

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)是2000年日本學(xué)者Notomi[1]發(fā)明的一種適用于基因診斷的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)4種特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（60℃～65℃左右）1h內(nèi)即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。該技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.特異性高。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增過程中有2對(duì)引物確保反應(yīng)的特異性，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件（60℃～65℃左右）1h左右即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。而傳統(tǒng)PCR只有一對(duì)引物，因此LAMP法擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性更高。

2.靈敏度高。等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)過程中不需歷經(jīng)溫度反復(fù)變化，從而擴(kuò)增酶能保持更好的活性，有助于反應(yīng)的發(fā)生，這些優(yōu)點(diǎn)有利于此方法的靈敏度提高。

3.檢測時(shí)間短。整個(gè)反應(yīng)時(shí)間約為1小時(shí)，比傳統(tǒng)PCR過程要縮短近1小時(shí)，比血培養(yǎng)縮短至少24小時(shí)，有利于快速為患者提供服務(wù)[2]。

4.易操作和污染風(fēng)險(xiǎn)低。只需將DNA模板加入反應(yīng)體系即可檢測，加樣后反應(yīng)孔封閉，檢測完成后不需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行再次分析可避免產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)。

5.成本低因?yàn)榉磻?yīng)過程簡單，故相對(duì)于RT-PCR來說對(duì)儀器性能要求沒那么高，因此也降低了設(shè)備的費(fèi)用，適合基層醫(yī)院做出病原菌的快速診斷[2-3]。

6.技術(shù)門檻相對(duì)較低。整個(gè)操作過程中只涉及核酸提取和擴(kuò)增，而這兩步操作均可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，因此對(duì)人員的要求相對(duì)降低，也降低了此技術(shù)的門檻，有利于技術(shù)在臨床的推廣。

LAMP其工作原理包括三個(gè)步驟：1.起始反應(yīng)物模板的合成，即先由外引物擴(kuò)增出內(nèi)引物擴(kuò)增所需的模板，起始階段時(shí)間很短；2.循環(huán)擴(kuò)增階段。即由內(nèi)引物引導(dǎo)合成靶基因DNA片段。由于內(nèi)引物擴(kuò)增的DNA片段含有5’端DNA片段的反向互補(bǔ)序列，因而反向互補(bǔ)序列之間可通過雜交形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，另外一條內(nèi)引物與其互補(bǔ)鏈退火雜交后引導(dǎo)鏈置換合成反應(yīng)，在擴(kuò)增的DNA片段的另外一端產(chǎn)生了新的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，形成啞鈴結(jié)構(gòu)，如此往復(fù)循環(huán)，最后形成菜花樣結(jié)構(gòu)；擴(kuò)增循環(huán)階段占全面擴(kuò)增時(shí)間的95%以上。

一、LAMP技術(shù)在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用

（一）腦脊液結(jié)核分枝桿菌

結(jié)核性腦膜炎（TBM）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致命并發(fā)癥[4]。治療TBM的主要問題在于早期診斷不及時(shí)。TBM的診斷依賴于抗酸桿菌（AFB）染色和細(xì)菌培養(yǎng)對(duì)腦脊液結(jié)核分枝桿菌的檢測，但腦脊液的AFB染色并不十分敏感。雖然TBM在培養(yǎng)時(shí)的敏感性優(yōu)于AFB染色，但它需要3～5周的時(shí)間，因此無法提供適當(dāng)?shù)摹⒓皶r(shí)的診斷[5]。Khushboo等人的研究中使用LAMP分析方法對(duì)27個(gè)腦脊液標(biāo)本進(jìn)行回顧性分析，并將結(jié)果與PCR檢測結(jié)果進(jìn)行比較。LAMP分析靈敏度為10CFU/100uL，PCR的分析靈敏度為20CFU/100uL，低于LAMP的分析靈敏度。一些低濃度細(xì)菌的樣本用LAMP法檢測是陽性的，但PCR檢測是陰性的。進(jìn)一步觀察，這些實(shí)際陽性但利用PCR檢測結(jié)果陰性的樣本具有較低的OD值，通過患者隨訪進(jìn)一步分析這些樣本，證實(shí)它們是陽性樣本。這表明，LAMP對(duì)于檢測早期疾病的TBM病例靈敏度更高。

（二）沙門氏菌

沙門氏菌（Salmonella）是引起食源性疾病的主要病原菌，在我國食源性疾病中，沙門菌是最主要的致病因子之一。目前所使用的沙門氏菌分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)、血清學(xué)和PCR技術(shù)等檢測方法在操作程序、檢測時(shí)間、特異性和靈敏度方面都不理想。2019年，李陽等用LAMP對(duì)生理鹽水作倍比稀釋的沙門菌進(jìn)行檢測，檢出時(shí)間為40min，最低檢測限達(dá)8.7×100cfu/mL，靈敏度比PCR高100倍；對(duì)人工污染雞蛋內(nèi)容物中沙門菌的最低檢測限達(dá)9.5×100cfu/mL。本實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增現(xiàn)象只在沙門菌中發(fā)生，而在其他細(xì)菌中無擴(kuò)增現(xiàn)象[6]?？梢?，LAMP是一種更快速、更靈敏、特異性更高的檢測技術(shù)。

二、LAMP技術(shù)在病毒鑒定中的應(yīng)用

（一）人乳頭瘤病毒

高危型人乳頭瘤病毒（HPV）是子宮頸癌的病原體，通過檢測高危型HPV的DNA作為主要篩查工具。HPV基因型16和18是全世界最流行的基因型[7-8]。HPV基因型45在世界所有地區(qū)都非常流行，并經(jīng)常在宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN 2+）和侵襲性宮頸癌（ICC）中發(fā)現(xiàn)，其中2～8%的為子宮頸癌[7-8]。HPV基因型52和58在亞洲人群中普遍存在，尤其是在中國[9]。羅樂等人的研究中，使用HNB染色的LAMP法對(duì)檢測高危HPV基因型16、18、45、52和58型進(jìn)行檢測，檢測的靈敏度分別為100、10、100、10、100個(gè)拷貝/管，LAMP法只擴(kuò)增了各自類型的HPV DNA，沒有交叉反應(yīng)，通過LAMP法檢測的陽性率和PCR法基本一致?；谑褂肏NB染色的LAMP檢測方法的簡單性和成本效益，使得它更適合在臨床環(huán)境中快速檢測，特別是在資源有限的醫(yī)院或農(nóng)村診所。

（二）丙型肝炎病毒

丙型肝炎病毒（HCV）是人類慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌發(fā)生的重要病因。HCV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和PCR分別檢測抗體和HCV-RNA[10]。HCV抗體檢測是非常有效的方法，但HCV感染后，抗HCV抗體出現(xiàn)得較慢，所以該病毒感染早期無法用常規(guī)的免疫學(xué)方法檢測出病毒抗體。PCR法檢測不僅過程繁瑣，而且特異性低和易交叉污染。隨著LAMP技術(shù)的出現(xiàn)，趙娜等人利用RT-LAMP進(jìn)行臨床樣本丙型肝炎病毒檢測，RT-LAMP的特異性與靈敏度分別為100%、92.31%；而以FQ-PCR為金標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，特異性雖為100%，但靈敏度只有69.23%[11]。RT-LAMP的假陰性率低于FQ-PCR，臨床陽性標(biāo)本漏檢率低。

三、LAMP技術(shù)在真菌鑒定中的應(yīng)用

（一）假絲酵母菌

假絲酵母菌是一類深部感染真菌，對(duì)人致病的有白假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等，其中以白假絲酵母菌感染最為多見，可占感染的75%，白假絲酵母菌是重要的條件致病菌，占深部真菌感染的首位[12]。林江等人通過LAMP技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株和對(duì)照菌株的研究顯示：假絲酵母菌各菌種均能進(jìn)行特異性的LAMP反應(yīng)，靈敏度達(dá)102CFU/mL，為PCR的10倍；通過對(duì)52份臨床樣品分別進(jìn)行培養(yǎng)和LAMP檢測證實(shí)，LAMP方法在陽性率、靈敏度方面明顯優(yōu)于培養(yǎng)法[13]。

（二）新型隱球菌

新型隱球菌是一種條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)可向全身播散，主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起真菌性腦膜炎、腦炎、腦肉芽腫等，其中引起的腦膜炎在艾滋病患者中非常常見。李東冬等人選取引起腦膜炎最常見的11種病原菌，通過LAMP法進(jìn)行特異性擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)僅對(duì)新型隱球菌產(chǎn)生擴(kuò)增，特異性好；且LAMP檢測新型隱球菌的靈敏度為102/mL，與熒光PCR的最低檢測線相同，敏感度高[14]。

四、LAMP技術(shù)在寄生蟲鑒定中的應(yīng)用

（一）隱孢子蟲

隱孢子蟲中最為常見的是微小隱孢子蟲，引起的隱孢子蟲病是一種以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的人畜共患原蟲病。隱孢子蟲是重要的機(jī)會(huì)致病性原蟲，WHO于1986年將人隱孢子蟲病定為艾滋病懷疑指標(biāo)之一。史亞東等人利用LAPM檢測微小隱孢子蟲的檢測限度是5×100個(gè)卵囊/uL，檢測靈敏度為常規(guī)PCR的10倍[15]，特異性實(shí)驗(yàn)中微小隱孢子蟲出現(xiàn)特異梯裝條帶，賈第蟲、球蟲、類圓線蟲、腸阿米巴及雙蒸餾水無特異梯裝條帶，特異性好。

（二）弓形蟲

弓形蟲病是由剛地弓形蟲所引起的人畜共患病。它廣泛寄生在人和動(dòng)物的有核細(xì)胞內(nèi)。弓形蟲的檢測過去普遍采用ELISA，但該方法特異性和靈敏度低。以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)雖然快速、靈敏，但假陽性高。宇芙蓉等人利用LAMP檢測方法對(duì)臨床100例弓形蟲IgG或（和）IgM抗體陽性血液及50例陰性參考血液標(biāo)本進(jìn)行檢測，并和PCR檢測方法進(jìn)行靈敏度和特異性比較。LAMP檢測的靈敏度為10-8，PCR檢測的靈敏度為10-6，LAMP靈敏度為PCR的100倍。在LAMP檢查中100例均檢測陽性，陽性率為100%，遠(yuǎn)高于PCR檢測方法中74%的陽性率，且50例陰性參考血液標(biāo)本陽性率為0%，具有很好的特異性[16]。

五、LAMP檢測技術(shù)發(fā)展前景展望

在2000年LAMP檢測技術(shù)發(fā)明以來，各個(gè)方面的研究報(bào)道逐年增加。LAMP是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、便捷快速的基因檢測技術(shù)，如果對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化、完善，該技術(shù)必將在病原微生物診斷領(lǐng)域發(fā)揮極其重要的作用。若研發(fā)出碟式微流控芯片，將多種細(xì)菌的引物同時(shí)設(shè)計(jì)在該芯片上，可同時(shí)對(duì)多種細(xì)菌同時(shí)進(jìn)行檢測，對(duì)于臨床疾病的診斷和合理的用藥提供重要的依據(jù)。我們有理由相信，LAMP作為一種核酸擴(kuò)增的快速檢測方法，在病原體基因檢測方面發(fā)揮重要作用并逐漸應(yīng)用于臨床。