關(guān)于中國報道Peutz-Jeghers綜合征中STK11突變的定性研究

蔣宇亮,李偉聰,趙子夜,吳 靜,寧守斌,劉 紅*

(1.首都醫(yī)科大學附屬世紀壇醫(yī)院消化科，北京100038；2.北京市航天中心醫(yī)院健康管理部,北京 100040；3.上海長海醫(yī)院肛腸外科，上海 200433；4.首都醫(yī)科大學附屬友誼醫(yī)院消化科，北京 100050；5.中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學中心消化科，北京 100142)

Peutz-Jeghers綜合征(Peutz-Jeghers syndrome,PJS)是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病，發(fā)病率為1/50 000～1/200 000[1]。因該病發(fā)病率極低，有關(guān)PJS的報道多為病例報告、病例系列和病例回顧，而包含大量病例的隊列研究則很少。該病以胃腸道多發(fā)性息肉、皮膚黏膜色素沉著斑和腫瘤易感性為主要特征[2]。目前PJS診斷要素包括：胃腸道錯構(gòu)性息肉、皮膚黏膜色素沉著斑和疾病家族史[3-4]。因PJS患者具有明顯的家族聚集性，且惡性腫瘤風險比一般人群高9～18倍，尤其大腸癌的腫瘤終生風險可達39%[5]，故該病被納入遺傳性結(jié)直腸癌綜合征[4]之中，如Lynch綜合征、家族性腺瘤性息肉病等。隨著近年來研究的深入，多位學者研究發(fā)現(xiàn)不同突變位點及類型，可能影響PJS的臨床表現(xiàn)，尤其惡性腫瘤發(fā)生率[6-7]。在PJS患者中連續(xù)發(fā)現(xiàn)STK11突變，并確定絲氨酸-蘇氨酸激酶11(STK11 / LKB1，OMIM 602216)為PJS的主要致病基因。因檢測數(shù)量和采用的檢測方式不同，導(dǎo)致致突變檢出率差異較大。目前檢測方法包括Sanger測序、二代測序(next-generation sequencing,NGS)和多重連鎖依賴性探針擴增分析(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)等。其中，Sanger測序聯(lián)合MLPA或NGS聯(lián)合MLPA是目前為止最好的組合檢測策略，檢出率為60%～100%[2]。這些被檢測到的突變會被記錄在孟德爾遺傳在線(online mendelian inheritance in man,OMIM)、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(human gene mutation database,HGMD)、ClinVar等數(shù)據(jù)庫中，臨床醫(yī)生可通過檢索并進行基因型-表型關(guān)聯(lián)、遺傳咨詢等相關(guān)工作。但是，隨著測序技術(shù)進步和突變命名規(guī)則確立等多種原因，數(shù)據(jù)庫所記錄的突變中存在的問題逐漸被認識。其中部分問題可能會影響上述臨床工作，如對PJS患者致病突變的鑒定和由此展開的遺傳咨詢，還會導(dǎo)致新發(fā)突變的錯誤報道，進而引起后續(xù)的報道錯誤。為了探究這些問題的發(fā)生原因，本研究對中國PJS患者中報道的STK11突變進行了全面檢索及分析。希望通過揭示該現(xiàn)象發(fā)生的原因，為新發(fā)現(xiàn)突變的標準表達提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 檢索Medline、PubMed、Embase、萬方數(shù)據(jù)庫、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)、中國生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫(CBM & SinoMed)。檢索年限：從創(chuàng)刊至2020年12月31日。中文主題詞：“中國或中國人、Peutz-Jeghers綜合征或PJS、STK11或絲氨酸/蘇氨酸11或LKB1或肝激酶B1)”，英文主題詞：“China/Chinese、Peutz-Jeghers syndrome/PJS、STK11或Serine/threonine kinase 11或LKB1或Liver kinase B1”。此外對部分文獻進行人工檢索和核對交叉引用。

1.2納入標準和排除標準 納入標準：①包括隊列研究、病例對照研究和病例報告/病例系列，其中所報道中國的PJS患者均已明確診斷，并完成了對STK11基因的突變檢測；②突變檢測方法包括Sanger序列、全外顯子測序和MLPA等；③檢測對象包括PJS患者本人及其親屬，以及因發(fā)現(xiàn)胃腸道息肉而疑診為PJS的患者等。排除標準：①對PJS患者僅圍繞臨床診斷、臨床特征、治療、預(yù)后等臨床過程進行討論的研究；②未經(jīng)同行評審的學位論文；③采用錯誤STK11基因序列進行突變命名者。

1.3定性分析和數(shù)據(jù) 提取對納入的研究進行多方面的質(zhì)量評估，包括患者來源、實驗方法和報告形式，評估由兩名研究人員獨立進行。如果研究或案例的質(zhì)量被認為不合格，則將其從以下分析中排除。如有任何分歧，應(yīng)由調(diào)查員進行判斷。從最終納入的研究中提取以下有關(guān)變量：第一作者的姓氏，進行研究的時間和地點；突變檢出率；受檢的家系與檢出家系數(shù)量；突變的具體信息(外顯子、編碼區(qū)的位置、氨基酸改變)；突變的性質(zhì)(未報道、已報道)；存在問題突變的細節(jié)。

1.4結(jié)果分析 采用描述性分析。結(jié)果包括中國PJS患者所攜帶的STK11突變，報告時間和地點，突變數(shù)及其性質(zhì)以及報告錯誤和原因。為了對其進行判斷，檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫和文獻以確認所報道突變是否為新突變。

2 結(jié) 果

2.1文獻檢索結(jié)果及基本特征 按照上述檢索范圍、納入和排除標準進行檢索和篩選，共納入55篇文獻，經(jīng)統(tǒng)計顯示，包含649個家系(一篇文獻因不能準確識別參檢和檢出家系數(shù)據(jù)未能參與家系統(tǒng)計)，共報道301個突變，包括一些重復(fù)報道的突變。經(jīng)過系統(tǒng)分析，最終確定181種突變，其中中國學者首次報道108種突變(圖1)。包含55條文章的具體信息見表1。迄今為止，HGMD中記錄了412種不同的STK11突變，這是目前為止可檢索最全面的PJS致病突變數(shù)據(jù)庫，中國PJS患者攜帶的突變占比26.2%。

圖1 文獻報道中國PJS患者STK11突變基因分布圖

表1 文獻報道中國PJS患者STK11突變匯總情況

表1 (續(xù))

2.2突變報道錯誤統(tǒng)計 共發(fā)現(xiàn)27種錯誤報道(其中22種重復(fù)報道和5種新突變命名錯誤)，占本文報道的所有病例的25%。導(dǎo)致命名錯誤原因包括：數(shù)據(jù)庫收錄不全，突變識別錯誤。重復(fù)報道原因包括：文獻綜述不足，因錯誤信息導(dǎo)致的后續(xù)錯誤報道，短期內(nèi)重復(fù)報道，以及因重復(fù)序列而命名錯誤。見表2。因重復(fù)序列而命名錯位，是因為發(fā)生插入突變的位點位于重復(fù)序列之間，導(dǎo)致命名錯誤。為了證實上述情況，對其中帶有c.178insA，c.152insG突變PJS患者的STK11基因相應(yīng)區(qū)域進行反向測序，并檢測到這兩個突變位點(圖2)。分別自178和152位開始前方的堿基序列出現(xiàn)雙峰，提示堿基插入位置在該兩個位點之前。并最終證實了正確命名方式為c.180insA和c.158insG。

表2 STK11突變報道錯誤原因匯總

圖2 c.158insG和c.180insA突變反向測序結(jié)果

3 討 論

PJS是一種常染色體顯性遺傳病。分子遺傳學研究表明，位于19號染色體短臂的STK11基因發(fā)生了雜合突變是該病的主要致病原因。Sanger測序聯(lián)合MLPA或NGS聯(lián)合MLPA是目前為止最好的組合檢測策略[2]。研究顯示，60%～78%PJS先證者的家屬攜帶相同的致病性突變，而17%～40%先證者為突變病例[5]。一旦在先證者中發(fā)現(xiàn)STK11基因突變，其高危的親屬就需進行預(yù)測性基因突變檢測。此外，STK11基因的突變檢測有助于PJS的基因型-表型的研究，而該研究尤其對于惡性腫瘤風險的評估，具有重要的臨床意義。STK11基因的編碼區(qū)由9個外顯子組成，其編碼433個氨基酸的蛋白質(zhì)，主要由三個結(jié)構(gòu)域組成：N末端非催化結(jié)構(gòu)域、催化激酶結(jié)構(gòu)域和C末端非催化調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。截止目前，在PJS或其他疾病患者中檢測到的STK11突變可達412種，在全面回顧文獻后，發(fā)現(xiàn)中國人群貢獻了26.2%突變。在回顧文獻同時，發(fā)現(xiàn)了一部分突變報道錯誤的情況，對此進行整理、歸納，大致可分為兩大類：新發(fā)突變命名錯誤和已報道突變被重復(fù)報道。

新發(fā)突變命名錯誤的主要原因包括數(shù)據(jù)庫收錄不全和突變識別錯誤。中文期刊報道的三個突變，c.290+1G>T、c.109C>T和c.733C>T，因語言問題未被國外的數(shù)據(jù)庫識別、收錄[8，22]。在HGMD中記錄的以上三個突變是被其他學者報道的，但該學者的研究出版時間晚于中國學者。而突變識別錯誤方面：Zheng等[16]報道了一例兒童患者的錯義突變，命名為c.580G>T，并在文章中提到該突變先前被報道為PJS的新發(fā)致病突變。對文獻交叉對比發(fā)現(xiàn)，研究報道的突變是c.580G>A，因此推斷該情況是由于Zheng等將新發(fā)突變錯誤識別為已報道所致。而突變識別錯誤存在另外一種形式：Wang等[14]在2014年發(fā)現(xiàn)的c.891G>C突變，未被HGMD收錄并宣布該突變?yōu)槭状螆蟮?。趙曉等[11]早在2012年就對其進行了報道，但該文中未指出該突變?yōu)樾掳l(fā)突變，且未被數(shù)據(jù)庫收錄。所以Wang等的誤報是繼發(fā)于趙曉等的識別錯誤。

導(dǎo)致突變報道錯誤的另一原因是將已報道突變誤認為新發(fā)突變進行重復(fù)報道，原因包括：文獻綜述不足，因錯誤信息導(dǎo)致的后續(xù)錯誤報道，短期內(nèi)重復(fù)報道以及因重復(fù)序列而命名錯誤。Zuo等[10]的c.180C>G，毛旭燕等[15]的c.180C>G、c.354C>G、c.521A>G、c.526G>A、c.862G>A，李蒙等[19]的c.298C>T、IVS4+1G>T、IVS8-2A>C、IVS1+1G>A、IVS7-2A>G，Zhang等[20]的c.598-1G>A，Wu等[21]的c.358G>T都被HGMD數(shù)據(jù)庫收錄，但是作者未進行全面、正確檢索和識別，誤認為是新發(fā)突變進而重復(fù)發(fā)表。短期內(nèi)重復(fù)報道的主要原因是不同作者發(fā)現(xiàn)同一突變并短期內(nèi)先后發(fā)表。如Wang等[14]在2014年報道了delexon3是一個新突變，但Ngeow等[24]在2013年已經(jīng)報道過。相同情況同樣發(fā)生在c.419T>C、IVS5-2A>G、c.243delG、c.716G>C這些突變上。短期內(nèi)重復(fù)報道存在另外一種情況：同一作者在兩篇不同文獻[12]中均將c.469_498del30這一突變報道為新發(fā)突變。此外，當插入或缺失突變的堿基位于重復(fù)序列區(qū)域時，突變堿基的定位、命名容易發(fā)生錯誤。嚴格地說，該問題目前尚存爭議，但常用方法是將重復(fù)序列最后一個核苷酸位點作為突變命名位點。相反，在重復(fù)序列的第一位核苷酸中的之前進行標記，并認為第一位核苷酸發(fā)生突變并不妥當。c.178insA，c.152insG實際上是命名錯誤，因為發(fā)生插入突變的位點應(yīng)在第178～180位和第153～157位的重復(fù)序列之間。根據(jù)氨基酸的變化，正確的命名方式分別是c.179insA、c.180insA和c.153-158insG。為此對該PJS患者的STK11基因相應(yīng)區(qū)域進行反向測序，并檢測到這兩個突變位點，并最終證實了正確命名方式為c.180insA和c.158insG。

在對PJS患者致病突變進行檢測過程中，部分學者發(fā)現(xiàn)一個特殊現(xiàn)象：在同一位PJS患者的STK11基因上可檢測到多個突變，便推斷PJS患者可能同時存在多個致病突變。在缺少對突變致病性鑒定的情況下，該推論并不嚴謹。Tan等[25]在該方面的處理方式值得借鑒。該學者在兩個不同的PJS家族中，檢測到先證者同時攜帶兩種突變c.890G>A、c.1062C>G和delexon1、c.1062C>G，先后通過突變數(shù)據(jù)庫檢索、家系和癥狀共分離情況、基因表達及功能試驗、蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測軟件的使用等多種方法證明，最終證實致病突變?yōu)閏.890G>A和delexon1，而不是c.1062C>G。2015年美國醫(yī)學遺傳學學院和美國基因組學與分子病理學協(xié)會對于突變的報告方式，聯(lián)合給出了詳細的評定標準[26]。國內(nèi)專家對其也進行了翻譯，在國內(nèi)進行廣泛討論和學習。我國學者可通過學習和實踐該標準，對檢出數(shù)據(jù)進行更加條理化分析，最終獲得正確、有效的結(jié)果，并給予患者提供適當?shù)募蚁禉z測和隨訪計劃。