經(jīng)自然腔道取標本的腹腔鏡結(jié)直腸癌手術對于細菌污染及脫落腫瘤細胞播散種植的影響

卜君 李念 何山 原紅軍 鄧亨怡 陳瓊 伍曉汀

成都市第二人民醫(yī)院普通外科（成都 610041）

如何從生理微創(chuàng)邁向生理和心理雙重微創(chuàng)，實現(xiàn)腹壁無瘢痕化，一直是腹部外科醫(yī)生努力的方向。2007 年，MARESCAUX 等［1］為1 例30 歲的女性膽囊結(jié)石患者施行經(jīng)陰道內(nèi)鏡膽囊切除術，術后體表無瘢痕，被公認為世界首例成功應用于人體的自然腔道內(nèi)鏡手術（natural orifice transluminal endoscopic surgery，NOTES）。NOTES 不僅消除了腹壁切口感染問題，減少了術后疼痛，降低了切口疝的風險，還使患者術后恢復增快，對追求美容效果的患者具有極大的吸引力［2-3］。但是，目前NOTES 仍存在入路的安全建立與閉合以及特殊手術器械需求等制約因素，影響其臨床推廣［4］。在這種情況下，經(jīng)自然腔道取標本（natural orifice specimen extraction，NOSE）手術，以美容效果好且不需要特殊醫(yī)療器械的優(yōu)點而引起人們的重視。

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴重危及人們的健康。為了提高治療效果，結(jié)合NOSE 技術的腹腔鏡結(jié)直腸癌手術成為臨床研究的熱點之一［5-6］。目前這些研究中，前瞻性的隨機對照實驗（randomized controlled trial，RCT）較少，特別是研究手術過程手術區(qū)域細菌污染情況以及腫瘤細胞種植播散的研究極少［7］。本研究主要分析應用NOSE 技術對于腹腔鏡結(jié)直腸癌手術患者術區(qū)污染及腫瘤種植播散的影響，探討該類手術的過程中避免腹盆腔污染及腫瘤種植轉(zhuǎn)移的措施。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2013 年9 月至2015 年2 月住院符合納入條件的結(jié)直腸癌患者共92 例（由于國際研究［8-9］中腹腔脫落細胞腫瘤陽性率的差別較大，故選擇腹盆腔感染率來預估樣本量，根據(jù)查閱文獻并結(jié)合我院預實驗數(shù)據(jù)［10-12］，預估失訪率為15%，以此計算樣本量），采用隨機數(shù)字表法分為兩組各46 例，分別為傳統(tǒng)腹腔鏡組（L 組），應用NOSE 技術的腹腔鏡組（NL 組）。該研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會（institutional review board，IRB）審核并批準。由于開放手術和傳統(tǒng)腹腔鏡手術的比較研究已經(jīng)較多［13-17］，為了節(jié)約資源，本研究對照組未設定開放手術組。

1.2 納入與排除標準［18］

1.2.1 納入標準（1）術前病理學確診為結(jié)直腸癌；（2）術前TNM分期Ⅰ～Ⅲ期（UICC/AJCC 2013）；（3）術前評估腫瘤直徑≤3 cm，距離肛門≥6 cm；（4）年齡≥18 歲且≤81 歲；（5）非急診手術；（6）術前未接受化放療；（7）術前無完全性腸梗阻和腸穿孔；（8）術前無胃腸道手術史；（9）術前根據(jù)美國麻醉醫(yī)師協(xié)會（American Society of Anesthesiology，ASA）標準麻醉和手術耐受力評估為Ⅰ～Ⅲ級；（10）術前簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準（1）合并嚴重的心、肺、腦血管疾病或合并其他嚴重器官功能障礙者；（2）合并其他惡性腫瘤者；（3）合并嚴重的自身免疫系統(tǒng)疾病者；（4）術前存在肛門狹窄者；（5）體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）≥30 kg/m2者；（6）術前長期接受糖皮質(zhì)激素治療者；（7）術前合并尚未控制的精神疾病患者；（8）術前合并非特異性腸炎者；（9）妊娠或哺乳期婦女；（10）無存活希望、臨終或不可逆昏迷患者。

1.3 方法

1.3.1 手術原則所有手術遵循腫瘤的根治原則，且均由同一醫(yī)生團隊完成。手術過程中，若發(fā)現(xiàn)腫瘤無法經(jīng)腹腔鏡切除，則及時中轉(zhuǎn)開腹手術［19］。對于尺寸較小的病灶，采用術中腸鏡定位。

1.3.2 術前準備所有患者圍手術期處理原則相同，規(guī)范使用抗生素。術前常規(guī)控制可能影響手術的內(nèi)科系統(tǒng)疾病，改善患者營養(yǎng)狀態(tài)，行適當?shù)哪c道準備。

1.3.3 手術方式［18，20］手術操作采用五孔法，在取手術標本之前，兩組患者的手術步驟相同，主要區(qū)別在于手術標本的取出方法。NL 組取標本操作：腹腔鏡下，對于結(jié)腸腫瘤，在距離腫瘤根治性手術要求切斷處，使用切割閉合器分別予以切斷閉合。切除部分包括腫瘤、腸系膜和足夠長度腸管。將標本中網(wǎng)膜組織與結(jié)腸切開分離。而對于直腸腫瘤，僅在距離腫瘤根治性手術要求切斷的腫瘤遠端處，使用切割閉合器予以切斷閉合。另切取少許網(wǎng)膜脂肪組織，經(jīng)12 mm 穿刺口取出后，無菌下切碎壓榨形成油狀脂肪，外涂于無菌保護套（規(guī)格14×200 cm，兩端有結(jié)扎帶）外壁，然后將其經(jīng)12 mm 穿刺口放入腹腔，將標本理順成條狀，放入保護套內(nèi)并扎緊。經(jīng)肛門置入腸鏡或者卵圓鉗（針對乙狀結(jié)腸腫瘤和直腸腫瘤），到達結(jié)腸斷端閉合處。使用超聲刀切開該結(jié)腸或直腸斷端，腸鏡異物鉗或者卵圓鉗抓取結(jié)扎帶，擴肛后緩慢從肛門脫出保護套及標本。NL 組吻合操作：對于結(jié)腸腫瘤，腹腔鏡下，超聲刀切開近端腸道閉合端，使用切割閉合器將遠近端腸管行側(cè)側(cè)吻合，更換釘倉后再閉合兩腸管殘端。對于直腸腫瘤，體外直視下，距離腫瘤近端約10 cm 處離斷標本，將圓形吻合器的抵釘座放入近端結(jié)腸并回納腹腔，腹腔鏡下，圓形吻合器經(jīng)肛作端端吻合。

1.3.4 灌洗液檢測所有患者均收集4 次灌洗液（0.9%氯化鈉注射液500 mL 灌洗5 min 后收集）：（1）手術開始時，沖洗腹盆腔（非直接噴沖腫瘤）；（2）手術結(jié)束前，吸盡明顯積液，沖洗腹盆腔；（3）吻合前，沖洗遠端腸腔；（4）吻合后，沖洗吻合口及遠端腸腔。灌洗液采用普通細胞學涂片的方法檢測［21-23］，在高倍鏡（400 ×）下發(fā)現(xiàn)癌細胞定為游離癌細胞陽性，沒發(fā)現(xiàn)為陰性。腸腔灌洗液需先加入10%甲醛150 mL，過濾除去糞渣，靜置2 h。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般資料收集患者性別、年齡、BMI、腫瘤部位、術前TNM 分期、術前非胃腸道腹部手術史、ASA 分級、淋巴結(jié)清掃數(shù)量、環(huán)周切緣陽性率、術后TNM 分期、術后化放療率等資料。

1.4.2 感染性相關指標（1）手術開始時，腹盆腔灌洗液細菌培養(yǎng)結(jié)果；（2）手術結(jié)束前，腹盆腔灌洗液細菌培養(yǎng)結(jié)果；（3）術后全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）［24-25］發(fā)生率；（4）術后切口感染發(fā)生率。

1.4.3 腫瘤種植播散和復發(fā)相關指標（1）手術開始時腹盆腔灌洗液游離腫瘤細胞陽性率；（2）手術結(jié)束前腹盆腔灌洗液游離腫瘤細胞陽性率；（3）吻合前遠端腸腔灌洗液游離腫瘤細胞陽性率；（4）吻合后吻合口及遠端腸腔灌洗液游離腫瘤細胞陽性率；（5）隨訪期間無局部復發(fā)生存率（local relapsefree survival，LRFS），無區(qū)域淋巴結(jié)復發(fā)生存率（nodal relapse-free survival，NRFS）以及無遠處轉(zhuǎn)移生存率（distant metastasis-free survival，DMFS）。

1.5 統(tǒng)計學方法使用Excel 2007 軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，采用Graph-Pad Prism 7.0 軟件繪制生存曲線，遵循意向性處理原則（Intention-to-treat，ITT）。計量資料采用均數(shù)±標準差進行統(tǒng)計描述，正態(tài)分布和方差齊，采用t檢驗或方差分析比較差異；計數(shù)資料采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier 曲線描述，采用Log-rank 檢驗。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，檢驗效能1-β=0.9（β=0.1），P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較本研究按照納入和排除標準納入患者92 例，其中男51 例，女41 例，年齡31～81 歲，平均68.5 歲。實施過程中，L 組有3 例患者和NL 組有2 例患者術中發(fā)現(xiàn)腫瘤存在遠處轉(zhuǎn)移，中轉(zhuǎn)行開放手術。另外，NL 組2 例患者術中發(fā)現(xiàn)腫瘤較大，無法經(jīng)肛取出，1 例患者在手術開始后不久，家屬拒絕經(jīng)肛取出標本，以上3 例均改為傳統(tǒng)腹腔鏡手術（隨機研究流程圖見圖1）。術后，對于病理分期Ⅲ～Ⅳ期的44 例患者（L 組24 例，NL組20 例）推薦進行化放療。兩組患者的一般資料差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性（均P＞0.05）?；颊唠S訪時間3～53 個月，平均39.9 個月。

圖1 隨機研究流程圖Fig.1 Flow chart of randomized study

2.2 感染性相關指標及腫瘤種植播散比較兩組患者，SIRS、切口感染發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），手術開始時和結(jié)束前腹腔灌洗液細菌培養(yǎng)結(jié)果以及游離腫瘤細胞陽性率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），吻合前后腸腔灌洗液游離腫瘤細胞陽性率差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。各自組內(nèi)比較，手術開始時和結(jié)束前腹腔灌洗液細菌培養(yǎng)結(jié)果以及游離腫瘤細胞陽性率差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），吻合前后腸腔灌洗液腫瘤細胞陽性率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 兩組間感染指標和腫瘤細胞播散種植指標比較Tab.1 Comparison of infection-related indicators，indicators related to implantation and dissemination of tumor cells between the two groups

2.3 復發(fā)相關指標隨訪期間，L 組腫瘤復發(fā)8 例（其中腫瘤相關死亡5 例，帶瘤生存3 例），其他原因死亡1 例，失訪1 例；NL 組腫瘤復發(fā)7 例（其中腫瘤相關死亡4 例，帶瘤生存3 例），其他原因死亡3 例，失訪2 例。根據(jù)ITT 分析原則，兩組患者間比較，其LRFS 和NRFS 以及DMFS 差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.578，P=0.367，P=0.695，圖2）。

圖2 兩組間生存曲線比較Fig.2 Comparison of survival curves between the two groups

3 討論

1991 年JACOBS 等［26］首次報道了腹腔鏡結(jié)直腸切除術，開創(chuàng)了胃腸道疾病微創(chuàng)外科的新時代。但傳統(tǒng)腹腔鏡手術在取出切除的病變組織時，需要在腹壁開一長約4～5 cm 的切口，可能出現(xiàn)切口感染等并發(fā)癥，亦存在美容效果不足的遺憾。而為解決該問題的NOTES 技術目前同樣存在諸多困難［4］。2008 年PALANIVELU 等［27］提出了系統(tǒng)的NOSE 概念，將其推薦為向NOTES 過渡的橋梁技術。本研究顯示，應用NOSE 技術的腹腔鏡結(jié)直腸癌手術與傳統(tǒng)腹腔鏡手術比較，患者在手術區(qū)域細菌污染和脫落腫瘤細胞播散種植方面無明顯差異。

本研究在確定研究對象時，特別注意完善術前2 周內(nèi)的腸鏡、CT 或者MRI 等檢查，避免由于該類檢查與手術時間間隔較久，而影響對腫瘤大小和腫瘤分期的判斷。這樣，既符合經(jīng)肛門取標本時對于腸管直徑大小和腸管副損傷的考慮，也盡力回避較高的中轉(zhuǎn)開放率。術后結(jié)果顯示，NL 組僅有2 例患者，術中發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑過大，無法經(jīng)肛門取出，改為傳統(tǒng)腹腔鏡手術。研究表明，腫瘤直徑≤3 cm 和腫瘤的較早分期對于NOSE 技術的順利應用是最為重要的因素，這與其他類似研究［7，28］是基本一致的。

感染性指標方面，兩組患者間SIRS 發(fā)生率、切口感染發(fā)生率以及手術不同時間節(jié)點的腹腔灌洗液細菌培養(yǎng)結(jié)果差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。而兩組患者各自組內(nèi)比較，手術開始時、結(jié)束前腹腔灌洗液細菌培養(yǎng)結(jié)果差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。由于原發(fā)性和繼發(fā)性感染因素，人體腹盆腔內(nèi)本身就存在一定數(shù)量的細菌。在手術過程中，即使術前經(jīng)過腸道準備，NOSE 手術方式理論上仍然會增加細菌污染概率。但是，本研究及其他類似研究表明［29-34］，NOSE 手術并沒有增加SIRS 和切口感染等感染性并發(fā)癥的發(fā)生風險。術前充分腸道準備，術中嚴格堅持無菌化原則，行必要的腹腔和腸腔沖洗，NOSE 手術可以達到和傳統(tǒng)腹腔鏡手術一致的細菌感染率。

腫瘤種植播散和復發(fā)性指標方面，兩組患者腹盆腔灌洗液游離腫瘤細胞陽性率在手術開始時、結(jié)束前以及腸腔灌洗液游離腫瘤細胞陽性率在吻合前、吻合后的差異比較均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。另外，兩組患者各自組內(nèi)比較，僅腹盆腔灌洗液腫瘤細胞陽性率在手術開始時與結(jié)束前的差異（L 組0%vs.13.04%，NL 組4.35%vs.21.74%）有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。正如本研究在確定樣本量時，檢索文獻發(fā)現(xiàn)不同的研究中腫瘤細胞陽性率差別較大一致。本研究中腹盆腔和腸腔灌洗液中腫瘤細胞陽性率與其他研究結(jié)果存在一定的差異［7-8］，這可能與樣本量大小差異和腫瘤脫落細胞的檢查方法差異有關。結(jié)直腸癌根治術后局部復發(fā)有多種原因，可能與已經(jīng)轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)清掃遺漏、游離腫瘤細胞在腹盆腔的殘留和種植、相應結(jié)直腸系膜組織清掃遺漏、腸腔吻合口的脫落腫瘤細胞種植等多種原因有關。本研究結(jié)果提示，盡管理論上腹腔鏡手術操作較開放手術輕柔，但是實際上仍然存在術中腫瘤細胞脫落情況，特別是應用NOSE 技術過程中需要經(jīng)過腸道和肛門。需要指出的是，腫瘤細胞脫落直至局部種植復發(fā)是一個較為復雜的過程，脫落腫瘤細胞成功形成新瘤體必須具備相應條件［35］。由于部分患者術后復發(fā)源于術中腫瘤細胞脫落種植，所以對于患者術后腫瘤復發(fā)擴散的觀察比較一定程度上反映了術中腫瘤脫落細胞種植播散有無可能。本研究平均隨訪時間39.9 個月，兩組患者LRFS 和NRFS 以及DMFS 差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），提示兩組患者腫瘤復發(fā)或者擴散方面比較無明顯差異，經(jīng)肛門取標本的腹腔鏡結(jié)直腸癌手術并未增加患者術后復發(fā)擴散風險。因此，在手術中堅持惡性腫瘤的無瘤化原則和根治性原則非常重要。

綜上，雖然結(jié)直腸癌腹腔鏡手術操作過程中，可以引起腹腔內(nèi)細菌污染，也會出現(xiàn)腫瘤細胞脫落于腹腔和腸腔，但應用NOSE 技術的腹腔鏡結(jié)直腸癌手術與傳統(tǒng)腹腔鏡結(jié)直腸癌手術比較，手術的無菌化和無瘤化安全程度無明顯差異。

本研究仍然有一些不足之處。首先，研究不是多中心的，且樣本數(shù)量有限。其次，采用普通細胞學檢查灌洗液中游離脫落細胞，其敏感度不如RT-PCR 等方法高。再有，在標本取出過程中，部分患者需要先把網(wǎng)膜組織和結(jié)腸分離，這在一定程度上破壞了標本的完整性。這些均需要在后續(xù)的研究中加以完善，以便得出進一步的結(jié)論。