濟(jì)川煎對(duì)老年慢傳輸型便秘大鼠TPH1、5-HT表達(dá)的影響

★ 蔣玲芳 湯盧偉 王艷茹 易思彬 付文強(qiáng) 安明偉（.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

功能性便秘是較為常見的腸道疾病，全球范圍內(nèi)成年人的患病率為2.5 %～79.0 %，兒童的患病率為0.7 %～29.6 %［1］。中國(guó)成年人便秘的發(fā)病率為4.1 %～6.0 %［2-3］，超過60歲的老年群體中便秘的患病率為10.9 %～12.3 %［4］。從發(fā)病原因看，慢性便秘可分為功能性便秘和器質(zhì)性便秘。慢傳輸型便秘（STC）是功能性便秘最常見的一種類型，在老年便秘患者中占了較大比例，其發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全清楚。研究表明，5-HT是結(jié)腸重要的神經(jīng)化學(xué)遞質(zhì)，可促進(jìn)結(jié)腸蠕動(dòng)，防止便秘發(fā)生，而結(jié)腸壁的腸嗜鉻細(xì)胞（EC）可將攝入的色氨酸通過色氨酸羥化酶（THP1）的作用轉(zhuǎn)化為5-HT，通過此途徑產(chǎn)生的5-TH占體內(nèi)總量的90 %以上［5］。筆者發(fā)現(xiàn)濟(jì)川煎在臨床上具有安全效佳的通便體重，但其機(jī)制未完全明確。觀察濟(jì)川煎對(duì)STC大鼠結(jié)腸THP1和5-HT的影響，有利于闡明濟(jì)川煎通便的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組成年SPF級(jí)健康SD大鼠30只，月齡20～24個(gè)月，雌雄各半，體重（170±20）g，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物管理中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK （贛） 2014-0008，將30只大鼠隨機(jī)分為以下3組：空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，濟(jì)川煎組，每組10只，環(huán)境溫度（24±3）℃，濕度（55±5）%，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料飼養(yǎng)。

1.1.2 儀器恒溫金屬?。–HB-202，杭州博日）；全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（RM 2265，德國(guó)LEICA）；倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)（IX71，OLYMPUS）；多功能酶標(biāo)儀（Spark 10M）。

1.1.3 試劑一抗：兔抗大鼠TPH1（1∶1 000，Millipore），兔抗大鼠5-HT（1∶5 000，Sigma）；二抗：羊抗兔LgG（上海賽默飛世爾科技公司），抗熒光淬滅封片劑（蘇州科貝生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠造?？瞻讓?duì)照組大鼠喂飼普通飼料。模型對(duì)照組、濟(jì)川煎組每天在給予普通飼料的基礎(chǔ)上，灌胃復(fù)方地芬諾酯（8 mg/kg），每日一次，共120 d。每日記錄糞便性狀和干重，記錄體重變化，并增減給藥劑量至STC模型組糞便性狀、首粒黑便排出時(shí)間和正常組有顯著性差異，則證實(shí)建模成功［6］。

1.2.2 給藥方法藥物由江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供，中藥飲片當(dāng)歸、懷牛膝、肉蓯蓉、澤瀉、升麻、枳殼按比例10∶4∶6∶3∶2∶2混勻后，加15倍量水煎煮2次，每次1 h，合并前后煎液，繼續(xù)煎煮至濃度150 %，4 ℃低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?jì)川煎組按照4.2 g/kg給予150 %濃度的濟(jì)川煎湯劑；空白組和STC模型組大鼠經(jīng)灌胃給予相應(yīng)量的生理鹽水。

1.2.3 結(jié)腸標(biāo)本處理10 d后，頸椎脫臼法處死各組大鼠，取大鼠近端兩份長(zhǎng)約1 cm結(jié)腸組織標(biāo)本。一份結(jié)腸標(biāo)本固定后，常規(guī)石蠟包埋。切成4 μm薄片，二甲苯脫蠟，各級(jí)乙醇脫水，蘇木精染色，水洗后，1 %鹽酸溶液分化數(shù)秒，水洗，溫?zé)崴@藍(lán)5 min，自來水沖洗，伊紅復(fù)染2 min，95 %乙醇脫水和二甲苯透明之后封片；另一部分迅速液氮處理超低溫冰箱中保存，冷凍切片并用95 %乙醇固定，待熒光組織化學(xué)免疫法檢測(cè)。

1.3 觀察指標(biāo)觀察大鼠的大便性狀、糞球數(shù)目、干重、腸道推進(jìn)率。禁食12 h的大鼠灌入5 %活性炭混懸液0.5 mL，30 min后異氟醚麻醉后處死，切除幽門到直腸末端的全部結(jié)腸，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度及活性炭在腸道的分布距離，計(jì)算腸道推進(jìn)率。腸道推進(jìn)率=炭末推進(jìn)距離／腸道全長(zhǎng)×100 %。所有結(jié)腸內(nèi)容物均采用無菌技術(shù)收集，在40 ℃干燥5 h后，測(cè)定糞便含水率：糞便含水率=（糞便濕重-糞便干重）/糞便濕重×100 %。

1.4 結(jié)腸TPH1和5-HT表達(dá)檢測(cè)采用熒光免疫組化技術(shù)檢測(cè)。結(jié)腸組織取出脫水、固定、冷凍，恒冷箱切片，厚20～30 μm，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗三次，每次10min，滴加一抗50 μL，置濕盒內(nèi)孵育30 min（37 ℃，1.5 h），濕盒內(nèi)保濕，PBS沖洗二次，每次10 min，滴加四甲基異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗，放濕盒中37 ℃下濕育30 min，PBS沖洗二次，每次10 min，甘油封片，低溫避光保存（4 ℃），鏡檢，細(xì)胞基染色呈橙紅色者判定為陽(yáng)性細(xì)胞。隨機(jī)選取6個(gè)高倍鏡視野（400×），測(cè)量每個(gè)視野中TPH1和5-HT陽(yáng)性細(xì)胞的面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0軟件，數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察濟(jì)川煎組大鼠精神正常，食量可,糞便含水量多、質(zhì)軟,與空白組接近；STC組大鼠精神差，倦臥少動(dòng)，精神萎靡，進(jìn)食減少，糞便含水量少、質(zhì)干硬。

2.2 各組大鼠排便及腸道推進(jìn)率情況模型組與空白組比較，排便粒數(shù)和重量下降，腸道推進(jìn)率下降；濟(jì)川煎組與模型對(duì)照組比較，排便粒數(shù)和重量增加，腸道推進(jìn)率增加，濟(jì)川煎組與空白對(duì)照組的大鼠排便粒數(shù)和重量及腸道推進(jìn)率相近。見表1。

表1 各組大鼠糞便含水量及腸道推進(jìn)率比較（ ±s，n=10） %

表1 各組大鼠糞便含水量及腸道推進(jìn)率比較（ ±s，n=10） %

注：與空白組比較，*P<0.05；與STC模型組比較，#P<0.05。

級(jí)別 含水率 推進(jìn)率空白組 70.31±6.72 63.61±7.92 STC模型組 51.28±5.39* 48.86±5.98*濟(jì)川煎組 62.75±5.52# 62.78±7.26#

2.3 HE染色結(jié)腸組織觀察濟(jì)川煎組結(jié)腸黏膜層腺體排列齊，無充血、水腫，無點(diǎn)片狀糜爛及潰瘍，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，與空白組相近；STC模型組黏膜腺體排列欠整齊，黏膜層可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，輕度充血、水腫，與空白組差異大。見圖1。

圖1 各組結(jié)腸壁病理組織切片（HE染色，400×）

2.4 濟(jì)川煎對(duì)老年STC模型大鼠結(jié)腸TPH1表達(dá)的影響紅色示TPH1陽(yáng)性細(xì)胞。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，空白組TPH1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（28.54±8.94）個(gè)較多；與空白組相比，便秘模型組結(jié)腸TPH1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（9.97±2.94）個(gè)明顯減少；與便秘模型組相比，濟(jì)川煎大鼠結(jié)腸TPH1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（22.48±7.82）個(gè)增多。見圖2。

圖2 大鼠結(jié)腸中TPH1檢測(cè)表達(dá)結(jié)果（免疫熒光，400×）

2.5 濟(jì)川煎對(duì)老年STC模型大鼠結(jié)腸5-HT表達(dá)的影響從圖3可以看出，紅色為5-HT陽(yáng)性細(xì)胞。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，空白組大鼠5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（10.72±2.43）個(gè)較多；與空白組相比，模型組結(jié)腸5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（5.6±1.37）個(gè)明顯減少；與模型組相比，濟(jì)川煎組結(jié)腸5-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（8.91±2.75）個(gè)增加。見表2。

表2 各組大鼠結(jié)腸TPH1和5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（ ±s，n=10） 個(gè)

表2 各組大鼠結(jié)腸TPH1和5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（ ±s，n=10） 個(gè)

注：與空白組比較，*P<0.05；與STC模型組比較，#P<0.05。

組別 結(jié)腸TPH1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 結(jié)腸5-HT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)空白組 28.54±8.94 10.72±2.43 STC模型組 9.97±2.94* 5.60±1.37*濟(jì)川煎組 22.48±7.82# 8.91±2.75#

圖3 熒光大鼠結(jié)腸中5-ht檢測(cè)表達(dá)結(jié)果（免疫熒光，400×）

3 討論

STC是最常見的消化系統(tǒng)疾病之一，而且隨年齡的增加，發(fā)病率呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)結(jié)構(gòu)初步形成，慢性便秘越來越引起社會(huì)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)的高度重視，其不但影響老齡人口的生活質(zhì)量，且大幅度提高了相關(guān)的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)支出。STC發(fā)病機(jī)制涉及胃腸道動(dòng)力紊亂、腸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)異常、腸道神經(jīng)遞質(zhì)分泌減退、腸道平滑肌病變、間質(zhì)細(xì)胞受損等方面。也有研究者認(rèn)為STC疾病與遺傳、內(nèi)分泌、精神因素和飲食及排便習(xí)慣等關(guān)系密切。本課題采用復(fù)方苯乙哌啶灌胃制造老年STC大鼠模型，復(fù)方苯乙哌啶直接作用結(jié)腸平滑肌，消除局部腸黏膜的蠕動(dòng)反射，延長(zhǎng)腸內(nèi)容物與腸粘膜的接觸，促進(jìn)腸內(nèi)水分的吸收，導(dǎo)致STC大鼠模型糞便量少。

腸嗜鉻細(xì)胞由腸上皮基底干細(xì)胞分化而來，由于其特殊的組織化學(xué)染色特性而得名，產(chǎn)生機(jī)體內(nèi)95 %的5-HT，腸神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)腸道系統(tǒng)的調(diào)節(jié)需要5-HT系統(tǒng)的介導(dǎo)，EC數(shù)量以及其分泌的5-HT濃度的變化與多種腸道疾病密切相關(guān)。5-HT可觸發(fā)胃腸蠕動(dòng)和分泌反射,并在正常自主排便和內(nèi)臟感覺方面起重要作用。多項(xiàng)研究證明5-HT與感覺異常及腸道動(dòng)力有關(guān)。Kato S［7］研究發(fā)現(xiàn)，被敲除THP1的大鼠，其腸嗜鉻細(xì)胞分泌的5-HT合成受阻，結(jié)腸蠕動(dòng)減弱，結(jié)腸傳輸時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致慢傳輸型便秘的發(fā)生。近年來以腸嗜鉻細(xì)胞和5-HT相關(guān)的藥物也不斷出現(xiàn)，如5-HT受體激動(dòng)劑西沙比利、莫沙比利等較多應(yīng)用于臨床，但也有致心律不齊、胃功能障礙等不良反應(yīng)，對(duì)于肝、腎生理機(jī)能下降的同齡患者也要慎用。

《素問·上古天真論》記載：“女子六七，三陽(yáng)脈衰于上,面皆焦，發(fā)始白……男子五八，男子六八，陽(yáng)氣衰竭于上，面焦，發(fā)鬢頒白。”說明隨著年齡增長(zhǎng)，人體腎陽(yáng)漸衰，氣化無力，津液不布，腸道失濡，傳導(dǎo)失司。濟(jì)川煎是《景岳全書》之方劑，第51卷記載：“便秘不得通者……若察其元?dú)庖烟?，既不可瀉而下焦脹閉，又通不宜緩者，皆宜以緩者，但用濟(jì)川煎主之，則無有不達(dá)?！狈街腥馍惾販赝I陽(yáng)，潤(rùn)腸通便；當(dāng)歸補(bǔ)血潤(rùn)燥，牛膝補(bǔ)益肝腎，枳殼下氣寬腸，澤瀉滲利腎濁，升麻升陽(yáng)，清陽(yáng)升濁陰自降，全方寓通于補(bǔ)，寄降于升，具溫腎助陽(yáng)，潤(rùn)腸通便之功，臨床上也有文獻(xiàn)報(bào)道濟(jì)川煎治療老年慢傳輸型便秘有較好的臨床療效［8-9］。本研究結(jié)果顯示，老年STC大鼠腸道推進(jìn)率降低，TPH1表達(dá)和5-HT表達(dá)下調(diào)。濟(jì)川煎組與STC模型組比較，大鼠的糞便形態(tài)改關(guān)，含水量、排便重量增加，腸道推進(jìn)率較治療前升高，表明濟(jì)川煎具有促進(jìn)STC大鼠結(jié)腸動(dòng)力的作用；濟(jì)川煎組與STC模型組大鼠比較，結(jié)腸5-HT含量、THP1蛋白表達(dá)明顯增加。THP1是5-HT生物合成中的限速酶［10］，濟(jì)川煎能上調(diào)THP1蛋白的表達(dá)，促進(jìn)大鼠EC細(xì)胞5-HT的生成，改善大鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)輸作用。而濟(jì)川煎影響EC細(xì)胞THP1表達(dá)的具體途徑，仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，STC是臨床常見病，結(jié)腸EC細(xì)胞的變化與STC的發(fā)病密切相關(guān)。濟(jì)川煎有促進(jìn)老年STC大鼠腸動(dòng)力的作用，可能是通過促進(jìn)結(jié)腸EC細(xì)胞中THP1的表達(dá),促使5-HT生成，由此改善結(jié)腸的傳輸功能而發(fā)揮作用。