魚露中高產(chǎn)蛋白酶耐鹽菌株的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

李文靜,李春生,李來好*,王悅齊,陳勝軍,楊少玲

1(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266100) 2(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室,國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東 廣州,510300) 3(大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連，116034)

魚露是一種以低值魚蝦為原料,經(jīng)過長時間自然發(fā)酵制得的調(diào)味品,具有獨特的風(fēng)味和營養(yǎng)價值。魚露味道鮮美,富含氨基酸、有機(jī)酸、微量元素以及抗氧化活性物質(zhì)等成分[1],備受東南亞以及我國南方沿海一帶人民的喜愛。我國魚露的生產(chǎn)過程是將新鮮的魚與高濃度的鹽(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%～30%)混合,通過耐鹽性、嗜鹽性微生物和魚體自身所含的酶將魚蛋白分解成肽和氨基酸,最終形成一種清澈的琥珀色液體[2]。魚露完全依靠自然發(fā)酵,需要12～24個月,生產(chǎn)周期長,是目前魚露生產(chǎn)企業(yè)面臨的難題。

采用加菌或加酶發(fā)酵是目前魚露快速發(fā)酵常用的方法。有研究者將可以產(chǎn)生多種高活性酶且安全性較高的微生物菌株應(yīng)用到魚露發(fā)酵過程中。SUN等[3]添加AspergillusoryzaeOAY1進(jìn)行魚露發(fā)酵,雖然發(fā)酵速度有所提高,但失去了魚露的特征風(fēng)味,同時容易污染雜菌,造成腐敗變質(zhì)。為避免雜菌污染,國內(nèi)外對快速發(fā)酵魚露的研究主要集中于從魚露發(fā)酵過程中篩選產(chǎn)蛋白酶菌株作為發(fā)酵劑,分析菌種發(fā)酵對魚露發(fā)酵速度以及各項理化指標(biāo)的影響。目前,從魚露等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選到的菌屬主要包括乳桿菌屬(Lactobacillussp.)[4-5]、枝芥孢桿菌屬(Virgibacillussp.)[6-8]、平球菌屬(Planococcussp.)[9]、嗜鹽桿菌屬(Halobacteriumsp.)[10]、四聯(lián)球菌屬(Tetragenococcussp.)[11-13]等。但由于上述菌株產(chǎn)酶能力低,在高鹽環(huán)境下失活等限制因素,未能實現(xiàn)在魚露發(fā)酵產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。采用添加蛋白酶制劑發(fā)酵魚露時,其種類主要為中性、堿性蛋白酶等商用酶制劑,酶解效果差、耐鹽能力低、應(yīng)用成本高,缺少適合魚露發(fā)酵的專用酶制劑。

本研究利用透明圈法從魚露發(fā)酵液中篩選到了1株產(chǎn)蛋白酶且耐鹽的菌株B-2,采用VITEK 2 COMPACT細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因序列分析分別對其進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定,利用掃描電子顯微鏡觀察菌株在不同鹽度下的形態(tài)變化,評價菌株的耐鹽能力,并分別對培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 魚露發(fā)酵液樣品

不同發(fā)酵時間下的魚露發(fā)酵液,汕頭魚露廠有限公司。

1.1.2 試劑

豆粕、酪蛋白、酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,北京索萊寶生物科技有限公司；Na2CO3、NaCl、三氯乙酸,上海麥克林生化科技有限公司；福林-酚試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；VITEK 2 BCL卡,法國生物梅里埃公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

初篩平板培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨5.0,酵母膏粉2.5,葡萄糖1.0,瓊脂15.0,脫脂奶粉30.0,蒸餾水1 000 mL,pH (7.0±0.2)。

液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0,酵母膏粉5.0,NaCl 5.0,葡萄糖1.0,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0±0.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株篩選

初篩采用水解圈的方法：將魚露發(fā)酵液用無菌生理鹽水稀釋,取100 μL稀釋的魚露發(fā)酵液均勻涂布于初篩平板培養(yǎng)基,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)直至有透明圈出現(xiàn)。挑取透明圈直徑較大的菌落進(jìn)行分離純化。通過測定蛋白酶活力進(jìn)行復(fù)篩：將純化后的菌株分別進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng),發(fā)酵溫度為37 ℃,搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min,發(fā)酵時間為24 h。篩選出產(chǎn)蛋白酶活力最高的菌株在4 ℃冰箱保藏。

1.2.2 菌株鑒定

用接種環(huán)將新鮮培養(yǎng)的細(xì)菌在聚苯乙烯試管壁上研磨,用無菌水(含4.5 g/L NaCl)將菌液濁度調(diào)至1.8～2.0 MCF。將BCL卡片和菌株懸濁液一同放入VITEK 2 COMPACT細(xì)菌鑒定儀。

菌株B-2的分子生物學(xué)鑒定采用16S rRNA基因測序(北京六合華大基因科技有限公司)的方法。選擇與B-2基因序列相似度較高且為同一菌屬的標(biāo)準(zhǔn)菌株,然后使用Clustal W進(jìn)行多序列對比分析。在MEGA 5.1軟件中選擇鄰位相連法(Neighbor-Joining)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.3 菌株在不同鹽環(huán)境下細(xì)胞形態(tài)和生長情況

菌株B-2種子液以2%的接種量分別接種到含0、50、100、150、200、300 g/L NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液離心后棄去上清液,菌體經(jīng)過清洗、固定、脫水、冷凍干燥等步驟,在掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。采用干重法評價菌株在不同鹽環(huán)境下生長情況。將在不同鹽濃度下培養(yǎng)的發(fā)酵液于12 000 r/min離心10 min,菌體用無菌超純水洗滌1次,110 ℃烘箱烘至恒重后稱質(zhì)量,計算菌體生物量(g/L)。

1.2.4 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

1.2.4.1 碳源種類及濃度

分別以1 g/L的淀粉、麥芽糖、果糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖為發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源,其他成分不變。各培養(yǎng)基發(fā)酵液中產(chǎn)蛋白酶活力最高的成分確定為最適碳源。同時研究不同碳源含量對蛋白酶活力的影響,確定最適碳源添加量。

1.2.4.2 氮源種類及濃度

在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,分別以5 g/L的脫脂奶粉、酪蛋白、豆粕、牛肉膏、硫酸銨、蛋白胨作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源。各培養(yǎng)基發(fā)酵液中產(chǎn)蛋白酶活力最高的成分確定為最適氮源。同時研究不同氮源含量對蛋白酶活力的影響,確定最適氮源添加量。

1.2.4.3 NaCl質(zhì)量濃度

在上述培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加NaCl進(jìn)行發(fā)酵,NaCl的質(zhì)量濃度分別設(shè)為0、5、10、15、20、25 g/L,測定發(fā)酵液中蛋白酶活力,確定最適NaCl添加量。

1.2.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基成分

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以果糖(A)、豆粕(B)、NaCl(C)質(zhì)量濃度為因素,發(fā)酵液中蛋白酶活力(Y)為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面軟件中的Box-Behnken法,設(shè)計3因素3水平的實驗,確定培養(yǎng)基中各成分的添加量。

1.2.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.5.1 pH

在最適培養(yǎng)基條件下,將培養(yǎng)基pH分別調(diào)至6、7、8、9、10、11,通過發(fā)酵液產(chǎn)蛋白酶活力的大小,探究菌株最適產(chǎn)酶pH。

1.2.5.2 溫度

在上述條件下,將菌株B-2置于25、30、35、40、45、50 ℃的溫度下培養(yǎng),通過測定發(fā)酵液中蛋白酶活力的大小,探究菌株最適產(chǎn)酶溫度。

1.2.5.3 接種量

在上述條件下,分別將接種量設(shè)置為1%、2%、3%、4%、5%,通過測定發(fā)酵液中蛋白酶活力的大小,探究菌株最適產(chǎn)酶接種量。

1.2.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基成分

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以pH(X1)、溫度(X2)、接種量(X3)為因素,發(fā)酵液中蛋白酶活力(Y)為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面軟件中的Box-Behnken法,設(shè)計3因素3水平的實驗,確定菌株最適發(fā)酵條件。

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

菌株產(chǎn)蛋白酶活力的測定均采用福林法

1.2.7 統(tǒng)計分析

每組實驗重復(fù)測定3次,然后使用SPSS 20.0對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),使用Tukey法檢驗數(shù)據(jù)差異性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

從魚露發(fā)酵液中初篩得到16株能夠產(chǎn)生明顯透明圈的菌株(圖1)。

圖1 魚露中產(chǎn)蛋白酶菌株水解透明圈形態(tài)Fig.1 Protease hydrolyzed transparent circles of the primary screening strains in fish sauce

復(fù)篩結(jié)果顯示,發(fā)酵9個月的魚露中分離出的菌株B-2產(chǎn)蛋白酶活力最高,達(dá)到28.05 U/mL(圖2)。

菌株B-2的生理生化鑒定結(jié)果如表1所示,其符合芽胞桿菌的特征反應(yīng),初步確定菌株B-2屬于芽胞桿菌屬(Bacillus)。

進(jìn)一步的菌株B-2基因測序結(jié)果顯示,其與多種Bacillus的菌株高度相似。利用B-2基因序列與相近的標(biāo)準(zhǔn)菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,菌株B-2的16S rRNA基因序列與BacillussubtilisNCIB 3610的距離最近(圖3),兩者同源性為100%。結(jié)合菌株B-2特征反應(yīng)和16S rRNA基因序列,確定該菌為Bacillussubtilis,并命名為BacillussubtilisB-2。目前,已經(jīng)從魚露發(fā)酵液中篩選到B.megaterium[13]、B.piscicolaNR1-3-2T[14],B.licheniformisRKK-04[15]等其他芽胞桿菌屬,但是對于枯草芽胞桿菌的篩選較少。本研究也是近年來,首次從中國傳統(tǒng)發(fā)酵魚露中篩選到B.subtilis。

圖2 篩選菌株的產(chǎn)蛋白酶活力測定Fig.2 Protease activity of the strains

表1 利用VITEK 2 COMPACT細(xì)菌鑒定系統(tǒng)分析菌株B-2的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain B-2 tested by VITEK 2 COMPACT

圖3 利用Neighbor-Joining構(gòu)建菌株B-2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain B-2 constructed by Neighbor-Joining method

2.2 菌株耐鹽性

菌株B-2在不同鹽含量下的產(chǎn)酶情況如圖4-a所示。培養(yǎng)12 h,菌株生成的菌落較小,分解蛋白質(zhì)較少、產(chǎn)生透明圈較小、產(chǎn)酶較少,可能是由于培養(yǎng)時間太短,菌株還未完全生長；培養(yǎng)24 h,各平板上均有較明顯的透明圈出現(xiàn),其中不含NaCl的平板上透明圈最為明顯,含100 g/L NaCl的平板上透明圈最??；培養(yǎng)48 h,含50和100 g/L NaCl平板中透明圈進(jìn)一步擴(kuò)大,說明菌株B-2在0～100 g/L NaCl環(huán)境中均生長并產(chǎn)生蛋白酶。

在不同鹽環(huán)境下對應(yīng)的掃描電鏡細(xì)胞形態(tài)如圖4-b所示。當(dāng)在不含鹽的環(huán)境下培養(yǎng)時,菌株B-2呈桿狀,細(xì)胞大小(長×寬)為1.44 μm×540 nm,表面光滑,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；當(dāng)在50 g/L的NaCl環(huán)境下培養(yǎng)時,細(xì)胞雖無明顯破裂,但細(xì)胞變短至1.02 μm×663 nm,呈短桿狀；當(dāng)在100 g/L的NaCl環(huán)境下培養(yǎng)時,高環(huán)境的滲透壓對細(xì)胞形態(tài)影響較大,細(xì)胞被拉長到11.5 μm×658 nm,呈長條狀且細(xì)胞結(jié)構(gòu)有輕微破裂。

a-產(chǎn)酶情況；b-細(xì)胞形態(tài)圖4 菌株B-2在高鹽條件下產(chǎn)蛋白酶特性、形態(tài)特征Fig.4 Protease production,morphological characteristics of strain B-2 under high salinity

當(dāng)NaCl含量超過150 g/L時,細(xì)胞表面形成明顯褶皺,大小和形態(tài)與不加鹽時無顯著變化。由此推斷,在0～100 g/L NaCl質(zhì)量濃度下,細(xì)胞代謝旺盛,能夠通過改變自身形態(tài)來應(yīng)對不同鹽濃度環(huán)境。而當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度超過150 g/L時,細(xì)胞代謝受到顯著抑制,并對細(xì)胞造成一定損害。

進(jìn)一步研究了不同鹽環(huán)境下菌株B-2的生長情況,結(jié)果如圖5所示。隨著NaCl含量增加,生物量呈下降趨勢,但與初始接種量相比,在200 g/L的條件下菌株的生物量依然顯著增加,在300 g/L的條件下菌株依然能夠緩慢生長。結(jié)果表明,該菌株具有很強(qiáng)的耐鹽性,在200～300 g/L的鹽環(huán)境下仍能夠保持生長和代謝。與其他已報道的產(chǎn)蛋白酶菌株相比,菌株B-2具有較強(qiáng)的耐鹽特性,為縮短魚露發(fā)酵時間,提高生產(chǎn)效率提供了一種新的發(fā)酵劑。

圖5 菌株B-2在不同鹽條件下生物量Fig.5 Biomass of strain B-2 under different salinity

2.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.3.1 碳源種類及濃度

圖6-a顯示,以果糖作為碳源時,發(fā)酵液中產(chǎn)蛋白酶活力最大值為30.60 U/mL。這與產(chǎn)蛋白酶菌株B.luteusH11[16]的研究結(jié)果一致。果糖含量太低導(dǎo)致微生物營養(yǎng)不足,影響生長代謝；果糖含量太高導(dǎo)致滲透壓增大,影響菌株生長和產(chǎn)酶。通過測定果糖含量對菌株產(chǎn)酶的影響發(fā)現(xiàn),當(dāng)果糖含量為0.5 g/L時的蛋白酶活力最高(圖6-b),達(dá)到49.77 U/mL。因此,以0.5 g/L的果糖作為優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源。

2.3.2 氮源種類及濃度

不同種類氮源對菌株B-2產(chǎn)蛋白酶活力的影響如圖6-c所示。當(dāng)培養(yǎng)基中分別添加蛋白胨、酪蛋白、豆粕等有機(jī)氮與硫酸銨等無機(jī)氮時,菌株B-2所產(chǎn)蛋白酶的活力存在顯著差異。該菌株對無機(jī)氮利用率較差、產(chǎn)蛋白酶活力低,對有機(jī)氮利用率較好,產(chǎn)蛋白酶活力普遍較高。當(dāng)以成本最低的豆粕作為培養(yǎng)基碳源時,蛋白酶的活力最高,達(dá)到63.25 U/mL,且發(fā)酵液具有獨特的大豆清香味。本研究結(jié)果與產(chǎn)蛋白酶的B.subtilisWB600[17]研究結(jié)果一致。豆粕中含有多種蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、維生素和促生長因子,與其他氮源相比,營養(yǎng)更豐富,更能促進(jìn)蛋白酶的生成。通過測定豆粕含量對菌株產(chǎn)酶的影響,發(fā)現(xiàn)當(dāng)豆粕含量為15 g/L時,蛋白酶活力達(dá)到97.63 U/mL(圖6-d)。因此,培養(yǎng)基中豆粕的添加量為15 g/L。

2.3.3 NaCl濃度

Na+可以維持細(xì)胞滲透壓,是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基中的必要成分。圖6-e表明當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl為5 g/L時,蛋白酶活力最高,為103.38 U/mL；NaCl為10 g/L時,蛋白酶活力略有下降；NaCl質(zhì)量濃度超過25 g/L時,測定蛋白酶活力值為仍超過57 U/mL,表明該菌在高鹽條件具有較穩(wěn)定的產(chǎn)蛋白酶能力。因此,確定菌株B-2產(chǎn)酶優(yōu)化培養(yǎng)基最適NaCl質(zhì)量濃度為5 g/L。

a-碳源種類；b-果糖濃度；c-氮源種類；d-豆粕濃度；e-NaCl濃度對蛋白酶活力的影響圖6 培養(yǎng)基成分單因素實驗Fig.6 Single factor experiment of medium compositions

2.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基成分

根據(jù)單因素的實驗結(jié)果,以果糖質(zhì)量濃度(A)、豆粕質(zhì)量濃度(B)、NaCl質(zhì)量濃度(C)為響應(yīng)面實驗的3個因素,以蛋白酶活力(Y)為響應(yīng)值,采用Box-Behnken法設(shè)計的實驗方案[18]和實驗結(jié)果如表2所示。

表2 培養(yǎng)基成分響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Response surface design scheme and results of medium compositions

續(xù)表2

果糖、豆粕、NaCl質(zhì)量濃度與蛋白酶活力之間的關(guān)系可以用多元二次回歸方程表示：Y=104.54+2.17A-2.99B+0.44C-0.30AB+1.39AC-0.43BC-7.50A2-6.84B2-14.53C2。培養(yǎng)基中果糖0.57 g/L、豆粕13.88 g/L、NaCl 5.13 g/L時,預(yù)測蛋白酶的酶活力最高可達(dá)105.04 U/mL。

由表3中方差分析可得,該模型P<0.000 1,失擬項P=0.411 7>0.05,說明該模型可以準(zhǔn)確的反映3因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。同時,該模型R2=0.988 6,說明該模型與實驗擬合程度好,利用該方程預(yù)測的不同條件下蛋白酶活力實驗誤差小,因此可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測。根據(jù)F值大小,各個因素對菌株產(chǎn)酶的影響順序為：B(豆粕質(zhì)量濃度)>A(果糖質(zhì)量濃度)>C(NaCl質(zhì)量濃度)。利用響應(yīng)面優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行了3次驗證實驗,蛋白酶酶活平均值為106.41 U/mL,非常接近模型的預(yù)測值,表明實驗得到的模型可以用于預(yù)測實際值。

表3 培養(yǎng)基成分響應(yīng)面分析實驗方差分析Table 3 Analysis of variance in the response surface analysis of medium compositions

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 pH值

pH可以改變培養(yǎng)基成分的離子化程度,影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,同時可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的電負(fù)性和滲透性,影響轉(zhuǎn)運和代謝過程[19]。圖7-a顯示了菌株B-2在pH 6～11蛋白酶活力的變化。在弱酸性環(huán)境下(pH=6)產(chǎn)酶較低,可能是因為在弱酸性環(huán)境下,各種金屬的溶解度很高,這些金屬很容易穿過細(xì)胞膜,造成不良的氧化還原反應(yīng),破壞細(xì)胞膜,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。當(dāng)pH為7～9,蛋白酶活力逐漸增加,因此該菌株產(chǎn)蛋白酶類型為堿性蛋白酶。當(dāng)pH為9時,蛋白酶活力最高,為157.71 U/mL。當(dāng)pH超過10,蛋白酶活力迅速下降。研究發(fā)現(xiàn),B.subtilis產(chǎn)蛋白酶活力最適pH普遍在7～9,B.subtilisUMN-26[21]最適pH為7,B.subtilisVe1[22]最適pH為8,而菌株B-2的最適pH與吳海波等[23]的研究結(jié)果相似,均在pH為9時有最大酶活力。因此,確定菌株B-2最適pH為9。

2.4.2 溫度

微生物細(xì)胞中的糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)都需要在酶的催化作用下分解,而各種酶的催化作用均需要適宜的溫度,因此溫度對微生物代謝過程有重要影響[24]。圖7-b顯示,隨著溫度的升高酶活力逐漸增大,30 ℃時達(dá)到峰值,為177.33 U/mL。培養(yǎng)溫度30～40 ℃時,酶活力下降趨勢緩慢,表明該菌對高溫具有較強(qiáng)適應(yīng)性,即使在50 ℃下培養(yǎng),蛋白酶活力仍能達(dá)到90.02 U/mL。因此,確定菌株B-2最佳發(fā)酵溫度為30 ℃。中國傳統(tǒng)魚露通常是在(30±2) ℃的環(huán)境下,露天發(fā)酵而成。菌株最適溫度和魚露發(fā)酵溫度一致,有利于菌株B-2在魚露快速發(fā)酵中的應(yīng)用。

2.4.3 接種量

適宜的接種量可以有效提高發(fā)酵速度,在工業(yè)應(yīng)用時,可以有效的節(jié)約時間和成本。接種量太小,菌體密度未達(dá)到生長要求,造成微生物生長緩慢；接種量太大則會造成菌體密度過大,菌株生長時供氧不足,影響生長,造成產(chǎn)酶下降。由圖7-c可知,當(dāng)接種量為4%時,酶活力達(dá)到最大值190.36 U/mL。研究發(fā)現(xiàn),從大豆發(fā)酵食品中分離出的B.subtilisW1[25]最適接種量與本實驗一致,均為4%。因此,確定菌株B-2最佳接種量為4%。

a-pH；b-溫度；c-接種量圖7 發(fā)酵條件單因素實驗Fig.7 Single factor experiment of fermentation conditions

2.4.4 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)發(fā)酵條件單因素實驗結(jié)果,以pH(X1)、溫度(X2)、接種量(X3)為響應(yīng)面實驗的3個因素,以蛋白酶酶活力(Y)為響應(yīng)值,采用Box-Behnken試驗設(shè)計實驗方案和結(jié)果如表4所示。pH、溫度、接種量與蛋白酶活力之間的關(guān)系可以用如下多元二次回歸方程表示：Y=190.29+15.18A+13.86B+13.41C-14.70AB-1.40AC+9.53BC-21.78A2-53.26B2-7.41C2。當(dāng)pH為9.4、溫度為28.4 ℃、接種量為4.9%時,預(yù)測蛋白酶活力理論得率可達(dá)201.88 U/mL。

表4 發(fā)酵條件響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果Table 4 Response surface design scheme and results of fermentation conditions

發(fā)酵條件方差分析結(jié)果如表5所示,整體模型P=0.007<0.01,失擬項P=0.087 6>0.05,可知該模型回歸極顯著,失擬項不顯著。該模型中的R2=0.988 6說明擬合程度較好,能較好的預(yù)測不同條件下蛋白酶活力,因此可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測。根據(jù)F值大小,各個因素對菌株產(chǎn)酶的影響順序為：X1(pH)>X2(溫度)>X3(接種量)。利用經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行了3次驗證實驗,蛋白酶酶活力平均值為200.63 U/mL。與預(yù)測值基本一致,表明該模型準(zhǔn)確性和實用性較高,能夠較好地預(yù)測蛋白酶活力。

表5 發(fā)酵條件響應(yīng)面分析實驗方差分析Table 5 Analysis of variance in the response surface analysis of fermentation conditions

續(xù)表5

B.subtilis具有強(qiáng)大的產(chǎn)酶系統(tǒng),能夠利用葡萄糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),在生長過程分泌中性、堿性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等多種胞外酶[26]。同時,B.subtilis作為一種安全性極高的發(fā)酵劑,在發(fā)酵食品中有諸多應(yīng)用。PONGSETKUL等[27]從泰國咸蝦醬中篩選到1株產(chǎn)蛋白酶菌株B.subtilisK-C3,在發(fā)酵前接種該菌株可以有效提高蝦醬的發(fā)酵速率。相比而言,本研究篩選到的B.subtilisB-2具有更高的產(chǎn)蛋白酶活力,通過添加該菌有望提高傳統(tǒng)魚露的發(fā)酵效率,而且通過對蛋白酶的分離純化,有望開發(fā)出一種適合于魚露發(fā)酵生產(chǎn)的專用酶制劑。

3 結(jié)果與討論

本文從魚露發(fā)酵液中分離到1株耐鹽且產(chǎn)蛋白酶的菌株,經(jīng)生理生化鑒定和16S rRNA分子生物學(xué)鑒定,該細(xì)菌為Bacillussubtilis,并命名為BacillussubtilisB-2。利用掃描電子顯微鏡觀察菌株在不同鹽環(huán)境下的形態(tài),并分析其生長情況,發(fā)現(xiàn)該菌株具有很強(qiáng)的耐鹽性,在200～300 g/L的鹽環(huán)境下仍能夠保持生長和代謝,并維持較為完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為果糖0.57 g/L、豆粕13.88 g/L、NaCl 5.13 g/L,最適發(fā)酵條件為pH 9.4、溫度28.4 ℃、接種量4.9%。在此條件下生長的菌株產(chǎn)蛋白酶活力是原來的7.15倍。與其他菌株相比,B.subtilisB-2具有高耐鹽性和產(chǎn)蛋白酶活性,因此該菌株及其產(chǎn)生的蛋白酶有望開發(fā)成魚露專用發(fā)酵菌劑和酶制劑。