重組表達(dá)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶乳酸克魯維酵母的發(fā)酵工藝優(yōu)化

謝頌洋,顧正華,郭自濤,朱慧霞,時祎,辛瑜,張梁*

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 2(制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(華南理工大學(xué)),廣東 廣州,510640)

D-泛解酸內(nèi)酯水解酶具有高度的立體選擇性,可立體專一拆分DL-泛解酸內(nèi)酯,生成D-泛解酸[1-2],是合成其他泛酸衍生物的重要中間體。泛酸,又稱泛解酸、遍多酸、維生素B5,它是幾乎每種天然食物來源中存在的必需微量營養(yǎng)素[3]。

生產(chǎn)D-泛酸的傳統(tǒng)方法是采用Stiller法(異丁醛-甲醛-氰化鈉法)或者乙醛酸-異丁醛法合成泛解酸內(nèi)酯,再將β-丙氨酸鈣與泛解酸內(nèi)酯直接縮合即得到DL-泛酸鈣。這種化學(xué)拆分的方法存在試劑貴、成本高、分離困難等缺點(diǎn),此外還伴隨嚴(yán)重的環(huán)境污染和毒性問題。與傳統(tǒng)方法相比,直接發(fā)酵法是通過向能夠自身合成泛酸的微生物中加入相應(yīng)的前體物質(zhì),比如β-氨基丙酸、DL-泛解酸內(nèi)酯等,使其直接合成D-泛酸,然而,由于該方法分離D-泛酸比較困難,產(chǎn)品收率低,未見工業(yè)化的報(bào)道。近些年來,微生物立體選擇性拆分D-泛解酸內(nèi)酯生成D-泛解酸的方法得到越來越多的關(guān)注。1994年SAKAMOTO等[4]利用特定菌株選擇性水解DL-泛解酸內(nèi)酯中的D-泛解酸內(nèi)酯來生成D-泛解酸。2001年,江南大學(xué)利用鐮孢霉菌(Fusarium)生產(chǎn)的水解酶對DL-泛解酸內(nèi)酯進(jìn)行拆分,1 L發(fā)酵液中有6～8 g干菌,酶活力達(dá)到0.52～0.74 U/100 mL[5],并實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)；2016年,天津科技大學(xué)黎明課題組用離子交換樹脂D380對該酶進(jìn)行了固定化研究并取得良好效果[6]。在此基礎(chǔ)上,伴隨基因工程技術(shù)、固定化材料與方法的發(fā)展,這些技術(shù)手段也為D-泛酸類物質(zhì)的高效生產(chǎn)提供了必要的技術(shù)條件。例如近些年來興起的有機(jī)-無機(jī)雜化納米化固定化酶,這種固定化方法已經(jīng)應(yīng)用于生物大分子如脂肪酶[7]、牛血清白蛋白[8]和脲酶[9]等,其活性和穩(wěn)定性較游離酶均有提高；潘敬坤等[10]2018年發(fā)表的專利表明,利用硅藻土為載體得到固定化的D-泛解酸內(nèi)酯水解酶細(xì)胞后,可使得固定化酶活力達(dá)到140 U/g；余繼剛等[11]在2019年發(fā)表的專利中也顯示,通過對赤霉菌進(jìn)行誘變,可使得誘變菌株的發(fā)酵酶活力達(dá)4.09 U/100 mL。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建了1株高效表達(dá)串珠鏈孢霉菌屬D-泛解酸內(nèi)酯水解酶基因的重組乳酸克魯維酵母(KluyveromyceslactisGG799/pKLAC1-DL),其搖瓶酶活力為(2.83±0.12) U/mL。在本研究中,將在5 L發(fā)酵罐上通過探究不同的pH值、攪拌轉(zhuǎn)速和接種量3種單因素條件,以及不同的補(bǔ)料策略來確定最佳的發(fā)酵條件,以期提高D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的酶活力,為進(jìn)一步地?cái)U(kuò)大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)室保存的重組乳酸克魯維酵母KluyveromyceslactisGG799/pKLAC1-DL。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(YPD)(g/L)：葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨20。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖30,酵母粉15,蛋白胨20,NaCl 6,KCl 6,CaCl23,MgSO40.3。

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖500。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

T&J Atype 5 L玻璃發(fā)酵罐,上海迪比爾生物工程有限公司；HC-2518高速離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋,三洋電機(jī)株式會社；V-1200可見分光光度計(jì),上海美普達(dá)儀器公司；HYG-C組合式搖床,江蘇太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱,天津市泰斯特儀器有限公司；Agilent 1260 System高效液相色譜,美國安捷倫科技公司；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子活化

將保藏在-80 ℃冰箱的甘油管按2%的接種量接種于含有15 mL YPD培養(yǎng)基的50 mL三角瓶內(nèi)進(jìn)行活化,于30 ℃,200 r/min培養(yǎng)大約21 h；取菌液劃線至YPD固體培養(yǎng)基平板,于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h；隨后挑取單菌落在50 mL三角瓶進(jìn)行活化作為一級種子液,再按2%的接種量接種于含有50 mL YPD培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi),30 ℃,200 r/min培養(yǎng)菌體至對數(shù)期,作為上罐用的二級種子液。

1.3.2 發(fā)酵罐優(yōu)化培養(yǎng)

以2%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到5 L發(fā)酵罐中,裝液量2.5 L,通氣比為1 vvm,培養(yǎng)溫度30 ℃,發(fā)酵時間96 h,使用10%(體積分?jǐn)?shù))硫酸和50%(體積分?jǐn)?shù))氨水調(diào)解pH。分別考察不同發(fā)酵pH(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)、攪拌轉(zhuǎn)速(200、300、400、500、600 r/min)以及接種量(1.0%、1.6%、2.0%、3.0%)3種因素對產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響。在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上,發(fā)酵一定時間后流加質(zhì)量濃度為500 g/L的葡萄糖作為補(bǔ)加的碳源。

1.3.3 粗酶液的收集

將發(fā)酵液于4 ℃,12 000 r/min離心20 min,獲得的上清液即為粗酶液。

1.3.4 葡萄糖濃度的測定

參考文獻(xiàn)[12], 使用DNS法測定。

1.3.5 泛解酸內(nèi)酯和泛解酸的HPLC測定

參考文獻(xiàn)[13]的方法測定。

1.3.6 酶活力測定

酶活力定義：在一定條件下,每分鐘水解1 μmolD(-)-泛解酸內(nèi)酯成1 μmolD-(+)泛解酸的酶量定義為1個酶活力單位(U)。

D-泛解酸內(nèi)酯水解酶酶活力的測定方法：取離心的上清液0.5 mL、1 mL 4%D-泛解酸內(nèi)酯水溶液、0.5 mL 2 mol/L Tris-HCl緩沖液,混勻并置于37 ℃搖床200 r/min反應(yīng)10 min后立即放入沸水浴中加熱15 min,隨后將混合液于12 000 r/min離心20 min,以滅活酶作為對照,用HPLC分析泛解酸的生成量,計(jì)算每毫升發(fā)酵液的酶活力單位(U/mL)。

1.3.7 比速率的測定

參考文獻(xiàn)[14]的方法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對分批發(fā)酵的影響

發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH是微生物生長和合成產(chǎn)物的重要參數(shù)之一,也是反應(yīng)微生物在一定環(huán)境條件下代謝活動的綜合指標(biāo)。因此,必須通過掌握發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH變化,使得微生物生長和產(chǎn)物合成處于最佳狀態(tài)。由于在搖瓶發(fā)酵條件下很難對pH進(jìn)行有效的控制,所以本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵,并在對pH進(jìn)行調(diào)控,后選取了pH值為5.5、6.0、6.5、7.0時的發(fā)酵過程進(jìn)行比較。

圖1為控制不同pH條件下的發(fā)酵結(jié)果。酶活力的增加與菌體的生長呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性,當(dāng)發(fā)酵大約進(jìn)行到第30 h時菌體進(jìn)入生長平衡期,此時的酶活力增長緩慢。如表1所示,相較于其他3個pH條件,當(dāng)pH控制在6.0時微生物產(chǎn)酶的效果最優(yōu),酶活力最高可達(dá)4.59 U/mL,比pH為5.5、6.5、7.0分別高了22%、13.5%和6%。在pH為6.5時,菌體量雖然增加較高,但是酶活力卻低于pH控制在6.0時的效果。pH為5.5時的OD明顯低于其他3種情況,可以看出低pH不利于菌體的生長和酶的產(chǎn)出。pH為7.0時的最高酶活力同pH為6.0相比相差不大,但是酶的產(chǎn)率較為緩慢,延長了生產(chǎn)時間。綜合以上因素考慮選擇pH控制策略為恒定6.0。

a-pH 5.5;b-pH 6.0;c-pH 6.5;d-pH 7.0圖1 pH值對分批發(fā)酵過程的影響Fig.1 Effect of pH on batch fermentation

表1 不同pH值的分批發(fā)酵參數(shù)對比Table 1 Comparison of parameters during batch fermentation under different pH

2.2 攪拌轉(zhuǎn)速對分批發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過程中,溶解氧是影響生物生長發(fā)酵的重要因素之一,它在細(xì)胞生長、產(chǎn)物形成和維持細(xì)胞的代謝中起著重要作用[15]。調(diào)節(jié)發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速是有效控制發(fā)酵液中溶氧狀態(tài)的主要條件方式,但是過高的攪拌轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力也會對菌體的生長產(chǎn)生影響。

表2 不同攪拌轉(zhuǎn)速的分批發(fā)酵參數(shù)對比Table 2 Comparison of parameters during batch fermentation under different agitation speeds

2.3 接種量對分批發(fā)酵的影響

接種量是影響微生物生長及產(chǎn)物合成的另一個重要因素,接種量過小,菌體不足,延長期較長；接種量過大,菌體繁殖快,會造成培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快,不利于微生物的持續(xù)生長,并進(jìn)而影響產(chǎn)物的合成[20]。如圖3所示,分別以4種不同的接種量進(jìn)行分批發(fā)酵(1.0%、1.6%、2.0%和3.0%),接種量的多少直接影響糖的消耗速率,但這4種情況基本上在發(fā)酵第40 h時將糖耗完,之后OD和酶活力處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)。從圖3曲線趨勢和表3數(shù)據(jù)可知,不同接種量的最高酶活力和菌體生產(chǎn)強(qiáng)度的值相差不大,接種量對菌體的發(fā)酵產(chǎn)生的影響很小,只是延遲了菌體生長和產(chǎn)酶的時間。由于之前的接菌量一直是2%,所以后續(xù)還以2%的接種量進(jìn)行發(fā)酵。

攪拌轉(zhuǎn)速:a-200 r/min;b-300 r/min;c-400 r/min;d-500 r/min;e-600 r/min圖2 攪拌轉(zhuǎn)速對分批發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of agitation speed on batch fermentation

接種量:a-1%;b-1.6%;c-2%;d-3%圖3 接種量對分批發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of inoculum volume on batch fermentation

表3 不同接種量的分批發(fā)酵參數(shù)對比Table 3 Comparison of parameters during batch fermentation with different inoculum volume

2.4 恒糖濃度對補(bǔ)料分批發(fā)酵的影響

根據(jù)前期的單因素實(shí)驗(yàn),當(dāng)發(fā)酵pH為6.0,攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min,接種量為2%時分批發(fā)酵效果最好。為了進(jìn)一步探索補(bǔ)料對發(fā)酵過程中產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響,以初始葡萄糖30 g/L,發(fā)酵液起始體積為2 L,發(fā)酵一段時間后,通過補(bǔ)加質(zhì)量濃度為500 g/L的葡萄糖以維持發(fā)酵過程中的糖質(zhì)量濃度(1、5、10 g/L)。圖4為控制不同恒糖濃度的發(fā)酵結(jié)果,菌體的生長對數(shù)期是在發(fā)酵的0～30 h,在此期間,菌體生長旺盛且耗糖速率最快。當(dāng)在補(bǔ)料發(fā)酵過程中維持葡萄糖質(zhì)量濃度為5 g/L時,由表4數(shù)據(jù)可知,最高酶活力可達(dá)8.20 U/mL,與維持糖質(zhì)量濃度1、10 g/L比分別高了61%和30%。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是由于過低或者過高的恒糖濃度均不利于D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的分泌。為證明發(fā)酵過程中的殘?zhí)抢鄯e是否影響了酶活力,使用恒速補(bǔ)料策略來驗(yàn)證。

發(fā)酵過程中的含糖量:a-1 g/L;b-5 g/L;c-10 g/L圖4 恒糖質(zhì)量濃度對補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響Fig.4 Eflect of different constant glucose concentration on fed-batch fermentation process

表4 不同恒糖濃度的補(bǔ)料分批發(fā)酵參數(shù)對比Table 4 Comparison of parameters during fed-batch fermentation process with different constant glucose concentrations

2.5 恒速補(bǔ)糖對補(bǔ)料分批發(fā)酵的影響

為了消除碳源濃度過高對產(chǎn)D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的影響,將恒糖補(bǔ)料方式改變?yōu)楹闼倭骷悠咸烟恰Ｔ诜峙l(fā)酵過程中,當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛?1 g/L時,分別以5、10、15 g/h的速度流加濃度為500 g/L的葡萄糖溶液。由圖5-a可看出,當(dāng)補(bǔ)料速度為5 g/h時,所補(bǔ)加的葡萄糖可被耗盡,并使菌體保持較高的生長速率,在此條件下最高酶活力達(dá)到了10.70 U/mL(見表5)。

補(bǔ)糖速率:a-5 g/h;b-10 g/h;c-15 g/h圖5 恒速補(bǔ)料對補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響Fig.5 Eflect of constant feeding speed on fed-batch fermentation

當(dāng)補(bǔ)料速度為10和15 g/h時,由于菌體無法消耗過多的碳源,導(dǎo)致發(fā)酵過程中葡萄糖濃度的積累,此時OD比補(bǔ)糖速度5 g/h時分別低了10.2%和25.6%,酶活力則分別低了56%和69%,可以看出高濃度的糖對菌體的生長和產(chǎn)酶都造成了一定的抑制。而且這種補(bǔ)料方法有一個缺陷,就是恒速補(bǔ)料流速的大小可能使得菌體在對數(shù)生長期缺糖或短時間內(nèi)出現(xiàn)糖累積現(xiàn)象,為此又進(jìn)行了指數(shù)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)。

表5 恒速補(bǔ)料的發(fā)酵參數(shù)對比Table 5 Comparison of parameters during fed-batch fermentation with constant feeding speed

2.6 指數(shù)補(bǔ)料對補(bǔ)料分批發(fā)酵的影響

YEE等[21]認(rèn)為目前最成功的基因工程菌高密度培養(yǎng)方法是指數(shù)流加法。補(bǔ)料速度隨著發(fā)酵時間的進(jìn)行而呈指數(shù)增加,較好地避免了菌體在生長對數(shù)期因?yàn)槿碧菍?dǎo)致的生長受到抑制或?qū)Ξa(chǎn)酶的影響。指數(shù)補(bǔ)料的流加速率如公式(1)所示。

(1)

式中：F,流加速度,L/h；μ,設(shè)定的比生長速率,h-1；XO和VO分別是流加初始時的細(xì)胞質(zhì)量濃度(g/L)和培養(yǎng)基體積(L)；t,指數(shù)流加后的發(fā)酵時間,h；Y,細(xì)胞對葡萄糖的得率系數(shù)(由分批發(fā)酵數(shù)據(jù)得到)；SO,補(bǔ)料用的葡萄糖質(zhì)量濃度,g/L。

設(shè)定的μ值需小于μmax(根據(jù)上述分批發(fā)酵結(jié)果求得),所以本文設(shè)定了μ值分別為0.15 h-1和0.20 h-1。當(dāng)發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度<1 g/L時開始指數(shù)流加補(bǔ)料,根據(jù)上述補(bǔ)料結(jié)果得知發(fā)酵液中殘?zhí)琴|(zhì)量濃度過高對菌體生長和酶活力有很大影響,所以當(dāng)發(fā)酵液殘?zhí)琴|(zhì)量濃度>10 g/L時逐漸降低降低補(bǔ)料流速,直到殘?zhí)琴|(zhì)量濃度達(dá)到動態(tài)平衡。當(dāng)設(shè)定μ=0.15 h-1時,由表6可知,此時最高OD為210,最高酶活力為4.50 U/mL,殘?zhí)亲罡呃鄯e到大約10 g/L。如圖6-b所示,當(dāng)設(shè)定μ=0.20 h-1時,指數(shù)補(bǔ)料的速度更快,發(fā)酵第30 h時流速為66 mL/h,殘?zhí)亲罡叻e累到大約25 g/L,最高OD為216同圖6-a相比稍微有所增加,但是最高酶活力比圖6-a下降了22.4%。雖然指數(shù)補(bǔ)料能獲得更多的菌體,但發(fā)酵液中殘?zhí)窃蕉嗝富盍s越低,就如同上述以恒速10和15 g/h補(bǔ)糖時,發(fā)酵液中的殘?zhí)且种凭w產(chǎn)酶。這印證了上述結(jié)果的觀點(diǎn),即酶活力的增加與菌體生長呈現(xiàn)一定正相關(guān)性,但不意味著OD越高酶活力越高,且高濃度殘?zhí)堑睦鄯e抑制了菌體產(chǎn)酶。

a-μ=0.15 h-1;b-μ=0.20 h-1圖6 指數(shù)補(bǔ)料對補(bǔ)料分批發(fā)酵過程的影響Fig.6 Effect of exponentical feeding speed on fed-batch fermentation

表6 指數(shù)補(bǔ)料的發(fā)酵參數(shù)對比Table 6 Comparison of parameters during fed-batch fermentation with exponentical feeding speed

3 結(jié)論

本研究在5 L玻璃發(fā)酵罐中探索了不同的pH、攪拌轉(zhuǎn)速、接種量3種單因素以及3種不同的補(bǔ)料措施,分別以分批發(fā)酵及補(bǔ)料分批發(fā)酵方式,實(shí)現(xiàn)了D-泛解酸內(nèi)酯水解酶在乳酸克魯維酵母(K.lactisGG799/pKLAC1-DL)中的高效表達(dá)。單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)發(fā)酵pH為6.0時,攪拌轉(zhuǎn)速為300 r/min時,接種量為2%時,分批發(fā)酵效果最好,酶活力最高為5.12 U/mL。與分批發(fā)酵相比,當(dāng)維持補(bǔ)料發(fā)酵過程中恒糖濃度為5 g/L時,酶活力可達(dá)8.20 U/mL,比最優(yōu)的分批發(fā)酵酶活力提高了60.1%；而當(dāng)以5 g/h進(jìn)行恒速補(bǔ)料時,此時流加的糖能夠全部被耗盡,酶活力最高為10.70 U/mL,較分批發(fā)酵提高了98.6%,指數(shù)補(bǔ)料策略雖然保證了發(fā)酵過程菌體不會缺糖,但是殘?zhí)堑睦鄯e對菌體的產(chǎn)酶有很大抑制作用,高OD并沒有帶來預(yù)想中的高酶活力,所以在發(fā)酵過程中不能有過多殘?zhí)堑睦鄯e。與同類研究相比,本研究中所獲得的發(fā)酵最高酶活力有了明顯提高。例如,在2020年1月公布的專利中穆曉玲等使用1株串珠鐮刀菌B5-1-7發(fā)酵,最高酶活力82.3 U/g干菌體[22],本研究的酶活力單位經(jīng)過換算成干菌體酶活力得最高酶活力為153 U/g干菌體,與之相比酶活力提高了1.86倍；在另一份2020年5月公布的專利中,吳建中等使用1株串珠鐮刀菌JHpharm 2-1,最高酶活力6.75 U/mL[23],本研究中的最高酶活力為10.70 U/mL,與之相比酶活力提高了1.58倍。以上結(jié)果為進(jìn)一步擴(kuò)大D-泛解酸內(nèi)酯水解酶的生產(chǎn)規(guī)模與提高產(chǎn)酶效率提供了技術(shù)參考。