核桃細(xì)菌性黑斑病的研究進(jìn)展

韓長(zhǎng)志，祝友朋，王韻晴

(1.西南林業(yè)大學(xué)生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

核桃作為世界著名的“四大干果”（核桃、扁桃仁、腰果、榛子）之一，是重要的經(jīng)濟(jì)林樹種之一[1]。近些年，云南省所轄129個(gè)縣（市、區(qū)）中90%以上地區(qū)大力發(fā)展核桃產(chǎn)業(yè)，2017年種植面積（近300 萬hm2）、產(chǎn)量（115 萬噸）、產(chǎn)值（315億元）均居全國(guó)之首[2]。然而，核桃炭疽病、細(xì)菌性黑斑病等病害嚴(yán)重影響著云南省核桃產(chǎn)業(yè)的健康、有序和快速發(fā)展[3-4]。

核桃細(xì)菌性黑斑病，又名核桃黑斑病、核桃黑、黑腐病，作為一種細(xì)菌性病害，是世界性的核桃病害，核桃植株受害率高達(dá)90%以上[5-6]。主要危害核桃果實(shí)、葉片、嫩梢、芽、雄花序及枝條等[7]，幼果受害后果皮表面形成褐色軟斑，后變黑腐爛，造成落果[8]；成熟果實(shí)受害后會(huì)造成果皮形成黑色病斑[9]；葉片受害后出現(xiàn)小褐斑，后病斑脫落；嫩梢受害后病斑褐色，凹陷，嚴(yán)重時(shí)病斑以上部分嫩梢枯死，嚴(yán)重影響著核桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。核桃種植地因所處環(huán)境不同和核桃品種不同，核桃細(xì)菌性黑斑病的危害程度也存在差異，如甘肅天水市發(fā)生該病的病株率為9%～45%，果實(shí)被害率14%～60%，造成減產(chǎn)15%～40%[10]，河南濮陽(yáng)縣發(fā)生該病的病株率為60%～100%，果實(shí)被害率30%～70%，核仁減重40%～50%[11]，濟(jì)南市南部山區(qū)2017年發(fā)生該病的病株率約42%，減產(chǎn)約40%[12]等。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于核桃細(xì)菌性黑斑病的研究，主要集中在病害癥狀、病原、侵染循環(huán)、檢測(cè)技術(shù)、預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)技術(shù)[13]、發(fā)病規(guī)律及防治[14-16]等方面。為了更好地解析核桃細(xì)菌性黑斑病菌的致病機(jī)理以及研發(fā)防治該病害的作用靶標(biāo)藥劑，本研究基于文獻(xiàn)計(jì)量法，通過對(duì)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中有關(guān)該病的文章開展深入剖析，針對(duì)該病害研究的薄弱點(diǎn)，從宏觀視角和微觀視角對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病的未來研究提出展望，以期為該病害的進(jìn)一步研究及有效控制提供參考。

1 國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)計(jì)量分析

為明確近年來學(xué)術(shù)界對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病的研究現(xiàn)狀，選用國(guó)內(nèi)CNKI 數(shù)據(jù)庫(kù)及國(guó)外Sciencedirect 數(shù)據(jù)庫(kù)，分別采用“主題”、“篇名”進(jìn)行“核桃細(xì)菌性黑斑病”及“Walnut Blight”檢索，并對(duì)2009—2019年的文獻(xiàn)進(jìn)行整理。結(jié)果表明，近10年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于核桃細(xì)菌性黑斑病的研究報(bào)道均呈上升的趨勢(shì)，但此病菌引起的病害在國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量較少（圖1）。通過對(duì)上述文獻(xiàn)的梳理，發(fā)現(xiàn)前人的研究主要集中在該病害的發(fā)生與防治，涉及病害的防治有131 篇、發(fā)生有53 篇、防治方法25 篇、發(fā)病規(guī)律19 篇、病原有18 篇、發(fā)生原因有10 篇、藥劑防治試驗(yàn)10 篇、危害癥狀7 篇、不同品種抗性3 篇等。關(guān)于該菌的研究尚缺乏諸如分泌蛋白、致病因子等分子生物學(xué)方面的研究以及病菌檢測(cè)、致病性測(cè)定、侵染機(jī)制等常規(guī)性的研究報(bào)道。

圖1 國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于核桃細(xì)菌性黑斑病的文獻(xiàn)計(jì)量分析Fig.1 Bibliometric analysis of the bacterial black spot disease of walnut by domestic and foreign scholars

2 核桃細(xì)菌性黑斑病病原

2.1 種類和地區(qū)分布不盡相同

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于引起核桃細(xì)菌性黑斑病的病原報(bào)道主要涉及樹生黃單胞菌胡桃變種（Xanthomonas arboricolapv.juglandis）[10,17-19]、核桃黃極毛桿菌（Xanthomonas campestrispv.juglandis）[20-21]、成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）以及上述細(xì)菌的復(fù)合報(bào)道[22]，韓國(guó)地區(qū)為變黃假單胞菌（Pseudomonas flavescens）[23]。此外，畢節(jié)地區(qū)、甘肅天水市、云南香格里拉的病原報(bào)道為核桃黃極毛桿菌[Xanthomonas juglandis（Pierce）Dowson][24-26]。但X.arboricola、X.campestris和X.juglandis（Pierce）Dowson 三者的關(guān)系尚不明確，前人研究認(rèn)為核桃細(xì)菌性黑斑病的病原為核桃黃極毛桿菌，僅是命名不同，最開始命名為X.campestrispv.juglandis（Pierce ）Dye，后來被命名為X.arboricolapv.juglandis（Pierce）Vauterin，我國(guó)一開始將核桃細(xì)菌性黑斑病的病原命名為X.juglandis（Pierce）Dowson，后改為X.campestris，現(xiàn)在多命名為X.arboricola[13]。陳善義團(tuán)隊(duì)對(duì)北京地區(qū)核桃細(xì)菌性黑斑病的病原進(jìn)行16S rDNA 序列測(cè)序，然后進(jìn)行BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)與X.campestris及X.arboricola的一些致病變種的相似性為99%[27]。X.campestris和X.arboricola是否為同一種菌的不同致病變種有待進(jìn)一步明確。

關(guān)于核桃細(xì)菌黑斑病的報(bào)道主要集中在四川、山東、甘肅、云南等核桃主要種植地區(qū)，盡管一些地區(qū)關(guān)于該病害的病原報(bào)道相同，但各個(gè)地區(qū)病原形態(tài)大小存在一定的差異性。在云南，X.arboricola的形態(tài)大小為0.5～1.2 μm×1.0～2.4 μm[22]，該病菌未見其他地區(qū)報(bào)道；在甘肅隴南市，X.campestris的形態(tài)大小為1.3～3.0 μm×0.3～0.5 μm[28]，在臨夏州臨夏縣，形態(tài)大小為1.25～3.1 μm×0.3～0.4 μm[29]，在山東，形態(tài)大小為0.3～1.8 μm×0.3～0.8 μm[30]，該病菌未見其他地區(qū)報(bào)道。在云南，P.agglomerans的形態(tài)大小為0.5～2.0 μm×0.6～3.0 μm[22]，在隴南，形態(tài)大小為1.0～3.0 μm×0.5～1.0 μm[31]，在山東，形態(tài)大小為0.9～3.0 μm×0.6～1.2 μm[30]（表1）。

表1 核桃細(xì)菌性黑斑病病原的種類和地區(qū)分布Table 1 Species and regional distribution of walnut bacterial black spot

2.2 分離和鑒定方法基本一致

前人對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病的鑒定，主要根據(jù)病菌的菌落特征和生理生化特征，以及致病性試驗(yàn)驗(yàn)證等。2011年陳善義團(tuán)隊(duì)對(duì)北京地區(qū)的核桃細(xì)菌性黑斑病菌進(jìn)行16S rDNA 序列的測(cè)定，鑒定病菌為X.campestris，從分子角度進(jìn)行核桃細(xì)菌性黑斑病菌的鑒定和分類提供依據(jù)[27]。2020年Hyun-Sun Kim等人根據(jù)菌落特征、16S rRNA 序列測(cè)定并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹、致病性驗(yàn)證，鑒定核桃細(xì)菌性黑斑病菌為Pseudomonas flavescens[23]。目前，對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病菌的鑒定依據(jù)主要為菌落特征、生理生化特征、致病性驗(yàn)證和分子特征等（表2）。

表2 核桃細(xì)菌性黑斑病的病原報(bào)道及鑒定方法Table 2 Reported pathogen and identification method of walnut bacterial black spot

3 侵染循環(huán)及發(fā)病條件

3.1 侵染循環(huán)

核桃細(xì)菌性黑斑病的病原菌一般在核桃休眠芽、雄花芽?jī)?nèi)越冬，少部分在僵果、病果、病枝、潰瘍斑及昆蟲體上越冬；翌年春天，伴隨著核桃芽和雄花序的生長(zhǎng)，病原菌不斷繁殖，進(jìn)而侵染其周圍的健康組織，形成初侵染[35]。同時(shí)，該菌可以通過核桃組織中的氣孔、皮孔、柱頭等自然孔口，或是通過昆蟲、日灼、冰雹等造成的傷口進(jìn)一步侵染核桃葉片、枝條以及果實(shí)，形成再侵染；其傳播一般借助于雨水、灌溉水、介體昆蟲、農(nóng)事操作、帶菌的苗木及接穗等（圖2）。在河北太行山區(qū)一般5月中下旬開始發(fā)生，6—7月為發(fā)病盛期[36]，北京地區(qū)發(fā)病盛期在7月下旬至8月中旬雨季，若夏季多雨發(fā)病加重，夏季干旱少雨年份發(fā)病輕[27]。就成團(tuán)泛菌而言，其主要通過傷口侵入植株葉片組織使得核桃發(fā)病，而植株莖干的損傷對(duì)植株發(fā)病短期內(nèi)無明顯影響。

圖2 核桃細(xì)菌性黑斑病的病害循環(huán)Fig.2 Disease cycle of walnut bacterial black spot

3.2 發(fā)病條件

核桃細(xì)菌性黑斑病的危害程度受環(huán)境濕度影響較大，在濕潤(rùn)多雨的季節(jié)、年份發(fā)病嚴(yán)重[37]。展葉期、花期前后、幼果期等核桃生長(zhǎng)期若處于多雨潮濕的環(huán)境中，將有利于病原菌的侵染和存活，因此在核桃細(xì)菌性黑斑病的防治中展葉期和花期等初侵染時(shí)期是防治的關(guān)鍵時(shí)期。病菌一般5月中下旬開始侵染果實(shí)、枝條、葉片和幼嫩組織，7月下旬到8月中旬為發(fā)病盛期。同時(shí)前人調(diào)查發(fā)現(xiàn)不同品種、樹齡、樹勢(shì)發(fā)病輕重也不相同，引入核桃發(fā)病情況重于當(dāng)?shù)睾颂襕38]，種植在背陰處、濕度較大的地方的核桃發(fā)病較重，樹勢(shì)衰弱的核桃發(fā)病較重，蟲害嚴(yán)重的片區(qū)，如核桃舉肢蛾（Atrijuglans hetaohei）攜帶病原菌進(jìn)行傳播，有利于病害的流行，云斑天牛（Batocera horsfieldi）、核桃小吉?。ˋgrilus lewisiellus）等枝干害蟲造成的傷口，有利于病菌的侵入，易造成核桃發(fā)病較重[39]。此外還與核桃樹體郁閉通風(fēng)透氣度、立地條件、栽培管理措施及防治不當(dāng)有很大的關(guān)系[37]。

4 防治措施

核桃細(xì)菌性黑斑病的防治主要有農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治兩種，農(nóng)業(yè)防治應(yīng)以種植抗病品種為主[40]，另外在核桃的種植過程中可以和豆科植物套種[41]，改善田間小氣候；合理的種植密度，保證通風(fēng)透光度；加強(qiáng)水肥管理，增強(qiáng)核桃樹勢(shì)；清除病枝、病果等，減少病源；采收時(shí)減少棍棒敲擊，以免造成大傷口，減少病原菌侵染機(jī)會(huì)等[42]?；瘜W(xué)防治主要有預(yù)防和防治兩方面，其中預(yù)防主要采用波爾多液等[43]，防治主要采用銅制劑、代森類藥劑和抗生素類藥劑在核桃生長(zhǎng)的不同時(shí)期進(jìn)行防治[16,44-46]，其中趙寶軍等人發(fā)現(xiàn)施用春雷菌素 + 代森錳鋅的混合藥劑，防治效果為90.94%，其次為代森鋅，防治效果為80.49%，但農(nóng)用硫酸鏈霉素防治效果不佳[16]；郭安柱等人發(fā)現(xiàn)中生菌素、噻霉酮、氟啶胺和春雷菌素對(duì)成團(tuán)泛菌的防治效果都在70%以上[44]；劉寶生等人發(fā)現(xiàn)施用農(nóng)用硫酸鏈霉素 + 乙蒜素的混合藥劑，防治效果為100%，中生菌素、四霉素和農(nóng)用硫酸鏈霉素的防治效果都在95%以上[45]；孫陽(yáng)發(fā)現(xiàn)農(nóng)用硫酸鏈霉素、可殺得3000、代森錳鋅、春雷王銅和吡蟲啉混合施用，防治效果可以顯著提高[46]；陳邦清等人發(fā)現(xiàn)可以滅殺真菌和細(xì)菌的氟硅唑和農(nóng)用硫酸鏈霉素的防治效果高于多菌靈和可殺得3000，與毒死蜱混合施用的防治效果高于單一施用[47]。因此，在對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病進(jìn)行防治時(shí)，化學(xué)藥劑應(yīng)施用銅制劑 + 代森類、抗生素類 + 代森類等類型的混合藥劑，還要進(jìn)行病蟲害的綜合防治，以達(dá)到最大的防治效果[47-48]。

5 展望

5.1 核桃細(xì)菌性黑斑病菌的致病因子及分泌蛋白研究是未來的研究熱點(diǎn)

近些年，學(xué)術(shù)界對(duì)植物病原真菌、卵菌等真核生物分泌蛋白的預(yù)測(cè)較多，而對(duì)屬于植物病原細(xì)菌特別經(jīng)濟(jì)林木上的植物病原細(xì)菌研究較少[49]。本研究小組明確核桃細(xì)菌性黑斑病菌Xanthomonas arboricolapv.Juglandis的7個(gè)菌株[50-51]中分泌蛋白數(shù)量?jī)H占全蛋白數(shù)量的1.81%。不僅與前人所報(bào)道的有關(guān)植物病原真菌、細(xì)菌、卵菌分泌蛋白所占比例存在明顯差異，也與放線菌中分泌蛋白所占比例存在明顯差異[52]。分泌蛋白可以作為效應(yīng)物參與病原菌的侵染過程，其中碳水化合物活性酶類（CAZymes）是分泌蛋白的重要類型，在碳水化合物的降解過程中發(fā)揮著重要作用，參與植物細(xì)胞壁的降解，在病原菌的侵染過程中發(fā)揮著重要作用。今后深入解析核桃細(xì)菌性黑斑病菌中分泌蛋白的功能及其致病機(jī)理，將有助于更好地開發(fā)針對(duì)其致病基因或蛋白的作用靶標(biāo)的藥劑，更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)核桃細(xì)菌性黑斑病的有效防控，有助于進(jìn)一步促進(jìn)核桃產(chǎn)業(yè)健康、有序、快速發(fā)展。

5.2 核桃細(xì)菌性黑斑病菌的致病機(jī)制和寄主植物的抗病機(jī)制及其互作機(jī)制研究是未來的研究難點(diǎn)

近些年，引起核桃細(xì)菌性黑斑病菌的報(bào)道主要涉及X.arboricola、X.campestris，筆者在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行病菌拉丁文搜索，獲到X.arboricola和X.campestris相關(guān)報(bào)道的多個(gè)菌株的全基因組序列，由此推斷上述病原菌對(duì)于植物的危害在世界各地表現(xiàn)較為突出。因此，學(xué)術(shù)上急需明確有關(guān)植物病原菌的致病機(jī)制，從而更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)于該病害的防治。同時(shí)，國(guó)外學(xué)者利用多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析方法（Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis,MLVA）進(jìn)一步開展了核桃細(xì)菌性黑斑病菌的致病變種間的遺傳關(guān)系研究[53]，然而，對(duì)于X.arboricola和X.campestris之間的遺傳關(guān)系尚不清楚。此外，就不同區(qū)域上述植物病原菌之間的遺傳關(guān)系也不清楚，以及植物病原菌與寄主植物的抗病機(jī)制以及互作機(jī)制也不清楚，均有待于今后學(xué)術(shù)界對(duì)其開展更加深入的研究。

5.3 核桃細(xì)菌性黑斑病的早期檢測(cè)預(yù)警及全程綠色防控技術(shù)研究是未來的研究重點(diǎn)

核桃細(xì)菌性黑斑病目前國(guó)內(nèi)尚未見相關(guān)預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型的報(bào)道。2000年，美國(guó)針對(duì)細(xì)菌性黑斑病的發(fā)生發(fā)展，開展了預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)模型的構(gòu)建工作，商業(yè)上稱為Xanthocast TM，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于美國(guó)核桃生產(chǎn)和科學(xué)研究中。因此，開展核桃細(xì)菌性黑斑病早期快速檢測(cè)預(yù)警技術(shù)是病害科學(xué)防治的重點(diǎn)，目前核桃細(xì)菌性黑斑病的診斷判定一般是依據(jù)田間癥狀和病原菌的培養(yǎng)特征。通過培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行鏡檢[29]，輔以分子檢測(cè)技術(shù)，提高核桃細(xì)菌性黑斑病診斷的準(zhǔn)確性及效率，但耗時(shí)較長(zhǎng)。國(guó)外采用一種微流控免疫傳感器，將檢測(cè)樣本中氨基苯基磷酸酯通過堿性磷酸酶轉(zhuǎn)化為對(duì)氨基苯酚，利用酶產(chǎn)物產(chǎn)生的電流大小與病原菌成正比來實(shí)現(xiàn)對(duì)于病原菌的檢測(cè)[54]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是一種普遍的植物病原菌檢測(cè)方法，其實(shí)用性、可靠性較高，該技術(shù)可用于未來核桃細(xì)菌性黑斑菌的檢測(cè)工作中。在病害防治方面，應(yīng)針對(duì)核桃產(chǎn)區(qū)環(huán)境條件、品種特性、栽培管理方式等存在的差異，制定適宜的科學(xué)防治方法，在藥劑選用上，應(yīng)逐步減少化學(xué)藥劑的大量使用，采用生物防治、無公害技術(shù)等綠色防控方法。