西紅花真菌性病害與生防菌鑒定研究進展

杜 雪，李秀娟，桂思琦，開國銀，邵果園，周 偉

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 園藝科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 311402）

西紅花Crocus sativus為鳶尾科Iridaceae番紅花屬Crocus多年生草本植物，又稱番紅花、藏紅花，以干燥柱頭入藥，屬藥食同源中藥材，被歷代醫(yī)家所推崇，被譽為“紅色金子”，2018年被浙江省人民政府認定為新“浙八味”之一。西紅花原產(chǎn)于伊朗、希臘、印度、西班牙、意大利、摩洛哥等地[1]，喜冷涼、耐寒、不耐澇，適合在疏松肥沃、腐殖質(zhì)豐富、排水良好的沙質(zhì)土壤種植[2]，在中國山東、江蘇、北京、河南等20多個省、市都有一定的種植面積。大量研究發(fā)現(xiàn)：西紅花具有調(diào)血脂[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5-7]、抗癌[8-9]、防治動脈粥樣硬化[10]、抗抑郁[11-12]、預(yù)防阿爾茨海默癥[13]等多種藥用活性。除柱頭外，副產(chǎn)物花瓣也具有抗氧化的藥用活性[14]。但是西紅花是三倍體植物，只能通過無性繁殖繁育新球莖，極易積累病害；同時由于西紅花種植面積不斷擴大，球莖腐爛病逐年加重，大量球莖在田間生長期和收獲儲藏期腐爛，球莖減產(chǎn)嚴重，西紅花的產(chǎn)量與品質(zhì)受到影響[15-19]。目前，圍繞西紅花的研究主要集中于以下方面：①西紅花苷、西紅花酸等主要藥用成分藥理活性研究，進一步開發(fā)西紅花潛在的藥用價值[3,14]。②西紅花苷生物合成途徑的解析，如對西紅花苷生物合成途徑相關(guān)合成酶基因進行挖掘和功能解析[20-22]。③西紅花價格昂貴、產(chǎn)量低，市面上西紅花以次充好、品質(zhì)參差不齊，因此精準(zhǔn)、高效地對西紅花的真?zhèn)芜M行鑒定顯得尤為重要[23-27]。④優(yōu)化西紅花栽培管理模式和施肥方式，以提高西紅花的品質(zhì)，降低病害發(fā)生率[28-30]。⑤西紅花球莖腐爛病致病菌的分離與鑒定[15]。球莖腐爛病是困擾西紅花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問題，致病菌的分離鑒定以及相應(yīng)殺菌劑或生物農(nóng)藥的開發(fā)利用能為產(chǎn)業(yè)良性發(fā)展提供保障[15]。本研究圍繞西紅花土壤真菌性病害、西紅花內(nèi)生真菌、西紅花真菌性病害生防菌的挖掘鑒定等展開綜述，為全面了解西紅花真菌性病害、防治現(xiàn)狀以及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 西紅花致病真菌的分離與鑒定

細菌、真菌、病毒等微生物都能引起西紅花病害，以真菌引起的病害最為常見，造成的經(jīng)濟損失也最為嚴重[31]，西紅花球莖腐爛病成為當(dāng)前制約西紅花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素。球莖腐爛病是球莖生長期間的主要病害，常見于連作田及排水差的田塊，通常由真菌引起，每年有30%以上的種植面積遭受病害[15]，嚴重影響球莖、柱頭的產(chǎn)量和品質(zhì)。

西紅花球莖腐爛病主要有黑腐病和白腐病2種，其中黑腐病主要發(fā)生在球莖休眠期，白腐病主要發(fā)生在球莖大田生長期[32]。鄒鳳蓮等[33]從西紅花種球中分離到1株鏈格孢菌Alternaria alternata，回接試驗發(fā)現(xiàn)其可引起西紅花球莖腐爛，并與青霉菌一起感染球莖；相比感染單種真菌病害，腐爛更加嚴重。表明西紅花球莖腐爛病可能是多種致病菌共同作用的結(jié)果。張國輝等[34]通過組織分離法從感病球莖中分離得到了2種致病真菌，分別為炭疽菌Anthracnosesp. 和尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum；回接試驗發(fā)現(xiàn)：這2種真菌共同感染西紅花球莖從而引起腐爛病的發(fā)生。王海玲[32]從腐爛球莖中分離獲得巴西曲霉Aspergillus brasiliensis、尖孢鐮刀菌F. oxysporum和桔青霉菌Penicillium citrinum等3種致病菌，但是這3種菌復(fù)合接種是否引起球莖腐爛，目前尚無明確的報道。WANI等[35]從健康球莖中分離出內(nèi)生真菌紅棕孔韌革菌CSE26菌株P(guān)orostereumsp.，經(jīng)球莖回接及田間植株回接試驗，發(fā)現(xiàn)該菌產(chǎn)生的水解酶和氯代甲氧苯基代謝物可引起西紅花球莖腐爛，但病癥較輕，表明紅棕孔韌革菌是一種致病性較弱的病原菌。吳李芳[15]分離得到了尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌F. solani，通過回接試驗證明：此2種真菌是新發(fā)現(xiàn)的能引起西紅花球莖腐爛的致病真菌。ZHANG等[36]從浙江省建德市西紅花專業(yè)合作社采樣，并從黑腐病的球莖中分離鑒定了1種新的能引起西紅花球莖腐爛的離生青霉菌菌株P(guān). solitum。迄今為止，已公開報道的引起西紅花球莖腐爛的致病菌包括曲霉屬Aspergillussp.、鐮刀菌屬Fusariumsp.、青霉菌屬Penicilliumsp.、炭疽菌屬Anthracnosesp. 和鏈格孢菌屬Alternariasp.，其中鐮刀菌屬還會引起其他藥用植物如黃芪Astragalus membranaceus[16]、人參Panaxginseng[19]、半夏Pinellia ternata[37]等根莖的腐爛(表1)。因此，防治鐮刀菌屬真菌病害可減少西紅花田間病害的發(fā)生，在生產(chǎn)上具有實際應(yīng)用價值。

表1 西紅花球莖腐爛致病真菌及其來源Table 1 Summary of pathomycete isolation from rotting bulbs of C. sativus

2 西紅花內(nèi)生真菌的分離與功能鑒定

植物內(nèi)生真菌是指廣泛寄生于植物組織或細胞內(nèi)部，但不會引起宿主感染的真菌[39]，通常與宿主形成互惠的共生關(guān)系[40]。

2.1 西紅花內(nèi)生真菌的分離

研究表明：同一物種內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量會受品種、生長條件、取材的組織部位等因素影響，并常存在顯著差異[41]。因此，分離西紅花內(nèi)生真菌需要對植株的不同組織部位(如根、莖、葉等)分別取材。目前，西紅花內(nèi)生真菌的分離主要采用組織分離法，即分別將不同部位的西紅花組織切成小塊徹底消毒后，將其置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)，待其生長出菌落后挑其邊緣進行純化，已純化的內(nèi)生真菌還需要進行形態(tài)學(xué)鑒定和分子水平鑒定。西紅花內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定主要包括真菌的宏觀和微觀特征。宏觀特征如菌落正反面顏色、菌落質(zhì)地(絮狀、毛氈狀、質(zhì)密、疏松)、菌落生長速度、菌落表面是否產(chǎn)生液滴等[42-44]；微觀特征如菌絲形狀、孢子形狀(卵形、倒棒形、倒梨形、卵圓形、橢圓形等)、有無隔膜、有無孢子等[45]。西紅花內(nèi)生真菌分子水平鑒定指采用通用引物對真菌基因組DNA特定基因序列進行擴增。目前西紅花分子鑒定的引物主要包括：內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物(ITS)、RNA聚合酶Ⅱ亞基引物(RPB2)和β-微管蛋白基因引物(β-tubulin)[46]。

2.2 西紅花內(nèi)生真菌的功能

內(nèi)生真菌可從宿主中吸取營養(yǎng)供給自身生長所需，并產(chǎn)生代謝物刺激植物組織的生長與發(fā)育，提高宿主對生物或非生物脅迫的耐受性，調(diào)控宿主細胞次生代謝產(chǎn)物的生物合成，具有單獨生產(chǎn)與宿主相同或相似活性物質(zhì)的能力，是有益的微生物資源[35]。此外，內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物還具有抑菌[47-49]、固氮[50]、提高植物抗性[50-51]、抗癌[48]等多種功能。可見內(nèi)生真菌具有促進植物生長、提高抗性的作用。

西紅花主要活性成分(如西紅花苷、西紅花酸等)藥用價值較高，但產(chǎn)量低、價格昂貴。因此，許多科研工作者將目光轉(zhuǎn)向了西紅花內(nèi)生真菌的研究。WANI等[52]發(fā)現(xiàn)：西紅花內(nèi)生真菌被孢霉Mortierella alpinaCS10E4在促進西紅花生長、增加類胡蘿卜素積累、提高植株抗性等方面具有顯著效果；田間試驗表明：經(jīng)過內(nèi)生處理的西紅花植株，球莖總生物量、球莖大小、柱頭生物量、頂端出芽芽數(shù)、不定根數(shù)等形態(tài)和生理性狀均有顯著改善。分子機制可能是該菌通過調(diào)控關(guān)鍵代謝途徑基因的表達，將代謝流引向促進類胡蘿卜素合成的路徑，從而顯著提高寄主類胡蘿卜素的含量。ZHENG等[53]從西紅花內(nèi)生真菌酒色青霉P. vinaceum培養(yǎng)物的活性成分中分離到了喹唑啉生物堿化合物，認為其具有潛在的細胞毒性和抗真菌活性。WANI等[54]研究發(fā)現(xiàn)：西紅花內(nèi)生真菌甘瓶霉Phialophora mustea可提高寄主植物對多種環(huán)境脅迫因子的耐受性，代謝產(chǎn)物具有潛在的抗菌和抗癌活性。多數(shù)內(nèi)生真菌還會產(chǎn)生大量吲哚乙酸(IAA)以促進宿主植物的生長[42,54]。此外，WEN等[55]對內(nèi)生真菌胞外多糖(EPS)的研究發(fā)現(xiàn)：EPS能有效清除超氧化物陰離子自由基，是一種潛在的生物活性來源，適用于制藥和食品工業(yè)。

由此可見，內(nèi)生菌是重要的生物資源。研究植物內(nèi)生菌，了解植物與微生物之間的關(guān)系，有助于促進西紅花的可持續(xù)栽培，提高產(chǎn)量。

3 西紅花致病真菌的生物防治

生物防治菌是存在于種植土壤或植物根系表面的微生物，可通過多種機制抑制病原菌，如拮抗作用[56]、溶菌作用、營養(yǎng)和空間競爭[57]、提高植物抗性[58]、促進植物生長[59]、產(chǎn)生抗生素或刺激植物防御反應(yīng)等。因此，生防菌可作為化學(xué)藥劑的環(huán)保替代品，在降低西紅花發(fā)病率的同時，對環(huán)境和寄主無任何損傷[31]。目前西紅花栽培方面研究較為成熟的生防菌有假單胞菌Pseudomonas[60]、木霉菌Trichoderma[61]和芽孢桿菌Bacillus[62]等。

3.1 西紅花生防菌的挖掘與驗證

芽孢桿菌是一種能夠有效防治西紅花真菌病害的生防細菌。陶中云等[63]從西紅花土壤中分離并鑒定了1株蜂房類芽孢桿菌Paenibacillus alveiZJUB2011-1菌株，該菌株對西紅花球莖腐爛病的防治效率高達57.14%，與多菌靈防治效率相當(dāng)[64]。吳李芳[15]從西紅花根際土壤中分離到1株對西紅花球莖腐爛病具有較好防治效果的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensC612菌株，發(fā)現(xiàn)C612菌株通過產(chǎn)生脂肽類抗生素抑制病原菌的生長，并且對西紅花有較好的促生長作用。KOUR等[65]從西紅花根際土壤中分離了3種芽孢桿菌，分別為蘇云金芽孢桿菌B. thuringiensisDC1菌株、巨大芽孢桿菌B. megateriumVC3菌株和解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciensDC8菌株；田間試驗發(fā)現(xiàn)這3株芽孢桿菌都能明顯促進西紅花植株生長，降低球莖發(fā)病率。此外，GUPTA等[66]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌B. subtilis、熒光假單胞菌P.fl uorescens和棘孢木霉菌T. asperellum不僅降低了西紅花病原菌數(shù)量和病害發(fā)生率，有效防治西紅花球莖腐爛病，還有利于延長西紅花的花期(表2)。目前，針對芽孢桿菌生物防治和促進植物生長方面已開展了系統(tǒng)的研究，部分菌株已實現(xiàn)商品化，產(chǎn)生了較大的經(jīng)濟效益[67]。

表2 已報道的西紅花生防菌Table 2 Biocontrol bacterium of C. sativus had been reported

3.2 生防菌在其他藥用植物中的挖掘與驗證

生防菌作為化學(xué)農(nóng)藥的良好替代品，可改善環(huán)境污染、降低農(nóng)藥殘留，藥用植物生防菌的挖掘與驗證也是科學(xué)研究的熱點。ANISHA等[68]從生姜Zingiber officinale中分離到1株頂孢屬真菌Acremoniumsp.，具有良好的抑菌活性；進一步研究發(fā)現(xiàn)：該菌可產(chǎn)生膠霉毒素(gliotoxin)，對病原菌具有較強的拮抗作用，表明該菌具有生物防治潛力。HAN等[69]從人參根際土壤中分離到1株具有較高抗菌活性的紫色色桿菌Chromobacteriumsp. JH7菌株，該菌能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、蛋白酶等抗菌分子，為開發(fā)人參生物防治劑提供了理論依據(jù)。姜云等[70]研究發(fā)現(xiàn)：施用生防菌株FG14可濕性粉劑能有效防治人參銹腐病，效率高達68.69%。將三菌合劑“寧盾”施用于浙貝母Fritillaria thunbergii根腐病地塊，發(fā)現(xiàn)其對植株有顯著促生長、防病作用[71](表3)。綜上所述，生防菌對藥用植物的綠色高效種植、提升品質(zhì)具有重要作用和廣闊的應(yīng)用前景。

表3 生防菌在其他藥用植物的挖掘與驗證Table 3 The excavation and verification of biocontrol bacteria in other traditional Chinese medicine plants

4 展望

西紅花優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源匱乏，土地連作障礙，有效的殺菌劑或生物農(nóng)藥匱乏，眾多不利因素導(dǎo)致球莖腐爛病日益嚴重，品質(zhì)和產(chǎn)量難以保障[15]。要解決這些困擾產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心問題，可從以下方面集中科研攻關(guān)。一是基于現(xiàn)代宏基因組測序技術(shù)挖掘西紅花球莖腐爛致病菌、生防菌。獲得不同菌株并進行功能驗證，分析西紅花球莖腐爛病與根際土壤微生物群落的關(guān)系，為殺菌劑或生物農(nóng)藥的開發(fā)提供理論依據(jù)[76-77]。如已有研究[76]通過對人參銹腐病的根際土壤、感病人參根部分別進行宏基因組測序，比較土壤微生物群落和感病人參根部微生物群落差異，分析土壤中金屬元素等與銹腐病發(fā)生的相關(guān)性，系統(tǒng)挖掘人參銹腐病的潛在致病菌，探明了連作土壤中金屬離子失衡是人參銹腐病的潛在連作障礙誘因。二是基于合成生物學(xué)和發(fā)酵工程原理，將中藥活性物質(zhì)代謝合成的催化酶基因在大腸埃希菌Escherichia coli、酵母、煙草Nicotiana tabacum等模式原核和真核物種中進行基因表達重構(gòu)，以實現(xiàn)藥效物質(zhì)的異源高效生物合成，從而解決目前優(yōu)質(zhì)中藥藥源緊缺、藥效物質(zhì)不穩(wěn)定等問題。目前托品烷生物堿-莨菪堿(hyoscyamine)、青蒿素(artemisinin)等藥用活性物質(zhì)已實現(xiàn)基于合成生物學(xué)技術(shù)方法的異源生物全合成[78-80]。因此，從分子水平解析西紅花苷、西紅花酸等主要活性成分代謝合成的催化酶基因或調(diào)控基因，能為優(yōu)質(zhì)西紅花轉(zhuǎn)基因新品種的培育以及基于合成生物學(xué)技術(shù)手段的西紅花主要活性成分的異源生物合成提供理論和應(yīng)用依據(jù)[81-82]。三是脫毒中藥種苗的規(guī)?；瘧?yīng)用可有效緩解中藥植物連作引起的病蟲害頻發(fā)的生產(chǎn)問題。目前，滁菊Chrysanthemum morifolium[83]、半夏Pinellia ternata[84]、懷地黃Rehmannia glutinosa[85]等中藥材脫毒種苗在生產(chǎn)上的規(guī)模化應(yīng)用有效扭轉(zhuǎn)了土地連作引起的病蟲害頻發(fā)、嚴重影響生產(chǎn)效能的不利局面。西紅花植株病害嚴重，創(chuàng)制西紅花脫毒新種質(zhì)，能為生產(chǎn)上提供可靠的優(yōu)質(zhì)西紅花種源，提高生產(chǎn)效益[86-89]。